1. Tạp chí Hóa học, T. 47 (6B), Tr. 281 - 285, 2009
NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA ENZYME
POLYPHENOL OXIDASE TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN CACAO
Đến Tòa soạn 18-10-2009
PHAN THANH BÌNH1, NGUYỄN VĂN THƯỜNG 1,
NGUYỄN ĐÌNH TUYẾN2, ĐỖ TRUNG SỸ2, HOÀNG THỊ BÍCH2, TRẦN ĐÌNH TOẠI2
1
Viện Khoa học Kỹ thuật nông lâm nghiệp Tây nguyên
2
Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam
ABSTRACT
In the cacao fermentation, some enzymes such as polyphenol oxidases (called tyrosinase) are
of key importance in flavour precursor formation and in pigment degradation [1, 2]. In order to
increase cacao quality due to fermentation, we are researching the activity of polyphenol oxidase
during the fermentation. It is the rapid polymerization of o-diphenols, benzoquinones to produce
black, brown or red pigments (polyphenols) that is the cause of browning of cacao. That is why,
polyphenol oxidase is a enzyme of key importance in flavour precursor formation. Our results
show that polyphenol oxidase was strongly inactivated during fermentation. After 72 hours of
fermentation, the initial polyphenol oxidase activity of enzyme has been decreased in 10 times.
These results are according to literary publications [1, 2]. The kinetic parameters of polyphenol
oxidase have been calculated: VM = 2.38 U; KM = 4.52 x 10-3 M.
I - MỞ ĐẦU còn chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học như
polyphenol (như catechins, epicatechins, tiền
Cây ca cao (Theobroma cacao) là cây bản cyandin), theobromin, caffein, Serotonin,
địa ở vùng rừng nhiệt đới Amazon rậm rạp phenyletylamin. Các hoạt chất sinh học không
nhiều ánh sáng và nóng ẩm ở Trung và Nam chỉ có ý nghĩa là thực phẩm với giá trị dinh
châu Mỹ. Đầu thế kỷ 19 cây ca cao đã được di dưỡng cao, mà còn có ý nghĩa như dược phẩm
thực vào Việt Nam. cao cấp dùng trong y học.
Cây ca cao khi trưởng thành cao từ 5 đến 8 Trong chu trình chế biến, việc lên men để ca
mét, bắt đầu cho quả khi đã được 4 đến 5 năm. cao có chất lượng tốt, có hương vị thơm ngon
Mỗi cây cho khoảng 20 quả. Quả có chất lượng rất quan trọng, cần phải được đảm bảo bằng quy
tốt có thể nặng tới 0,5 kg. Hạt ca cao chứa các trình tốt. Lên men được tiến hành bằng nhiều
thành phần quan trọng như axít béo (40-50% cách khác nhau, nhưng ngoài việc phụ thuộc
gọi là bơ cacao), trong đó có axít oleic, axit vào lượng thịt trong hạt, việc tạo nhiệt, còn phụ
stearic. Hạt cacao không chứa nhiều đường, thuộc rất nhiều vào hoạt động của các vi sinh
nhưng chứa đạm, carbohydrat, chất sợi, các vật và các enzyme trong quá trình lên men [3 -
vitamin (A, B1, B2, B3, C, E và axit 6].
pantothenic) và một số khoáng chất cần thiết Polyphenol oxidase là enzyme xúc tác quá
(như magiê, canxi, sắt, kẽm, đồng, kali và trình bẻ gẫy liên kết glycosit trong các
Manganes). polyphenol của tạo hương vị cho cacao.
Ngoài các thành phần nêu trên, hạt ca cao
281

