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I
CS 5. 0
    6 12   zycnzj.com/ www.zycnzj.com

                                              荡黔
B 46
                                      泊星石 www.bxsdl.com




中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
                                                GB T 9 4 - 2 0
                                                  / 15 0 0 4




            饲 料 中玉米赤 霉烯 酮 的测定
                  D e e m i ton  z ar l no
                     t r na i of  e a e ne  f e
                                           i e ds
                                            n 




20-61 发 布
0 40-0                                              2 0 -00 实 施
                                                     0 4 1- 1


           中华人民共和国国      家质量监督检验检疫总局                发 布
           中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会
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                                              GB T  5 0 2 0
                                                / 1 4- 04
                                                   9




                      I
                      N     舌



  本标 准参考
       国内外有关标 准 、
                文献 ,
                   经研究 、
                       改进 和验证后制 定。本标准 非等 效于 A AC 美 国公
                                             O (
职分析化学家协会)98年最后通过的玉米 中玉米赤霉烯 酮的薄层 色谱法和 19 年 首次通过的玉 米、
          18                          94
大麦、
  饲料 中玉米赤 霉烯酮的酶联免疫吸 附测定 法。其 中薄层色谱测定方法为仲裁方法 ,酶联免疫吸附
测定方法为快速筛选方法 。
  本标准 由全
       国饲料工业标 准化技术委员会提出
  本标准 由全
       国饲料工业 标准化技术委员会归 口。
  本标 准由江苏省微生 物研究所负责起草。
      
  本标准主要起草人 :
           毖晓黎 、
               丁贵平 、 东、
                   李利 袁建兴 、
                          成恒篙.




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                                                           T  4 - 0 4
                                                             9




                     饲料中玉米赤霉烯酮的测定


   范围

   本标准规定了玉米赤霉烯酮 (erl oe 以下简称 Z N 的薄层 色谱测定方法 和酶联免疫 吸附测
                 zaa nn ,
                    e         E )
定法 。
   本标准适
       用于配合饲料和饲用谷物原料 中 Z N 的测定 。
                        E
   薄层色谱
       测定方法的最低检测量为 2 n , 免疫吸附测定方法的最低检测量 为 。2 n ,
                   0  酶联
                      g                    .  g
                                            5 

2 规范性引用文件

   下列文件
        中的条 款通 过本标准的引用而成为本标 准的条款 。凡 是注 日期 的引用文件 , 随后所 有
                                                其
的修改单 (
     不包括勘误的 内容)或修订版均不适用于本标准 ,然而 , 根据本标 准达成协议的各方研究
                                鼓励
是否可使用这些文件 的最新 版本 凡是不注 日期的引用文件 ,
                              其最新版本适用于本标准 。
   G/ 6 2
       8 分析实验室用水规格和试验方法
    B T 6
   GB T  6 9 1
       4 9 .  怕 料 果 样 古 洛
     / 1

  薄 层 色谱 法 ( 裁 法 )
            仲

3 1 原理
 .
   试 样中 Z N
       E 用三氯 甲烷提取 ,
                  提取液经液一
                       液萃取 、
                           浓缩 ,
                              然后进行 薄层色谱分 离,
                                          限量定 量,
                                               或用
薄层 扫描仪测 定荧光斑点的吸收值 ,
                  外标法定量 。
32 试剂与材料
 .
  所用试剂除另 有规定,
            均使用分析 纯试剂           水符合 GB T 8 中一级水的规定 。
                                      / 6 2
                                        6
32 1 三氯甲烷。
..
322 0 L氢 氧化 钠溶液 :
.  4 g
 .    /         称取 4g 氧化钠,
                     氢   加水适量溶解 , 稀释至 10  。
                                用水     0 m工
32 3 磷 酸溶 液(+1)
 ..        ( 0.
           1
32 4 磷酸溶 液(+1)
 ..        1 9。
325 无水硫 酸钠:5℃灼烧 4h冷却后贮于干燥器 中备用 。
 ..       60      ,
3 2 6 展 开 剂 : 氛 甲烷 一 酮一 一 酸 (8 2 + 功 。
 ..          三      丙  苯 乙   1 + +8
327 显色剂 :0 
 ..      2 g抓化铝( I1 6 0 溶于 10 
                AC,・ H2 )   0 mL乙醇 中
32 8 薄 层板 :
 ..       称取 4g硅胶 G,
                   置于乳钵 中加 1 m 05 放甲基纤维素钠水溶液研磨 至糊状 。立即
                           0  . 
                              L 
倒 人薄层板涂布器 内制备成 1 c
                0 
                 mX2 c 厚度 。3 
                    0 
                     m、   . mm的薄层板 ,
                                   在空气 中干燥 后 ,
                                             用甲醇预展 薄层
板 至前沿 ,吹干,
         标记方 向, 15 -10
              在 00 1 ℃活化 1h 置于干燥 器内保存备用 。
                  C        ,
329  E
 ..  Z N标准储备溶液
   普告:
       
   工 凡接触 E
        Z N 的容器,需浸人 4%次 氯酸钠( a C)
                           NO I 溶液 ,
                                   半天后清洗备用 。
   2 为 了安全 ,
           分析人员操作时要带上 医用乳 胶手套。
   称取适量的 E
        Z N标准品 , 甲醇配制 成约 10 / L  N标 准储 备溶 液。避光 ,
               用          0 p m Z
                            g    E              于一 5 以下
                                                   ℃
储存 。
  标定储 备液的浓度 , 1 
            用 cm石英 比色杯 ,
                       以甲醇为 参比 , Z N的最 大吸收峰 波长 34m 处 ,
                               在 E              1n   测
定吸光度值 A。储备液 中 Z N的含量( )
               E    X,以微克 每毫升( p / )
                             ( gmL 表示 ,
                             1        按式() 算。
                                         1计

