荡黔
- 1. I
CS 5. 0
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荡黔
B 46
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中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB T 9 4 - 2 0
/ 15 0 0 4
饲 料 中玉米赤 霉烯 酮 的测定
D e e m i ton z ar l no
t r na i of e a e ne f e
i e ds
n
20-61 发 布
0 40-0 2 0 -00 实 施
0 4 1- 1
中华人民共和国国 家质量监督检验检疫总局 发 布
中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会
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GB T 5 0 2 0
/ 1 4- 04
9
I
N 舌
本标 准参考
国内外有关标 准 、
文献 ,
经研究 、
改进 和验证后制 定。本标准 非等 效于 A AC 美 国公
O (
职分析化学家协会)98年最后通过的玉米 中玉米赤霉烯 酮的薄层 色谱法和 19 年 首次通过的玉 米、
18 94
大麦、
饲料 中玉米赤 霉烯酮的酶联免疫吸 附测定 法。其 中薄层色谱测定方法为仲裁方法 ,酶联免疫吸附
测定方法为快速筛选方法 。
本标准 由全
国饲料工业标 准化技术委员会提出
本标准 由全
国饲料工业 标准化技术委员会归 口。
本标 准由江苏省微生 物研究所负责起草。
本标准主要起草人 :
毖晓黎 、
丁贵平 、 东、
李利 袁建兴 、
成恒篙.
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GB/ 15 0 2 0
T 4 - 0 4
9
饲料中玉米赤霉烯酮的测定
范围
本标准规定了玉米赤霉烯酮 (erl oe 以下简称 Z N 的薄层 色谱测定方法 和酶联免疫 吸附测
zaa nn ,
e E )
定法 。
本标准适
用于配合饲料和饲用谷物原料 中 Z N 的测定 。
E
薄层色谱
测定方法的最低检测量为 2 n , 免疫吸附测定方法的最低检测量 为 。2 n ,
0 酶联
g . g
5
2 规范性引用文件
下列文件
中的条 款通 过本标准的引用而成为本标 准的条款 。凡 是注 日期 的引用文件 , 随后所 有
其
的修改单 (
不包括勘误的 内容)或修订版均不适用于本标准 ,然而 , 根据本标 准达成协议的各方研究
鼓励
是否可使用这些文件 的最新 版本 凡是不注 日期的引用文件 ,
其最新版本适用于本标准 。
G/ 6 2
8 分析实验室用水规格和试验方法
B T 6
GB T 6 9 1
4 9 . 怕 料 果 样 古 洛
/ 1
薄 层 色谱 法 ( 裁 法 )
仲
3 1 原理
.
试 样中 Z N
E 用三氯 甲烷提取 ,
提取液经液一
液萃取 、
浓缩 ,
然后进行 薄层色谱分 离,
限量定 量,
或用
薄层 扫描仪测 定荧光斑点的吸收值 ,
外标法定量 。
32 试剂与材料
.
所用试剂除另 有规定,
均使用分析 纯试剂 水符合 GB T 8 中一级水的规定 。
/ 6 2
6
32 1 三氯甲烷。
..
322 0 L氢 氧化 钠溶液 :
. 4 g
. / 称取 4g 氧化钠,
氢 加水适量溶解 , 稀释至 10 。
用水 0 m工
32 3 磷 酸溶 液(+1)
.. ( 0.
1
32 4 磷酸溶 液(+1)
.. 1 9。
325 无水硫 酸钠:5℃灼烧 4h冷却后贮于干燥器 中备用 。
.. 60 ,
3 2 6 展 开 剂 : 氛 甲烷 一 酮一 一 酸 (8 2 + 功 。
.. 三 丙 苯 乙 1 + +8
327 显色剂 :0
.. 2 g抓化铝( I1 6 0 溶于 10
AC,・ H2 ) 0 mL乙醇 中
32 8 薄 层板 :
.. 称取 4g硅胶 G,
置于乳钵 中加 1 m 05 放甲基纤维素钠水溶液研磨 至糊状 。立即
0 .