2. Phản ứng đặc hiệu của polyphenol oxidase màu nâu. Hạt chưa lên men hoàn chỉnh có màu
là xúc tác quá trình oxy hóa catechol không màu tím.
trong vùng ánh sáng khả kiến tạo thành - Xác định nồng độ protein
benzoquinon có màu nâu có hấp thụ cực đại tại
bước sóng 420 nm [3]. Xác định nồng độ protein được xác định
theo phương pháp trong tài liệu [7, 8].
- Xác định hoạt tính polyphenol oxidase [9, 10]
Polyphenol oxidase oxy hóa catechol tạo
thành benzoquinone. Benzoquinone có cực đại
hấp thụ tại bước sóng 420 nm. Sau 2-3 phút bắt
Catechol (không màu)
đầu phản ứng, hoạt tính của enzym tỷ lệ thuận
Benzoquinon (màu nâu)
với cường độ hấp thụ cực đại của benzoquinon.
Trong phần nghiên cứu này, chúng tôi đề
Một đơn vị enzym là lượng enzyme cần
cập tới sự thay đổi hoạt tính của polyphenol
thiết cho phản ứng oxy hóa quinin để mật độ
oxidase, một trong những enzym có vai trò
quang cường độ hấp thụ tại cực đại của sản
quyết định trong quá trình lên men.
phẩm tạo thành (benzoquinon) tại bước sóng
420 nm lên 0,001 đơn vị trong 1 giây trong điều
II - THỰC NGHIỆM
kiện phản ứng ở 25°C, pH 6,5. Như vậy, 1 đơn
1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị vị enzym = 10-3.OD/giây
- Đo hấp thụ của benzoquinon ở bước sóng 420
Hạt cacao: Lấy từ cây cacao vùng Tây nm
Nguyên, Đắc Lắc.
Lập đồ thị chuẩn sự phụ thuộc giữa nồng độ
Dung dịch đệm 50 mM H3PO4-NaOH, pH và độ hấp thụ cực đại của benzoquinon ở bước
6,5 sóng 420 nm:
Dung dịch cơ chất 50 mM catechol. Chuẩn bị 10 dung dịch catechol trong đệm
Máy quang phổ UV/VIS spectroscopy phosphat (50 mM H3PO4-NaOH, pH 6.5) có các
“Labomed” (USA). nồng độ 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90 mM
2. Phương pháp nghiên cứu Đo mật độ quang: Lấy 0,9 ml từng dung
dịch trên cho vào cuvet, thêm vào 0,1 ml dịch
- Lên men cacao
enzyme có nồng độ 0,1 mg/ml. Phản ứng
Lên men Ca cao được tiến hành trong thùng enzyme được tiến hành ở nhiệt độ phòng và lắc
gỗ có đục lỗ ở đáy chứa được 10 kg hạt tươi. nhẹ cuvet trong 2 phút, sau đó đo mật độ quang
Thùng được lót lá chuối xung quanh, đổ đầy hạt D420 nm (của benzoquinon) ở bước sóng 420 nm
và đậy bằng lá chuối. Thời gian ủ 4 ngày, giữ ở trên máy quang phổ khả kiến UV/VIS
nhiệt độ 400C. Sau từng ngày, hạt cacao được “Labomed” (USA). Kết quả đo mật độ quang
đảo cho đều trong cả quá trình lên men. Sau ½ của các dung dịch phản ứng trong cuvet được
ngày, lấy mẫu 0,1 kg để khảo sát sự phát triển vi ghi vào bảng 1. Từ các số liệu trong bảng 1, lập
sinh vật và hoạt tính enzyme tương ứng. Đồng đồ thi chuẩn sự phụ thuộc giữa nồng độ và độ
thời kiểm tra hàng ngày trong quá trình lên men hấp thụ cực đại của benzoquinon ở bước sóng
bằng cách cắt đôi hạt để quan sát màu sắc của tử 420 nm (hình 1).
diệp, cho tới khi hạt đã lên men hoàn chỉnh có
Bảng 1: Sự phụ thuộc giữa nồng độ và độ hấp thụ cực đại
của benzoquinon ở bước sóng 420 nm
C, mM 9 18 27 36 450 54 63 72 81 90
OD420 nm 0,045 0, 096 0,138 0,183 0,226 0,272 0,321 0,356 0,408 0,454
282

3. 0.5
0.4
OD 420 nm
0.3
0.2
0.1
0
0 20 40 60 80 100
C, mM
Hình 1: Đồ thị chuẩn để xác định benzoquinon
Kết quả thực nghiệm được xử lý theo Kết quả đo sự thay đổi mật độ quang OD
phương pháp bình phương tối thiểu trên máy trong phản ứng polyphenol oxidase cacao để
tính để tìm phương trình hồi quy mô tả tương chuyển hóa catechol (cơ chất [S]) thành
hợp kết quả nhận được. Phân tích thống kê được benzoquinon (sản phẩm) được ghi trong bảng 2
thực hiện theo các tiêu chuẩn Student và Fisher
Từ các giá trị thay đổi mật độ quang OD (λ
[11].
= 420 nm) đo được theo thời gian trong quá
trình xác định hoạt tính của enzyme, xác định
III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
được tốc độ của phản ứng tương ứng với các giá
1. Xác định các thông số động học VM, KM trị nồng độ cơ chất V = f([S]) (dòng 7 trong
của polyphenol oxidase cacao bảng 2).
Bảng 2: Sự thay đổi mật độ quang trong quá trình xác định hoạt tính
của polyphenol oxidase cacao
Nồng độ catechol [S], M 102
No Thời gian (giây)
0,1 0,2 0,4 0,8 1,6
1 30 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07
2 60 0,05 0,06 0,07 0,16 0,24
3 90 0,06 0,07 0,11 0,24 0,36
4 120 0,07 0,09 0,13 0,32 0,42
5 150 0,08 0,11 0,16 0,34 0,48
6 180 0,08 0,12 0,21 0,39 0,51
-3
7 V (OD/giây).10 0,3 0,4 0,9 2,0 3,0
-3
8 1/V (giây/OD).10 3,83 2,50 1,11 0,50 0,33
-1 -2
9 1/[S],M .10 10,0 5,0 2,5 1,25 0,625
Sơ đồ phản ứng của polyphenol oxidase cacao xúc tác chuyển hóa catechol thành
benzoquinone được giả thiết theo cơ chế Michealis - Menten (cho phản ứng enzyme hai giai đoạn)
283