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GB/ 1 5 0 2 0
   T  4 - 0 4
     9


                               A X M X  0
                                      10
                          X,                     ........
                                                  ......・   ..・
                                                            ・.    . (1)
                                                                  一
                                  £ S
                                   X
     式中 :
         
     A- 测定的吸光度值 ;
         
     M- Z
          N的摩尔质量 (
         E        M=38 mo)
                     1 g l;
                        /
      e Z N在
            甲醇 中的分 子吸收系数 (=60 / o
      -  E                e 0 m m D;
                               '
   S
         
    — 比色杯的光径 长度 , 单位为厘米 (m)
                         c ,
32 1  Z N 标准工作溶液 :
 ..0  E          根据计算的标准储 备液的浓 度, 密吸取标 准储备 液(. .)
                                精            329 适量 ,
                                                    用三
氯 甲烷 稀释成浓度为 2 p / L的标准工作溶 液
            0  m
               g
33 仪器 与设备
 .
3 31 小 型粉碎机
 ..
332 电动振荡器 。
 ..
333 薄层板涂布器 。
 ..
334 玻璃器皿:
 ..     分液漏斗、
            漏斗。所有玻璃器皿均用稀盐酸浸泡,
                            依次用自来水、
                                  蒸馏水冲洗。
3 35 旋转蒸发器 :
 ..        配有 20 
              0 ml心形瓶。
336 慢速滤纸 。
 ..
3 37 展开槽 ;5 m X10  X5 mm(
 ..       20 m  5 mm  0  立式 ,
                            具磨 口)。
338 点样 器: l -9 k .
 ..      1 
          cL 9  L
339 紫外 光灯 :
 ..       波长 24  3 5 
              5 n 6n
                 m, ,
33 1 薄层 色谱扫描仪 :
 ..0          配有汞 灯光源
34 试样制备
 .
   按 G / 49. 
        1691
      B T   饲料采样方法取得试样 ,
                       四分法 浓缩减取 约 20 经粉碎 ,
                                   0 g,   混匀 ,
                                             装人磨 口瓶中
备 用。
35 分析步骤
 .
3 5 1 试 样 处理
 ..
     称取约 2 试样 (.)精确至 00 g ,
          g
         0    34(     .  )置于具 塞锥形瓶中 ,
                       1            加人 8 
                                        mL水和 10 
                                             0 mL三氯 甲烷 ,
                                                       盖
紧瓶塞 ,在振荡器上振荡 1h加入 1 无水硫酸钠 ,
               ,  0g      混匀 , 滤,
                             过  量取 5 m
                                    0 L滤液于分液漏斗 中, 沿管壁
慢 慢地加人氢氧化钠溶液 (. ) mL 并轻轻转动 1 n 静置使 分层 ,
              3221
                . 0  ,      mi,       将三抓 甲烷 相转移 至第二个
分液漏斗 中,
      用氢氧化钠溶液(..)0  , 复提取 1 ,
              3221 mL重     次 并轻轻 转动 1 n 弃去三 氯甲烷层 , 氧
                                     m ,
                                      i          氢
化钠溶液层并人原分液漏斗 中,
              用少量蒸馏水淋洗第二个分液漏斗 ,  洗液倒人原分液漏斗 中, 再用 5 
                                                  mL
三氯甲烷重复洗 2 ,
         次 弃去三氯甲烷层。向氢氧化钠 溶液层 中加 人 6 ML磷 酸溶液 (.. ) ,
                                            32 3后 再用 磷
酸溶液(..)
   324调节 pH值 至 95
               .  ,
                 左右 于分液漏斗 中加人 1 m
                              5  l三氯甲烷 , 摇,
                                       振  将三氯 甲烷层 经盛有
约 5g无水硫 酸钠 的慢速滤纸的漏 斗中,
                     滤于浓缩 瓶中, 用 1 mL三氯 甲烷重复提取 2次,
                            再   5               三氯 甲烷
层一并滤于浓缩瓶中,
         最后用少量三氯甲烷淋洗滤器,
                      洗液全部并于浓缩瓶中,
                                真空浓缩至小体积,
                                        将其
全量转移至具塞试管 中,
           在氮气流下蒸发 至干, ZmL三氯 甲烷溶解残渣 。摇匀 ,
                     用                  供薄层色谱点样用 。
352 点样
 ..
   在距薄层板下端 15 
            . m-2  的基 线上, 1  的间距 ,
             c   c
                 m        以 cm      用点样 器依次点标准工作溶液(..0
                                                  ( 21)
                                                   3
25  5  1 p ,0  (
.p L, p 0  2 p 相当于 5 n ,0 n ,0 n ,0 n )
       L, L   1    0  10  20  40  和试样液 (.. 0  ,
                      g    g    g    g     3512 p
                                             )  L
353 展开
 ..
     将薄层板放人有展开剂 (. )
                326 的展开槽 中,
                  .       展至离原点 1 c - 5  处 , 出 , 。
                                 3  - c
                                  m-1 m    取   吹干
354 观察与确证
 ..
  将 展开后的薄层板置于波 长 24 
                  5 nm紫外光灯下 ,观察与 Z N 5 n)
                                   E (0  标准点 比移值相 同处 的试样
                                         g
的蓝绿 色荧光点。若相 同位 置上未 出现荧 光点 , 试样 中 的 Z N 含量在 本测 定方 法 的最低 检 测量
                          则         E
2
  