L
倒 人薄层板涂布器 内制备成 1 c
0
mX2 c 厚度 。3
0
m、 . mm的薄层板 ,
在空气 中干燥 后 ,
用甲醇预展 薄层
板 至前沿 ,吹干,
标记方 向, 15 -10
在 00 1 ℃活化 1h 置于干燥 器内保存备用 。
C ,
329 E
.. Z N标准储备溶液
普告:
工 凡接触 E
Z N 的容器,需浸人 4%次 氯酸钠( a C)
NO I 溶液 ,
半天后清洗备用 。
2 为 了安全 ,
分析人员操作时要带上 医用乳 胶手套。
称取适量的 E
Z N标准品 , 甲醇配制 成约 10 / L N标 准储 备溶 液。避光 ,
用 0 p m Z
g E 于一 5 以下
℃
储存 。
标定储 备液的浓度 , 1
用 cm石英 比色杯 ,
以甲醇为 参比 , Z N的最 大吸收峰 波长 34m 处 ,
在 E 1n 测
定吸光度值 A。储备液 中 Z N的含量( )
E X,以微克 每毫升( p / )
( gmL 表示 ,
1 按式() 算。
1计
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GB/ 1 5 0 2 0
T 4 - 0 4
9
A X M X 0
10
X, ........
......・ ..・
・. . (1)
一
£ S
X
式中 :
A- 测定的吸光度值 ;
M- Z
N的摩尔质量 (
E M=38 mo)
1 g l;
/
e Z N在
甲醇 中的分 子吸收系数 (=60 / o
- E e 0 m m D;
'
S
— 比色杯的光径 长度 , 单位为厘米 (m)
c ,
32 1 Z N 标准工作溶液 :
..0 E 根据计算的标准储 备液的浓 度, 密吸取标 准储备 液(. .)
精 329 适量 ,
用三
氯 甲烷 稀释成浓度为 2 p / L的标准工作溶 液
0 m
g
33 仪器 与设备
.
3 31 小 型粉碎机
..
332 电动振荡器 。
..
333 薄层板涂布器 。
..
334 玻璃器皿:
.. 分液漏斗、
漏斗。所有玻璃器皿均用稀盐酸浸泡,
依次用自来水、
蒸馏水冲洗。
3 35 旋转蒸发器 :
.. 配有 20
0 ml心形瓶。
336 慢速滤纸 。
..
3 37 展开槽 ;5 m X10 X5 mm(
.. 20 m 5 mm 0 立式 ,
具磨 口)。
338 点样 器: l -9 k .
.. 1
cL 9 L
339 紫外 光灯 :
.. 波长 24 3 5
5 n 6n
m, ,
33 1 薄层 色谱扫描仪 :
..0 配有汞 灯光源
34 试样制备
.
按 G / 49.
1691
B T 饲料采样方法取得试样 ,
四分法 浓缩减取 约 20 经粉碎 ,
0 g, 混匀 ,
装人磨 口瓶中
备 用。
35 分析步骤
.
3 5 1 试 样 处理
..
称取约 2 试样 (.)精确至 00 g ,
g
0 34( . )置于具 塞锥形瓶中 ,
1 加人 8
mL水和 10
0 mL三氯 甲烷 ,
盖
紧瓶塞 ,在振荡器上振荡 1h加入 1 无水硫酸钠 ,
, 0g 混匀 , 滤,
过 量取 5 m
0 L滤液于分液漏斗 中, 沿管壁
慢 慢地加人氢氧化钠溶液 (. ) mL 并轻轻转动 1 n 静置使 分层 ,
3221
. 0 , mi, 将三抓 甲烷 相转移 至第二个
分液漏斗 中,
用氢氧化钠溶液(..)0 , 复提取 1 ,
3221 mL重 次 并轻轻 转动 1 n 弃去三 氯甲烷层 , 氧
m ,
i 氢
化钠溶液层并人原分液漏斗 中,
用少量蒸馏水淋洗第二个分液漏斗 , 洗液倒人原分液漏斗 中, 再用 5
mL
三氯甲烷重复洗 2 ,
次 弃去三氯甲烷层。向氢氧化钠 溶液层 中加 人 6 ML磷 酸溶液 (.. ) ,
32 3后 再用 磷
酸溶液(..)
