Исследования бактериальных геномов на платформе Иллюмина.Новые приложения.
•
0 likes•383 views
Ломоносов Андрей 2011
Recommended
More Related Content
What's hot
What's hot (20)
Viewers also liked
Viewers also liked (20)
Similar to Исследования бактериальных геномов на платформе Иллюмина.Новые приложения.
Similar to Исследования бактериальных геномов на платформе Иллюмина.Новые приложения. (20)
Исследования бактериальных геномов на платформе Иллюмина.Новые приложения.
- 1. Исследования бактериальных геномов на платформе Иллюмина. Новые приложения. Ломоносов Андрей 2011
- 2. Метагеномика Мета - анализ: Статистическая комбинация отдельных исследований Геномика: Полный анализ генетического материала организма Метагеномика - изучение геномного материала, полученного напрямую из окружающей среды, без шага предварительного культивирования. • Размеры геномов: Mycobacterium tuberculosis – 4,4 млн. п.о. , Epstein- Barr virus – 172, 2 тыс. п.о. • Производительность NGS систем – от 10 млн. до 600 млрд п.о. т.е. от 1 до тысяч геномов микроорганизмов Пользуясь информацией, полученной за один запуск прибора, можно: • Идентифицировать полный микробиологический состав, в т.ч. некультивируемые штаммы, включая сборку геномов “de novo” • Обнаружить и идентифицировать генетические факторы патогенности • Составить карты метаболизма идентифицированных микроорганизмов (требует глубокого биоинформатического анализа и доступа к базам данных)
- 3. Практическая задача: Идентификация микроорганизмов и факторов их патогенности Требования: • Чувствительно – обнаружить возбудитель, если он есть в пробе, даже если нет специфической тест- системы • Наиболее полно идентифицировать все возможные возбудители и их варианты, в том числе неизвестные, с их геномным портретом, факторами патогенности, резистентности и т.п. • Быстро – получить ответ от 10 часов до 1-2 дней КАК? - Применяя системы полногеномного секвенирования (NGS)
- 4. Примеры
- 5. Метагеномика Metagenomic study of the oral microbiota by Illumina high-throughput sequencing. Metagenome 90% Genome 10% Deep sequencing analysis of viruses infecting grapevines: Virome of a vineyard.
- 6. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing Nature (2010), Vol 464|4 March 2010| doi:10.1038/nature08821 • Для выявления влияния сообщества микроорганизмов, обитающих в кишечнике человека, на состояние здоровья и качество жизни человека критически важно знать состав, разнообразие и функционирование сообщества микроорганизмов в кишечнике • Метагеномное исследование включало секвенирование, сборку и описание 3,3 млн генов микроорганизмов из фекальных образцов (576.7 Гб данных, 124 человека европейца) • И … 69.5% полученных контигов не отражали данные, полученные в предыдущих исследованиях - новые данные
- 8. M Hess et al. Science 2011;331:463-467 Хирургически имплантированная фистула (показана стрелкой), с помощью которой был исследован процесс деградации опилок в кишечнике коровы
- 9. Полногеномный анализ единичной бактериальной клетки • Prochlorococcus – Полногеномная амплификация • Покрытие 99.6% при сборке генома с использованием референсной последовательности, и 95% при сборке генома de novo из единичной клетки!.
- 10. • Модельное исследование – искали микроорганизм, последовательность НК которого неизвестна • Подход – глубокое секвенирование на платформе Illumina • Материал – соскобы носовых пазух • Показано, что такой подход позволяет идентифицировать новые типы или подтипы микроорганизмов – в данном случае вируса ‐ на основе гомологии с известными последовательностями
- 11. Результат: • Получены данные о вирусном и микробиологическом составе образцов • Удалось идентифицировать вирус H1N1 при низких титрах (до 18 копий/мл, RT- PCR – 17 копий/мл) • Собран геном вируса de novo на основе полученных данных • Идентифицированы SNP в последовательностях H1N1 • Определен характер и степень иммунного ответа Greninger et al, PLOS 2010
- 12. • Однократная миграция микроорганизма от человека к домашней птице произошла около 38 лет назад, субтип клональной линии ST5 уникальный для Польши • Усиление генетического разнообразия, благодаря получению новых мобильных генетических элементов от специфического для птицы пула генов и инактивации ряда белков, значимых для патогенеза у человека • В результате – усиленное сопротивляемость к действию гетерофилов птицы, что отражает адаптацию микроорганизма к носителю.