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                                                       / 1 4- 04
                                                          9


5 0 /g
 0 F k以下 。如果相 同位 置上 出现荧 光点 , 显色剂 (.  ) 准各 荧光点 进 行喷雾 ,3℃加 热
   ag                      用     3 2 7 
                                   .  对              10
5 n然后在 35  紫外 光灯下 ,
 mi,     6nm        观察荧 光点 由蓝绿色变为蓝紫色 , 光强度 明显加强 ,
                                        且荧          可确证试样
中含有 Z N。于荧光点下方用铅笔标记 ,
      E                 待扫描定量测定 。
355 定,测定
 ..
355 1 薄层扫描 工作条 件
 ...
   光源 :
        汞灯 。
      高压
   激 发波长 33 
        :1 n 发射波长 :0 n
            m;     40 m,
   检测方式 反射
        : 。
   狭缝 :
       
      可根据斑点 大小进 行调节。
   扫描方式 距齿扫描 。
        :
3 5 5 2 标 准 曲线 绘 制
 ...
  以 Z N标准工作溶液质量 (g为横坐标 ,
      
     E          n)     以峰面积积分值为纵坐标 ,
                                   绘制标准 曲线 。
36 结果计算和表述
.
  根据试样
       液荧光斑 点峰面积积分值从标准 曲线上查出对应 的 Z N 质量(g , 样 中 Z N的含量
                                  E     n)试      E
( 以微克每千克(g k )
X)       p / g表示 , ()
                 按 2式计算 。
                           X二m X
                              , 上              ... .… … ,・ ・・一 (2)
                                               ....     .・・ ・
                                                          。・
                              o X 
                                    
                              no  V

   式中 :
       
   V— 试样液(.. 
       
    ,    ( 51最后定容体积 ,
          3 )       单位为微升 (L ;
                           p)
   V— 试样液点样体积 ,
       
    z         单位为微升( L ;
                    p)
   m— 从标准曲线上查得试样液点上对
       
    ,               应的 ZN质量,
                        E  单位为纳克(g;
                                n) 
   mo 最后提取液相 当试样 的质 量,
       
    —                 单位为克 ()
                           9。
   计算 结果表示到小数点后 一位有 效数字。
       
37 重 复性
 .
   在重 复性条件下获得的两 次独立 测试结果的相对差值不大于 10,
                                 00

4 酶联免疫吸 附测定 法(
             快速筛选 法)

4 1 原理
 .
  方法 的检测依据是抗 原一 反应 。将 Z N抗体 的羊抗体吸 附在固相载 体表面 ,
               抗体       E                     加人 Z N抗 体、
                                                  E
酶标 Z N结合物 、E
    E     Z N标准或试样液 , Z N抗体 与固相 载体 表面羊抗 体结合 的同时 ,
                     在 E                        游离 的 Z N,
                                                      E
酶标 Z N结合物与结合在 固体 表面的 Z N抗体竞争 ,
    E                 E      未结合 的酶标 Z N结合物洗 涤除去。加人酶底
                                      E
物,
 在结合酶的催化作用 下,
            无色底物 降解 产生蓝色物质 。加入终止剂后颜色转变 为黄色。通过酶标检
测仪 , 40  波长处测吸收值 。吸光强度 与试样 中 Z N 的浓度成 反比 。
   在 5nm                      E
  酶联免疫
       吸附测定法具有操作简单 , 快速灵敏 , 果可靠 的特点 。目前 有专 门测 定 Z N的酶 联免
                          结                      E
疫检测试剂盒 的商品。在分析 时适 当参考操作说 明书 。
42 试剂与材料
 .
42 1 包被抗体 的聚苯乙烯微 量反应板 2 孔或 4
 ..                    4   8孔。
422  写
 .. 0 的甲
    7   醇溶液
423 标准品溶液 :
 ..       精密吸取标定后的标准储备液(..  ( 2 9  , 甲醇溶液(.. 
                             3 )  适量 用    ( 2 2配制成 Z N 标准
                                          4   )     E
品溶液 1 ,
     -5浓度分别为 0 / , p / ,5 / ,5 / ,3 1 /
              p L 5  L 1 p L 4 p L 15  L.
               g    g     g     g    ,g
42 4 酶标抗原溶液 :E 与辣根过氧化 酶结 合物。
 ..             ZN
42 5 抗 体溶液 : Z N抗体 。
 ..         抗 E
42 6 柠 檬 酸 缓 冲 溶 液 [ ( ,, 0 ) .  o/ ,  =4 0 : 取 1.  1 柠 檬 酸钠
 ..                 c NaCH; , =0 1  lL p
                         ;        m     H  . ] 称 0 17 g
                                                   4

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GB T  5 0 2 0
  / 1 4- 04
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( aC H, ・ H 0)1.  2 
 N ,  0 2 2 ,374  柠檬 酸( ,  ・ O)
    ,  ,        6 g     C H,  HB 加水溶解 至 1 
                           O,            L,
427 底物溶液 甲: 甲基联苯胺 ,
 ..          四       用柠檬酸缓 冲溶液 (. .)
                                426配成浓度为 04 L
                                           . / ,
                                            g
428 底物溶液 乙: 15  3 %过氧化氢 , 柠檬 酸缓 冲溶液(..) 释至 1 
 ..          取 . 
                mL 0       用         ( 26稀
                                     4         L,
429 底物溶液 :
 ..       底物溶液 甲与底物 溶液乙 1 1的混 合液。
                         :
42 1 终止液 : 酸溶 液(+1)
 ..0     硫     1 7,
43 仪器与设备
 .
43 1 酶标检测仪 : 40 
 ..        带 5 nm波长 。
432 小型粉碎机 。
 ..
43 3 0  ,0 K , 00 
 ..  5 t 10  1  t
        L   L 0 L微量移液器 。
4 34 电动振 荡器。
 ..
4 35 玻璃 器皿 :0 
 ..         5 mL锥形瓶 、 斗、
                    漏  量筒。
4 36 快速滤纸 。
 ..
44 试样 制备
 .
   同 34
       