324调节 pH值 至 95
. ,
左右 于分液漏斗 中加人 1 m
5 l三氯甲烷 , 摇,
振 将三氯 甲烷层 经盛有
约 5g无水硫 酸钠 的慢速滤纸的漏 斗中,
滤于浓缩 瓶中, 用 1 mL三氯 甲烷重复提取 2次,
再 5 三氯 甲烷
层一并滤于浓缩瓶中,
最后用少量三氯甲烷淋洗滤器,
洗液全部并于浓缩瓶中,
真空浓缩至小体积,
将其
全量转移至具塞试管 中,
在氮气流下蒸发 至干, ZmL三氯 甲烷溶解残渣 。摇匀 ,
用 供薄层色谱点样用 。
352 点样
..
在距薄层板下端 15
. m-2 的基 线上, 1 的间距 ,
c c
m 以 cm 用点样 器依次点标准工作溶液(..0
( 21)
3
25 5 1 p ,0 (
.p L, p 0 2 p 相当于 5 n ,0 n ,0 n ,0 n )
L, L 1 0 10 20 40 和试样液 (.. 0 ,
g g g g 3512 p
) L
353 展开
..
将薄层板放人有展开剂 (. )
326 的展开槽 中,
. 展至离原点 1 c - 5 处 , 出 , 。
3 - c
m-1 m 取 吹干
354 观察与确证
..
将 展开后的薄层板置于波 长 24
5 nm紫外光灯下 ,观察与 Z N 5 n)
E (0 标准点 比移值相 同处 的试样
g
的蓝绿 色荧光点。若相 同位 置上未 出现荧 光点 , 试样 中 的 Z N 含量在 本测 定方 法 的最低 检 测量
则 E
2
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5 0 /g
0 F k以下 。如果相 同位 置上 出现荧 光点 , 显色剂 (. ) 准各 荧光点 进 行喷雾 ,3℃加 热
ag 用 3 2 7
. 对 10
5 n然后在 35 紫外 光灯下 ,
mi, 6nm 观察荧 光点 由蓝绿色变为蓝紫色 , 光强度 明显加强 ,
且荧 可确证试样
中含有 Z N。于荧光点下方用铅笔标记 ,
E 待扫描定量测定 。
355 定,测定
..
355 1 薄层扫描 工作条 件
...
光源 :
汞灯 。
高压
激 发波长 33
:1 n 发射波长 :0 n
m; 40 m,
检测方式 反射
: 。
狭缝 :
可根据斑点 大小进 行调节。
扫描方式 距齿扫描 。
:
3 5 5 2 标 准 曲线 绘 制
...
以 Z N标准工作溶液质量 (g为横坐标 ,
E n) 以峰面积积分值为纵坐标 ,
绘制标准 曲线 。
36 结果计算和表述
.
根据试样
液荧光斑 点峰面积积分值从标准 曲线上查出对应 的 Z N 质量(g , 样 中 Z N的含量
E n)试 E
( 以微克每千克(g k )
X) p / g表示 , ()
按 2式计算 。
X二m X
, 上 ... .… … ,・ ・・一 (2)
.... .・・ ・
。・
o X
no V
式中 :
V— 试样液(..
, ( 51最后定容体积 ,
3 ) 单位为微升 (L ;
p)
V— 试样液点样体积 ,
z 单位为微升( L ;
p)
m— 从标准曲线上查得试样液点上对
, 应的 ZN质量,
E 单位为纳克(g;
n)
mo 最后提取液相 当试样 的质 量,
— 单位为克 ()
9。
计算 结果表示到小数点后 一位有 效数字。
37 重 复性
.
在重 复性条件下获得的两 次独立 测试结果的相对差值不大于 10,
00
4 酶联免疫吸 附测定 法(
快速筛选 法)
4 1 原理
.