- 13. Это хорошо, но … • Полногеномный сиквенс очень дорог! • Ситуация быстро меняется – стоимость приборов и реагентов для полногеномного секвенирования (NGS) стремительно снижается. • Если даже стоимость запуска низка, длина чтений также низка • Иллюмина предлагает технологию парноконцевых чтений
- 14. Сколько стоит NGS? Изменение цены сиквенса полного генома человека как универсального ценового индикатора $10,000,000 $1,000,000 $100,000 $10,000 $1,000 2007 1G 2007 GA 2008 GAII 2009 GAIIx 2010 HiSeq 100-кратное уменьшение стоимости за 3 года! 2011 HiSeq
- 16. Встречайте! MiSeq 52.3 cm 12 cm
- 17. Эволюция приборов NGS на примере платформы Illumina Все технологические этапы работы с пробами объединены в одном приборе Генерация кластеров Флюидика для парно—концевых чтений Первичный и вторичный компьютерный анализ По цене обычного секвенатора по Сенгеру
- 18. MiSeq Удобное решение для любой лаборатории УДОБНОЕ, ДЕШЕВОЕ И ПРОИЗВОДИТЕЛЛЬНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ АМПЛИКОНОВ СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОМОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И МЕТАГЕНОМОВ БЫСТРЫЙ И КАЧЕСТВЕННЫЙ СКРИНИНГ Инфекционных болезней Качества лекарственных препаратов Контроля лечения Проверка клонов Целевое секвенирование участков генома Тканевое типирование ВСЕ МЕТОДИКИ NGS В ОДНОМ ИНСТРУМЕНТЕ КОНТРОЛЬ ЭКСПРЕССИИ И ГЕННОЙ РЕГУЛЯЦИИ
- 19. MiSeq – Подготовка, Запуск, Анализ 08:00:00 MiSeq – единственная система, дающая результат от образца до собранной последовательности за 8 часов Ампликоны Образец gDNA *1x36bp run – 3 hr sequencing
- 20. MiSeq Характеристики и производительность Производительность оптимальна для работы с небольшими геномами (может сделать полный сиквенс нескольких бактериальных геномов de novo, достаточен для метогеномных исследований) Самый простой из существующих на рынке методов пробоподготовки для систем полногеномного секвенирования Наиболее проверенная по качеству и надежности данных технология на данный момент «Все в одной коробке», включая биоинформатику
- 21. Это хорошо, но … • Полногеномный сиквенс очень дорог! • Ситуация быстро меняется – стоимость приборов и реагентов для полногеномного секвенирования (NGS) стремительно снижается. • Если даже стоимость запуска низка, длина чтений также низка • Иллюмина предлагает технологию парноконцевых чтений
- 23. 25 Секвенирование при помощи парноконцевых чтений Считывание последовательности До 150 п.о. с каждого конца Собранная последовательность Неизвестная последовательность
- 24. Длина прочтения в метагеномике Для метагеномных исследований желательна большая длина прочтения (более 100 п.о. ) с высоким качеством. Цена запуска NGS прибора, дающего большую длину прочтения, обычно весьма велика Выход – использование парноконцевых чтений
- 25. Новый прибор MiSeq – что может? 52.3 cm 12 cm
- 27. Анализ 16s РНК Секвенировали регион v4 16s РНК на платформе MiSeq Длина прочтения – 254 п.о. (2х150 с перекрытием) 24 образца за один запуск Более 1 Гб данных