      . 
       ,
45 分析步骤
 .
45 1 试样处理
 ..
   称取约 5
       g试样(.)精确 至 00 g ,
          44 (     .1  置于 5 m
                      )    0 L具塞锥形瓶中 ,
                                     加人 2 mL甲醇溶液(..)
                                        5       422 ,
密塞。振荡器提取 1 mie提取 液通过快 速滤纸过 滤。取 10 
         0 n                    . mL滤液 , 1. 
                                       加 9 0 
                                            mL蒸 馏水稀释 ,
                                                     摇
匀,为试样液。
452 分析前注惫事项
 ..
  分析前将
       所有试剂平衡 至室温 ;
                  分析后 立 即将 所有试 剂放 回 2 ^8
                                     0 -℃冰箱 ;
                                     C      在所 有培育 中 ,
                                                     避光 ,
盖上微孔板 盖。
453 定位
..
   根据需要
        设定限量法(
             见表 1和定量法(
                 )    见表 2 。取 足够数量的微孔 置微孔架 上,
                          )                 标准 品和试样做
两个平等实验 ,
       记录标准 品孔 和试样孔 的位置 。限量 法时 控制标 准品孔 号中 的浓度 为限量值/稀释 因
子 , 过调节稀释因子使之浓度 在 。 3 p /
  并通               ^15  L范围 内。
                       g
                              表 1 限 f 法微 孔 定 位
                                                                    

                                   孔       号

        I         2       3    4       5   6   7      习     9      10       11       12


 标 准品溶液 1      标准品溶 液 2
                                               待测试样液
  ( p/ )
    gL
   0            ( p /
                   g L)
                5 

                              表 2 定t法微孔定位

                                   孔
                                           号

                              一 :      I 6 一:                     10    【   11   一   12


              标准品溶液 I一5
                                                       待 测 试样 液
  pg L
    /
            } pL}5  }5  !5 
             5  1pL 4V, 1pL
              g/  g
                  / g一3g
                      /   /
4.5.4   加试荆
   在每孔中依次加人试剂 :
                加人 5 p
                    0  准溶液(..)
                      L标    ( 2 3或试样液(.. 
                             4        ( 51至相 应微孔 中;
                                      4   )       加人 5 p
                                                      0 L
酶标 结合 物(..)
       ( 24 到每个微孔 中; 加人 5 p Z N抗体(. )
       4           再     0  E
                           L     ( 25到每个微 孔中
                                  4 .
455 反应
 ..
   将 酶标 板轻轻摇晃 ,
              使孔中的试剂摇匀 ,
                       置温度 10^3℃培育反应 1 mi.
                           8 -
                            C  0     0 n

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                                                         / 1 4- 04
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456 洗涤
 ..
   将微孔 中液体倾倒到水池 内,
                 倒置微孔 支架 ,
                         在干净纸 巾上 轻拍 ,
                                    除去所有残 留的液体 ,
                                               用移液器加
蒸馏水 20 
     5WL到每个微孔 中, ,
               洗板 放置 2 n再 排空液体,
                      mi,     重复洗涤 3次。
457 显色
 ..
   加 10 
       
      0IL底物 溶液(..)
              ( 29 到每孔 中,
              4         充分摇匀 , 10   
                             置 8C一3℃恒温箱中 ,
                                   0     反应 5 n
                                             mie
458 终止
 ..
   加 10 
       
     0 kL终止液 (.. 到每孔 中, 匀
             42 1)
                0     摇
459 测定
 ..
   在 40 
        处 ,
      5n  以空气为空 白调零 ,
                    测定吸收值 。在 6 mi
                             0 n内读数 。
46 结果计算和表述
 .
4 6 1 限f 法
 . . 
   若试样孔
       的吸收值小于标准品孔的吸收值 , Aj ?  m 超过 限量值 , 阳性 。若 试样孔的吸
                      即 e <Ag },
                          *
                          j            为
收值大于或等于标准孔的吸收值, 试孔 A 准 ,
              即A 祥 ) 标孔则小于或等于所设限量值, 性。
                                  为阴
   限量值为标准值 (gL 乘 以稀释 因子。按 451操作 ,
           Y/)            . 
                           .    稀释因子为 10 若控制标准值 为 5 /
                                       0,          K L
                                                    g
时,
 试样 中 Z N的限量在 50 /g
       E      0 K k.
                 g
462 定f法
 ..
   百分 吸收值 所得
        : 的标 准或试样的吸收值除以第一个标 准( 标准 )
                             0    的吸 收值 再乘以 10 作为百分
                                             0,
吸收值 A%,
      按式 ()
         3计算 。
                                 A
                                         
                                    ,__
                         八 / =
                            c    二一 入 1VV        . , . . .・ ・・… … (3)
                                                   . ・ ・ .. ・ ・
                                                    . . .・ . ・
                                 了 。
                                             
                                  1

   式 中:
       
   A— 标准品或试样 的吸收值 ;
       