方法 的检测依据是抗 原一 反应 。将 Z N抗体 的羊抗体吸 附在固相载 体表面 ,
抗体 E 加人 Z N抗 体、
E
酶标 Z N结合物 、E
E Z N标准或试样液 , Z N抗体 与固相 载体 表面羊抗 体结合 的同时 ,
在 E 游离 的 Z N,
E
酶标 Z N结合物与结合在 固体 表面的 Z N抗体竞争 ,
E E 未结合 的酶标 Z N结合物洗 涤除去。加人酶底
E
物,
在结合酶的催化作用 下,
无色底物 降解 产生蓝色物质 。加入终止剂后颜色转变 为黄色。通过酶标检
测仪 , 40 波长处测吸收值 。吸光强度 与试样 中 Z N 的浓度成 反比 。
在 5nm E
酶联免疫
吸附测定法具有操作简单 , 快速灵敏 , 果可靠 的特点 。目前 有专 门测 定 Z N的酶 联免
结 E
疫检测试剂盒 的商品。在分析 时适 当参考操作说 明书 。
42 试剂与材料
.
42 1 包被抗体 的聚苯乙烯微 量反应板 2 孔或 4
.. 4 8孔。
422 写
.. 0 的甲
7 醇溶液
423 标准品溶液 :
.. 精密吸取标定后的标准储备液(.. ( 2 9 , 甲醇溶液(..
3 ) 适量 用 ( 2 2配制成 Z N 标准
4 ) E
品溶液 1 ,
-5浓度分别为 0 / , p / ,5 / ,5 / ,3 1 /
p L 5 L 1 p L 4 p L 15 L.
g g g g ,g
42 4 酶标抗原溶液 :E 与辣根过氧化 酶结 合物。
.. ZN
42 5 抗 体溶液 : Z N抗体 。
.. 抗 E
42 6 柠 檬 酸 缓 冲 溶 液 [ ( ,, 0 ) . o/ , =4 0 : 取 1. 1 柠 檬 酸钠
.. c NaCH; , =0 1 lL p
; m H . ] 称 0 17 g
4
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( aC H, ・ H 0)1. 2
N , 0 2 2 ,374 柠檬 酸( , ・ O)
, , 6 g C H, HB 加水溶解 至 1
O, L,
427 底物溶液 甲: 甲基联苯胺 ,
.. 四 用柠檬酸缓 冲溶液 (. .)
426配成浓度为 04 L
. / ,
g
428 底物溶液 乙: 15 3 %过氧化氢 , 柠檬 酸缓 冲溶液(..) 释至 1
.. 取 .
mL 0 用 ( 26稀
4 L,
429 底物溶液 :
.. 底物溶液 甲与底物 溶液乙 1 1的混 合液。
:
42 1 终止液 : 酸溶 液(+1)
..0 硫 1 7,
43 仪器与设备
.
43 1 酶标检测仪 : 40
.. 带 5 nm波长 。
432 小型粉碎机 。
..
43 3 0 ,0 K , 00
.. 5 t 10 1 t
L L 0 L微量移液器 。
4 34 电动振 荡器。
..
4 35 玻璃 器皿 :0
.. 5 mL锥形瓶 、 斗、
漏 量筒。
4 36 快速滤纸 。
..
44 试样 制备
.
同 34
.
,
45 分析步骤
.
45 1 试样处理
..
称取约 5
g试样(.)精确 至 00 g ,
44 ( .1 置于 5 m
) 0 L具塞锥形瓶中 ,
加人 2 mL甲醇溶液(..)
5 422 ,
密塞。振荡器提取 1 mie提取 液通过快 速滤纸过 滤。取 10
0 n . mL滤液 , 1.
加 9 0
mL蒸 馏水稀释 ,
摇
匀,为试样液。
452 分析前注惫事项
..
分析前将
所有试剂平衡 至室温 ;
分析后 立 即将 所有试 剂放 回 2 ^8
0 -℃冰箱 ;
C 在所 有培育 中 ,
避光 ,
盖上微孔板 盖。
453 定位
..