4. có thể viết như sau [12]:
k+1
E + S ES ⎯2 →
⎯
k
E+P
k1
VM [S] 1 1 KM 1
Khi ấy: V = , = + .
K M + [S] V VM VM [S]
Trong đó, VM là tốc độ cực đại của phản ứng; KM - hằng số Michaelis.
Các thông số động học được xác định theo phương pháp Lineweaver Burk [12] như sau: từ các
giá trị nghich đảo 1/V (dòng 8) và 1/[S] (dòng 9) được ghi trong bảng 3 lập đồ thị 1/V = f (1/[S])
(Hình. 2):
1/V
1/ VM
tg α = KM/ VM
α
- 1/KM
1/[S]
Hình 2: Đồ thị xác định các thông số động học VM và KM [12]
Từ đồ thị (hình 2), xác định được các giá trị mạnh chỉ còn 30 % so với hoạt tính ban đầu.
1/VM, 1/KM .Từ đó suy ra: VM = 2,38 x 10-3 OD/ Hoạt tính enzyme tiếp tục giảm trong quá trình
giây = 2,38 đơn vị; KM = 4,52 x 10-3 M. lên men nhưng với tốc độ chậm hơn, sau 90 giờ,
hầu như lên men đã kết thúc, hoạt tính chỉ còn
2. Khảo sát sự thay đổi hoạt tính của
10% so với hoạt tính ban đầu.
polyphenol oxidase trong quá trình lên
men IV- KẾT LUẬN
Quá trình lên men ca cao được tiến hành
trong 4 ngày (∼ 90 giờ) cho tới khi hoàn chỉnh - Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu đã xác
hạt ca cao chuyển sang màu nâu sẫm. Sau từng định được các thông số động học đặc trưng cho
polyphenol oxidase là: VM = 2,38 đơn vị; KM =
12 giờ, lấy mẫu (0,1 kg) để khảo sát sự thay đổi
hoạt tính của polyphenol oxidase. Kết quả khảo 4,52 x 10-3 M.
sát sự thay đổi hoạt tính của polyphenol oxidase - Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính enzym
được trình bày trên hình 3. của polyphenol oxidase cho thấy, hoạt tính
enzyme giảm mạnh trong quá trình lên men hạt
Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy, trong
quá trình lên men hạt cacao, sau chừng 30 giờ, cacao Việt Nam, sau 80 giờ hoạt tính chỉ còn
hoạt tính enzyme polyphenol oxidase giảm 10% so với hoạt tính ban đầu.
284

5. 120
100
80
A, %
60
40
20
0
0 20 40 60 80 100
t, giờ
Hình 3: Sự thay đổi hoạt tính của polyphenol oxidase trong quá trình lên men
TÀI LIỆU THAM KHẢO FEMS Yeast Research, Vol. 9(5), 774 - 783
(10) (2009).
1. Carl E Hansen, Margarita del Olmo,
7. M. M. Bradford. Anal Biochem, 72, 248 -
Christine Burri. Journal of the Science of
254 (1976).
Food and Agriculture, Vol. 77(2), 273 -
281 (1998). 8. Н. П. Мешковa, C. E. Севeрин.
2. C. E. Hansen, A. Manez, C. Burri, A. Практикум по биохимии. Издательство
Bousbaine. Journal of the science of food Московского Университета, “МГУ”, 87-
and agriculture ISSN 0022- 88 (1979).
5142 , Vol. 80(8), 1193 - 1198 (2000). 9. Chunhua Shi; Ya Dai; bingle xia; Xiaolong
3. A. M. Mayer. Phytochemistry 67: 2318– Xu; Yongshu Xie and qingliang Liu. (2001)
2331.doi:10.1016/j.phytochem. The Purification and Spectral Properties of
2006.08.006. PMID 16973188 (2006). Polyphenol Oxidase I from Nicotiana
4. Nicolas Niemenak, Christina Rohsius, Silke tabacum. Plant Molecular Biology
Elwers, Denis Omokolo Ndoumou and Reporter,19: 381a–381h, Dec.
Reinhard Lieberei (2006). Journal of Food 10. P. C. Chikezie. J. of Agriculture and Food
Composition and Analysis, Vol. 19 (6-7), Sciences Vol. 4(2) Oct., 115 - 124 (2006).
612 - 619 (2006). 11. Ахназарова С. Л., Кафаров В. В.
5. W. G. C. Forsyth, V. C. Quesnel. Journal of Оптимизация эксперимента в химии и
the Science of Food and Agriculture, Vol. химической технологии, Изд. “Высшая
8(9), 505 - 509, Published Online: 2 May, школа”, Москва (1978).
Copyright©2009 Society of Chemical
Industry (2006). 12. Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải.
Động học của quá trình xúc tác sinh học.
6. Daniel Heide-Marie, Vrancken Gino, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 200 tr.
Takrama Jemmy F., Camu Nicholas, De (2004).
Vos Paul, De Vuyst Luc.

6. t, giờ 0 12 24 36 48 60 72 90
A, % 100 70 52 38 29 21 15 10
286