  A。 空白的吸收值 。
      
    —
   标准曲线的绘制:
            所计算的百分吸收值对应 Z N浓度(gL 的
                         E    K/) 半对数坐标作标准曲线图, 线在
                                              曲
5  L 3 K/ 范围内
 I/-15  L
 sg     g     应当成线性。根据试样的百分吸收值, 通过标准曲线,查得相对应浓度。试
样中Z N的
    E 含量( )
          X 以微克每千克(gk)
                  l/g表示,
                   e     按式()
                            4计算。
                          X二c V n
                                               
                             XX    . .・ ・ 一 ( )
                                   一... ・. 4
                                     .,
   式 中:
       
   c 从标准曲线上查得相对应试样提取液( 51中 ZN浓度,
       
   —                 ( .) E
                     4.        单位为微克每升(gL ;
                                      t/) 
                                       A
  V
       提取液(..)
     试样   ( 5 1体积 ,
          4       单位为毫升 ( L ;
                        m ) 
   n 试样稀 释倍 数 ;
       
   —
  m
     试样质量,
   —     单位为克()
             9。
   计算 结果
        表示到小数点后一位有效数字 。
47 宜复性
 .
   在重复性条件下获得 的两 次独立测试结果 的相对差值不 大于 巧%。
       




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  • 1. I CS 5. 0 6 12 zycnzj.com/ www.zycnzj.com 荡黔 B 46 泊星石 www.bxsdl.com 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB T 9 4 - 2 0 / 15 0 0 4 饲 料 中玉米赤 霉烯 酮 的测定 D e e m i ton  z ar l no t r na i of  e a e ne  f e i e ds n  20-61 发 布 0 40-0 2 0 -00 实 施 0 4 1- 1 中华人民共和国国 家质量监督检验检疫总局 发 布 中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/
  • 2. zycnzj.com/ www.zycnzj.com 泊星石 www.bxsdl.com GB T  5 0 2 0 / 1 4- 04 9 I N 舌 本标 准参考      国内外有关标 准 、 文献 , 经研究 、 改进 和验证后制 定。本标准 非等 效于 A AC 美 国公 O ( 职分析化学家协会)98年最后通过的玉米 中玉米赤霉烯 酮的薄层 色谱法和 19 年 首次通过的玉 米、 18 94 大麦、 饲料 中玉米赤 霉烯酮的酶联免疫吸 附测定 法。其 中薄层色谱测定方法为仲裁方法 ,酶联免疫吸附 测定方法为快速筛选方法 。 本标准 由全      国饲料工业标 准化技术委员会提出 本标准 由全      国饲料工业 标准化技术委员会归 口。 本标 准由江苏省微生 物研究所负责起草。      本标准主要起草人 :      毖晓黎 、 丁贵平 、 东、 李利 袁建兴 、 成恒篙. zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/
  • 3. zycnzj.com/ www.zycnzj.com 泊星石 www.bxsdl.com GB/ 15 0 2 0 T  4 - 0 4 9 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 范围 本标准规定了玉米赤霉烯酮 (erl oe 以下简称 Z N 的薄层 色谱测定方法 和酶联免疫 吸附测      zaa nn , e E ) 定法 。 本标准适     用于配合饲料和饲用谷物原料 中 Z N 的测定 。 E 薄层色谱     测定方法的最低检测量为 2 n , 免疫吸附测定方法的最低检测量 为 。2 n , 0  酶联 g .  g 5  2 规范性引用文件 下列文件      中的条 款通 过本标准的引用而成为本标 准的条款 。凡 是注 日期 的引用文件 , 随后所 有 其 的修改单 ( 不包括勘误的 内容)或修订版均不适用于本标准 ,然而 , 根据本标 准达成协议的各方研究 鼓励 是否可使用这些文件 的最新 版本 凡是不注 日期的引用文件 , 其最新版本适用于本标准 。 G/ 6 2     8 分析实验室用水规格和试验方法 B T 6 GB T  6 9 1     4 9 .  怕 料 果 样 古 洛 / 1 薄 层 色谱 法 ( 裁 法 ) 仲 3 1 原理 . 试 样中 Z N     E 用三氯 甲烷提取 , 提取液经液一 液萃取 、 浓缩 , 然后进行 薄层色谱分 离, 限量定 量, 或用 薄层 扫描仪测 定荧光斑点的吸收值 , 外标法定量 。 