根据需要
设定限量法(
见表 1和定量法(
) 见表 2 。取 足够数量的微孔 置微孔架 上,
) 标准 品和试样做
两个平等实验 ,
记录标准 品孔 和试样孔 的位置 。限量 法时 控制标 准品孔 号中 的浓度 为限量值/稀释 因
子 , 过调节稀释因子使之浓度 在 。 3 p /
并通 ^15 L范围 内。
g
表 1 限 f 法微 孔 定 位
孔 号
I 2 3 4 5 6 7 习 9 10 11 12
标 准品溶液 1 标准品溶 液 2
待测试样液
( p/ )
gL
0 ( p /
g L)
5
表 2 定t法微孔定位
孔
号
一 : I 6 一: 10 【 11 一 12
标准品溶液 I一5
待 测 试样 液
pg L
/
} pL}5 }5 !5
5 1pL 4V, 1pL
g/ g
/ g一3g
/ /
4.5.4 加试荆
在每孔中依次加人试剂 :
加人 5 p
0 准溶液(..)
L标 ( 2 3或试样液(..
4 ( 51至相 应微孔 中;
4 ) 加人 5 p
0 L
酶标 结合 物(..)
( 24 到每个微孔 中; 加人 5 p Z N抗体(. )
4 再 0 E
L ( 25到每个微 孔中
4 .
455 反应
..
将 酶标 板轻轻摇晃 ,
使孔中的试剂摇匀 ,
置温度 10^3℃培育反应 1 mi.
8 -
C 0 0 n
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9
456 洗涤
..
将微孔 中液体倾倒到水池 内,
倒置微孔 支架 ,
在干净纸 巾上 轻拍 ,
除去所有残 留的液体 ,
用移液器加
蒸馏水 20
5WL到每个微孔 中, ,
洗板 放置 2 n再 排空液体,
mi, 重复洗涤 3次。
457 显色
..
加 10
0IL底物 溶液(..)
( 29 到每孔 中,
4 充分摇匀 , 10
置 8C一3℃恒温箱中 ,
0 反应 5 n
mie
458 终止
..
加 10
0 kL终止液 (.. 到每孔 中, 匀
42 1)
0 摇
459 测定
..
在 40
处 ,
5n 以空气为空 白调零 ,
测定吸收值 。在 6 mi
0 n内读数 。
46 结果计算和表述
.
4 6 1 限f 法
. .
若试样孔
的吸收值小于标准品孔的吸收值 , Aj ? m 超过 限量值 , 阳性 。若 试样孔的吸
即 e <Ag },
*
j 为
收值大于或等于标准孔的吸收值, 试孔 A 准 ,
即A 祥 ) 标孔则小于或等于所设限量值, 性。
为阴
限量值为标准值 (gL 乘 以稀释 因子。按 451操作 ,
Y/) .
. 稀释因子为 10 若控制标准值 为 5 /
0, K L
g
时,
试样 中 Z N的限量在 50 /g
E 0 K k.
g
462 定f法
..
百分 吸收值 所得
: 的标 准或试样的吸收值除以第一个标 准( 标准 )
0 的吸 收值 再乘以 10 作为百分
0,
吸收值 A%,
按式 ()
3计算 。
A
,__
八 / =
c 二一 入 1VV . , . . .・ ・・… … (3)
. ・ ・ .. ・ ・
. . .・ . ・
了 。
1
式 中:
A— 标准品或试样 的吸收值 ;
A。 空白的吸收值 。
—
标准曲线的绘制:
所计算的百分吸收值对应 Z N浓度(gL 的
E K/) 半对数坐标作标准曲线图, 线在
曲
5 L 3 K/ 范围内
I/-15 L
sg g 应当成线性。根据试样的百分吸收值, 通过标准曲线,查得相对应浓度。试
样中Z N的
E 含量( )
X 以微克每千克(gk)
l/g表示,
e 按式()
4计算。
X二c V n
XX . .・ ・ 一 ( )
一... ・. 4
.,
式 中:
c 从标准曲线上查得相对应试样提取液( 51中 ZN浓度,
— ( .) E
4. 单位为微克每升(gL ;
t/)
A
V
提取液(..)
试样 ( 5 1体积 ,
4 单位为毫升 ( L ;
m )
n 试样稀 释倍 数 ;
—
m
试样质量,
— 单位为克()
9。
计算 结果
表示到小数点后一位有效数字 。
47 宜复性
.
在重复性条件下获得 的两 次独立测试结果 的相对差值不 大于 巧%。
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