32 试剂与材料 . 所用试剂除另 有规定,      均使用分析 纯试剂 水符合 GB T 8 中一级水的规定 。 / 6 2 6 32 1 三氯甲烷。 .. 322 0 L氢 氧化 钠溶液 : .  4 g .  / 称取 4g 氧化钠, 氢 加水适量溶解 , 稀释至 10  。 用水 0 m工 32 3 磷 酸溶 液(+1) .. ( 0. 1 32 4 磷酸溶 液(+1) .. 1 9。 325 无水硫 酸钠:5℃灼烧 4h冷却后贮于干燥器 中备用 。 .. 60 , 3 2 6 展 开 剂 : 氛 甲烷 一 酮一 一 酸 (8 2 + 功 。 .. 三 丙 苯 乙 1 + +8 327 显色剂 :0  .. 2 g抓化铝( I1 6 0 溶于 10  AC,・ H2 ) 0 mL乙醇 中 32 8 薄 层板 : .. 称取 4g硅胶 G, 置于乳钵 中加 1 m 05 放甲基纤维素钠水溶液研磨 至糊状 。立即 0  .  L  倒 人薄层板涂布器 内制备成 1 c 0  mX2 c 厚度 。3  0  m、 . mm的薄层板 , 在空气 中干燥 后 , 用甲醇预展 薄层 板 至前沿 ,吹干, 标记方 向, 15 -10 在 00 1 ℃活化 1h 置于干燥 器内保存备用 。 C  , 329  E ..  Z N标准储备溶液 普告:      工 凡接触 E      Z N 的容器,需浸人 4%次 氯酸钠( a C) NO I 溶液 , 半天后清洗备用 。 2 为 了安全 ,      分析人员操作时要带上 医用乳 胶手套。 称取适量的 E      Z N标准品 , 甲醇配制 成约 10 / L  N标 准储 备溶 液。避光 , 用 0 p m Z g E 于一 5 以下 ℃ 储存 。 标定储 备液的浓度 , 1       用 cm石英 比色杯 , 以甲醇为 参比 , Z N的最 大吸收峰 波长 34m 处 , 在 E 1n 测 定吸光度值 A。储备液 中 Z N的含量( ) E X,以微克 每毫升( p / ) ( gmL 表示 , 1  按式() 算。 1计 zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/
  • 4. zycnzj.com/ www.zycnzj.com 泊星石 www.bxsdl.com GB/ 1 5 0 2 0 T  4 - 0 4 9 A X M X  0 10 X, ........ ......・ ..・ ・. . (1) 一 £ S X 式中 :      A- 测定的吸光度值 ;      M- Z      N的摩尔质量 ( E M=38 mo) 1 g l; / e Z N在       甲醇 中的分 子吸收系数 (=60 / o - E e 0 m m D; ' S        — 比色杯的光径 长度 , 单位为厘米 (m) c , 32 1  Z N 标准工作溶液 : ..0  E 根据计算的标准储 备液的浓 度, 密吸取标 准储备 液(. .) 精 329 适量 , 用三 氯 甲烷 稀释成浓度为 2 p / L的标准工作溶 液 0  m g 33 仪器 与设备 . 3 31 小 型粉碎机 .. 332 电动振荡器 。 .. 333 薄层板涂布器 。 .. 334 玻璃器皿: .. 分液漏斗、 漏斗。所有玻璃器皿均用稀盐酸浸泡, 依次用自来水、 蒸馏水冲洗。 3 35 旋转蒸发器 : .. 配有 20  0 ml心形瓶。 336 慢速滤纸 。 .. 3 37 展开槽 ;5 m X10  X5 mm( .. 20 m  5 mm  0  立式 , 具磨 口)。 338 点样 器: l -9 k . .. 1  cL 9  L 339 紫外 光灯 : .. 波长 24  3 5  5 n 6n m, , 33 1 薄层 色谱扫描仪 : ..0 配有汞 灯光源 34 试样制备 . 按 G / 49.       1691 B T  饲料采样方法取得试样 , 四分法 浓缩减取 约 20 经粉碎 , 0 g, 混匀 , 装人磨 口瓶中 备 用。 35 分析步骤 . 3 5 1 试 样 处理 .. 称取约 2 试样 (.)精确至 00 g ,      g 0  34( .  )置于具 塞锥形瓶中 , 1  加人 8  mL水和 10  0 mL三氯 甲烷 , 盖 紧瓶塞 ,在振荡器上振荡 1h加入 1 无水硫酸钠 , , 0g 混匀 , 滤, 过 量取 5 m 0 L滤液于分液漏斗 中, 沿管壁 慢 慢地加人氢氧化钠溶液 (. ) mL 并轻轻转动 1 n 静置使 分层 , 3221 . 0  , mi, 将三抓 甲烷 相转移 至第二个 分液漏斗 中, 用氢氧化钠溶液(..)0  , 复提取 1 , 3221 mL重 次 并轻轻 转动 1 n 弃去三 氯甲烷层 , 氧 m , i 氢 化钠溶液层并人原分液漏斗 中, 用少量蒸馏水淋洗第二个分液漏斗 , 洗液倒人原分液漏斗 中, 再用 5  mL 三氯甲烷重复洗 2 , 次 弃去三氯甲烷层。向氢氧化钠 溶液层 中加 人 6 ML磷 酸溶液 (.. ) , 32 3后 再用 磷 酸溶液(..) 324调节 pH值 至 95 .  , 左右 于分液漏斗 中加人 1 m 5  l三氯甲烷 , 摇, 振 将三氯 甲烷层 经盛有 约 5g无水硫 酸钠 的慢速滤纸的漏 斗中, 滤于浓缩 瓶中, 用 1 mL三氯 甲烷重复提取 2次, 再 5  三氯 甲烷 层一并滤于浓缩瓶中, 最后用少量三氯甲烷淋洗滤器, 洗液全部并于浓缩瓶中, 真空浓缩至小体积, 将其 全量转移至具塞试管 中, 在氮气流下蒸发 至干, ZmL三氯 甲烷溶解残渣 。摇匀 , 用 供薄层色谱点样用 。 352 点样 .. 在距薄层板下端 15       . m-2  的基 线上, 1  的间距 , c c m 以 cm 用点样 器依次点标准工作溶液(..0 ( 21) 3 25  5  1 p ,0  ( .p L, p 0  2 p 相当于 5 n ,0 n ,0 n ,0 n ) L, L 1 0  10  20  40  和试样液 (.. 0  , g g g g 3512 p )  L 353 展开 .. 将薄层板放人有展开剂 (. )      326 的展开槽 中, . 展至离原点 1 c - 5  处 , 出 , 。 3  - c m-1 m 取 吹干 354 观察与确证 .. 将 展开后的薄层板置于波 长 24       5 nm紫外光灯下 ,观察与 Z N 5 n) E (0  标准点 比移值相 同处 的试样 g 的蓝绿 色荧光点。若相 同位 置上未 出现荧 光点 , 试样 中 的 Z N 含量在 本测 定方 法 的最低 检 测量 则 E 2    zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/
  • 5. zycnzj.com/ www.zycnzj.com 泊星石 www.bxsdl.com GB T  5 0 2 0 / 1 4- 04 9 5 0 /g 0 F k以下 。如果相 同位 置上 出现荧 光点 , 显色剂 (.  ) 准各 荧光点 进 行喷雾 ,3℃加 热 ag 用 3 2 7  .  对 10 5 n然后在 35  紫外 光灯下 , mi, 6nm 观察荧 光点 由蓝绿色变为蓝紫色 , 光强度 明显加强 , 且荧 可确证试样 中含有 Z N。于荧光点下方用铅笔标记 , E 待扫描定量测定 。 355 定,测定 .. 355 1 薄层扫描 工作条 件 ... 光源 :      汞灯 。 高压 激 发波长 33       :1 n 发射波长 :0 n m; 40 m, 检测方式 反射      : 。 狭缝 :      可根据斑点 大小进 行调节。 扫描方式 距齿扫描 。      : 3 5 5 2 标 准 曲线 绘 制 ... 以 Z N标准工作溶液质量 (g为横坐标 ,      E n) 以峰面积积分值为纵坐标 , 绘制标准 曲线 。 36 结果计算和表述 . 根据试样      液荧光斑 点峰面积积分值从标准 曲线上查出对应 的 Z N 质量(g , 样 中 Z N的含量 E n)试 E ( 以微克每千克(g k ) X) p / g表示 , () 按 2式计算 。 X二m X , 上 ... .… … ,・ ・・一 (2) .... .・・ ・ 。・ o X         no  V 式中 :      V— 试样液(..       , ( 51最后定容体积 , 3 ) 单位为微升 (L ; p) V— 试样液点样体积 ,      z 单位为微升( L ; p) m— 从标准曲线上查得试样液点上对      , 应的 ZN质量, E 单位为纳克(g; n)  mo 最后提取液相 当试样 的质 量,      — 单位为克 () 9。 计算 结果表示到小数点后 一位有 效数字。      37 重 复性 . 在重 复性条件下获得的两 次独立 测试结果的相对差值不大于 10,      00 4 酶联免疫吸 附测定 法( 快速筛选 法) 4 1 原理 . 方法 的检测依据是抗 原一 反应 。将 Z N抗体 的羊抗体吸 附在固相载 体表面 ,      抗体 E 加人 Z N抗 体、 E 酶标 Z N结合物 、E E Z N标准或试样液 , Z N抗体 与固相 载体 表面羊抗 体结合 的同时 , 在 E 游离 的 Z N, E 酶标 Z N结合物与结合在 固体 表面的 Z N抗体竞争 , E E 未结合 的酶标 Z N结合物洗 涤除去。加人酶底 E 物, 在结合酶的催化作用 下, 无色底物 降解 产生蓝色物质 。加入终止剂后颜色转变 为黄色。通过酶标检 测仪 , 40  波长处测吸收值 。吸光强度 与试样 中 Z N 的浓度成 反比 。 在 5nm E 酶联免疫      吸附测定法具有操作简单 , 快速灵敏 , 果可靠 的特点 。目前 有专 门测 定 Z N的酶 联免 结 E 疫检测试剂盒 的商品。在分析 时适 当参考操作说 明书 。 42 试剂与材料 . 42 1 包被抗体 的聚苯乙烯微 量反应板 2 孔或 4 ..  4 8孔。 422  写 .. 0 的甲  7 醇溶液 423 标准品溶液 : .. 精密吸取标定后的标准储备液(..  ( 2 9  , 甲醇溶液(..  3 ) 适量 用 ( 2 2配制成 Z N 标准 4 ) E 品溶液 1 , -5浓度分别为 0 / , p / ,5 / ,5 / ,3 1 / p L 5  L 1 p L 4 p L 15  L. g g g g ,g 42 4 酶标抗原溶液 :E 与辣根过氧化 酶结 合物。 .. ZN 42 5 抗 体溶液 : Z N抗体 。 .. 抗 E 42 6 柠 檬 酸 缓 冲 溶 液 [ ( ,, 0 ) .  o/ ,  =4 0 : 取 1.  1 柠 檬 酸钠 .. c NaCH; , =0 1  lL p ; m H  . ] 称 0 17 g 4 zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/
  • 6. zycnzj.com/ www.zycnzj.com 泊星石 www.bxsdl.com GB T  5 0 2 0 / 1 4- 04 9 ( aC H, ・ H 0)1.  2  N ,  0 2 2 ,374  柠檬 酸( ,  ・ O) ,  , 6 g C H,  HB 加水溶解 至 1  O, L, 427 底物溶液 甲: 甲基联苯胺 , .. 四 用柠檬酸缓 冲溶液 (. .) 426配成浓度为 04 L . / , g 428 底物溶液 乙: 15  3 %过氧化氢 , 柠檬 酸缓 冲溶液(..) 释至 1  .. 取 .  mL 0 用 ( 26稀 4 L, 429 底物溶液 : .. 底物溶液 甲与底物 溶液乙 1 1的混 合液。 : 42 1 终止液 : 酸溶 液(+1) ..0 硫 1 7, 43 仪器与设备 . 43 1 酶标检测仪 : 40  .. 带 5 nm波长 。 432 小型粉碎机 。 .. 43 3 0  ,0 K , 00  ..  5 t 10  1  t L L 0 L微量移液器 。 4 34 电动振 荡器。 .. 4 35 玻璃 器皿 :0  .. 5 mL锥形瓶 、 斗、 漏 量筒。 4 36 快速滤纸 。 .. 44 试样 制备 . 同 34      .  , 45 分析步骤 . 45 1 试样处理 .. 称取约 5     g试样(.)精确 至 00 g , 44 ( .1  置于 5 m ) 0 L具塞锥形瓶中 , 加人 2 mL甲醇溶液(..) 5  422 , 密塞。振荡器提取 1 mie提取 液通过快 速滤纸过 滤。取 10  0 n . mL滤液 , 1.  加 9 0  mL蒸 馏水稀释 , 摇 匀,为试样液。 452 分析前注惫事项 .. 分析前将      所有试剂平衡 至室温 ; 分析后 立 即将 所有试 剂放 回 2 ^8 0 -℃冰箱 ; C  在所 有培育 中 , 避光 , 盖上微孔板 盖。 453 定位 .. 根据需要      设定限量法( 见表 1和定量法( ) 见表 2 。取 足够数量的微孔 置微孔架 上, ) 标准 品和试样做 两个平等实验 , 记录标准 品孔 和试样孔 的位置 。限量 法时 控制标 准品孔 号中 的浓度 为限量值/稀释 因 子 , 过调节稀释因子使之浓度 在 。 3 p / 并通 ^15  L范围 内。 g 表 1 限 f 法微 孔 定 位                                        孔 号 I 2 3 4 5 6 7 习 9 10 11 12 标 准品溶液 1 标准品溶 液 2 待测试样液 ( p/ )   gL 0  ( p /    g L) 5  表 2 定t法微孔定位 孔      号 一 : I 6 一: 10 【 11 一 12 标准品溶液 I一5 待 测 试样 液 pg L / } pL}5  }5  !5  5  1pL 4V, 1pL g/ g / g一3g / / 4.5.4 加试荆 在每孔中依次加人试剂 :      加人 5 p 0  准溶液(..) L标 ( 2 3或试样液(..  4 ( 51至相 应微孔 中; 4 ) 加人 5 p 0 L 酶标 结合 物(..) ( 24 到每个微孔 中; 加人 5 p Z N抗体(. ) 4 再 0  E L  ( 25到每个微 孔中 4 . 455 反应 .. 将 酶标 板轻轻摇晃 ,      使孔中的试剂摇匀 , 置温度 10^3℃培育反应 1 mi. 8 - C  0 0 n zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/
  • 7. zycnzj.com/ www.zycnzj.com 泊星石 www.bxsdl.com CB T  5 0 2 0 / 1 4- 04 9 456 洗涤 .. 将微孔 中液体倾倒到水池 内,      倒置微孔 支架 , 在干净纸 巾上 轻拍 , 除去所有残 留的液体 , 用移液器加 蒸馏水 20  5WL到每个微孔 中, , 洗板 放置 2 n再 排空液体, mi, 重复洗涤 3次。 457 显色 .. 加 10       0IL底物 溶液(..) ( 29 到每孔 中, 4 充分摇匀 , 10    置 8C一3℃恒温箱中 , 0 反应 5 n mie 458 终止 .. 加 10       0 kL终止液 (.. 到每孔 中, 匀 42 1) 0 摇 459 测定 .. 在 40       处 , 5n 以空气为空 白调零 , 测定吸收值 。在 6 mi 0 n内读数 。 46 结果计算和表述 . 4 6 1 限f 法 . .  若试样孔     的吸收值小于标准品孔的吸收值 , Aj ?  m 超过 限量值 , 阳性 。若 试样孔的吸 即 e <Ag }, * j 为 收值大于或等于标准孔的吸收值, 试孔 A 准 , 即A 祥 ) 标孔则小于或等于所设限量值, 性。 为阴 限量值为标准值 (gL 乘 以稀释 因子。按 451操作 ,      Y/) .  .  稀释因子为 10 若控制标准值 为 5 / 0, K L g 时, 试样 中 Z N的限量在 50 /g E 0 K k. g 462 定f法 .. 百分 吸收值 所得      : 的标 准或试样的吸收值除以第一个标 准( 标准 ) 0 的吸 收值 再乘以 10 作为百分 0, 吸收值 A%, 按式 () 3计算 。 A          ,__ 八 / = c 二一 入 1VV . , . . .・ ・・… … (3) . ・ ・ .. ・ ・ . . .・ . ・ 了 。              1 式 中:      A— 标准品或试样 的吸收值 ;      A。 空白的吸收值 。      — 标准曲线的绘制:      所计算的百分吸收值对应 Z N浓度(gL 的 E K/) 半对数坐标作标准曲线图, 线在 曲 5  L 3 K/ 范围内 I/-15  L sg g 应当成线性。根据试样的百分吸收值, 通过标准曲线,查得相对应浓度。试 样中Z N的 E 含量( ) X 以微克每千克(gk) l/g表示, e 按式() 4计算。 X二c V n                       XX . .・ ・ 一 ( ) 一... ・. 4 ., 式 中:      c 从标准曲线上查得相对应试样提取液( 51中 ZN浓度,      — ( .) E 4. 单位为微克每升(gL ; t/)  A V      提取液(..) 试样 ( 5 1体积 , 4 单位为毫升 ( L ; m )  n 试样稀 释倍 数 ;      — m    试样质量, — 单位为克() 9。 计算 结果      表示到小数点后一位有效数字 。 47 宜复性 . 在重复性条件下获得 的两 次独立测试结果 的相对差值不 大于 巧%。      zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/