2.  Per quanto riguarda il mais per uso
alimentare umano, i limiti di aflatossine (in
µg/Kg) sono contenuti nel Reg. CE 1881 del
2006
 mais da sottoporre a selezione o altro
trattamento prima del consumo o del suo
utilizzo come ingrediente per alimenti →
AFB1=5,0; totali=10,0
 Cereali e derivati, tra cui i prodotti
alimentari a base di cereali → AFB1=2,0;
totali=4,0

3.  Per quanto riguarda l’uso mangimistico per animali i limiti
di AFB1 (in ppm di prodotto con umidità al 12%) sono
contenuti nel D.Lgs. 149 del 2004
 Tutte le materie prime ad uso mangimistico → 0,02
 Prodotti per bovini, capre e pecore → 0,02 (tranne
prodotti per bestiame da latte → 0,005 e prodotti per
agnelli e vitelli → 0,01)
 Prodotti per polli e maiali (tranne quelli giovani) → 0,02
 Altri prodotti completi → 0,01
 Prodotti aggiuntivi per bovini, capre e pecore (tranne i
prodotti aggiuntivi per bestiame da latte, agnelli e vitelli)
→ 0,02
 Prodotti aggiuntivi per maiali e polli (tranne quelli giovani)
→ 0,02
 Altri prodotti aggiuntivi → 0,005

4. Per estrarre le aflatossine dal campione da
analizzare si utilizza cloroformio; dopo aver
filtrato, per purificare una parte del filtrato si
utilizza una cartuccia di florisil e poi una di
C18;
La separazione e la determinazione
successive si effettuano con sistema HPLC,
utilizzando una colonna C18 a fase inversa,
poi si effettua una derivatizzazione con una
soluz. di iodio satura e, infine, una
quantificazione, utilizzando un rivelatore a
fluorescenza.

5.  Cloroformio stabilizzato con etanolo (allo 0,5 – 1%)
 Metanolo
 Propanone (acetone)
 Soluzione acetonelacqua (98:2)
 Soluzione acqualmetanolo (80:20)
 Soluzione acqualacetone (85:15)
 Eluente per HPLC, costituito da una soluzione
acqualmetanolo/acetonitrile (130:70:40), i tre solventi devono
essere per HPLC
 Soluzione di iodio satura in acqua (2 g di iodio in 400 ml di
acqua, agitazione magnetica almeno per 2 ore e filtrare)
 Celite 545 o simile trattata con acido
 Cartucce di florisil
 Cartucce di C18
 Standard di aflatossine
 Standard di aflatossine da 1 μg/ml circa

6.  Registrare lo spettro ultravioletto della
soluz. nell’intervallo 330 - 370 nm contro
la soluzione benzene/acetonitrile (9:1);
trovare l‘A del pto. di massimo e trovare
la concentraz. con la questa formula:
AF(μg/ml)= (A ∙ PM ∙ 1000) / E
A: assorbanza nel pto. di max
PM: peso molecoare dell'AFB1
E: coeff. di estinz. molare
A = assorbanza

7. PM E
B1 312 19.800
B2 314 20.900
G1 328 17.100
G2 330 18.200
M1 328 18.815

8.  Infine, per quanto riguarda la soluz. di calibrazione,
prima del suo utilizzo, portare lo standard da 1 μg/ml
alla T ambiente; trasferirne una parte in recipiente
tarato, in modo da poter ottenere uno standard
diluito da 4 ng/ml circa di AF in acqualacetone.
Usare questo standard diluito per ottenere da esso
una serie di soluz. di calibrazione. Mantenerle alla
temperatura di 4 °C e al buio.
Preparando gli standard ed effettuando le analisi,
bisogna evitare l’esposizione alla luce diretta e la
presenza di NaClO sotto forma di vapore, che possono
decomporre le AF. La vetreria nuova va sottoposta a
trattamento, utilizzando una soluz. 2 N di acido solforico
per 12 ore, prima di poter essere lavata normalmente.

9.  Tritacarne
 Agitatore meccanico
 Bilancia analitica
 Rotavapor
 Carta da filtro a pieghe con diametro 24 cm o
un’altra simile
 Filtro con pori di diametro 0,45 fvn
 Colonna di vetro, con un diametro interno di 1 cm
circa e una lunghezza di 30 cm circa con attacco
luer
 Rubinetto di nylon con attacco luer
 Siringa da 10 ml con attacco luer
 Cromatografo HPLC

10.  Colonna C18 per HPLC da 311 o da 5 u
 Pompa HPLC per la soluz. di iodio
 Collegamento a T in acciaio inox, Vmorto zero da 1/16 per
0.75 nun
 Spirale di reaz. in teflon o in acciaio inox, avente delle
dimensioni comprese tra 300 x 0.5 mm e 5000 x 0.5 mm
 Bagno termostato a olio o acqua a 60 °C con regolazione
della temperatura (± 0.1 °C)
 Rivelatore a fluorescenza con λ di eccitazione = 365 nm
ed emissione = 435 nm, mentre per gli strumenti a filtri
l’emissione è < 400 nm; usare anche un regolatore di
contropressione per evitare la formazione di bolle d’aria
nella cella a flusso.
 Integratore elettronico

11. Le aflatossine sono cancerogene e quindi devono essere
maneggiate con molta prudenza. L’analisi va quindi
eseguita, rigorosamente, sotto cappa, indossando guanti in
lattice di gomma; utilizzare il più possibile degli standard di
aflatossine in soluzione acquosa, evitando quindi quelli
portati a secchezza. Infatti queste sostanze, essendo
particolarmente elettrostatiche, potrebbero diffondersi molto
facilmente nell‘ambiente circostante. In caso di versamento
accidentale di soluz. di AF, bisogna detergere con una soluz.
di NaClO all'l %, lasciare reagire per 10 min e
successivamente utilizzare una soluz. al 5% di acetone.
Sciacquare tutta la vetreria utilizzata con MeOH, aggiungere
la soluz. all’1% di NaClO e successivamente, passate due ore,
aggiungere acetone fino al 5% del tot. Fare reagire per 30
min e poi lavare con cura.
AF = aflatossine

12. Macinare
completamente il
campione e renderlo
omogeneo
Estrarre 50 g di
campione, utilizzando
250 ml di CHCl3 e 25 ml
di acqua deionizzata, in
una beuta con tappo
smerigliato, e
aggiungere 25 g di
celite, che funge da
coadiuvante di
filtrazione(cioè un
materiale ausiliare nel
proc. di filtraz. che
serve principalmente a
conferire
incomprimibilità e
porosità al deposito di
particelle solide che si
accumula sul mezzo di
filtrazione)
Agitare per 30 minuti,
filtrare con filtro a
pieghe e poi ottenere
almeno 50 ml di liquido
filtrato ed estratto

13. Collegare il
rubinetto di nylon al
gambo corto della
cartuccia florisil,
lavare quest’ultima
e prelevare 10 ml di
CHCl3 con la siringa
e farne passare 8
nella cartuccia
attraverso il
rubinetto, per
togliere l’aria
Collegare il gambo
lungo della
cartuccia alla
colonna di vetro e
far passare gli altri 2
ml di CHCl3,
attraverso la
cartuccia, nella
colonna; poi
chiudere il rubinetto
e staccare la siringa
Aggiungere il filtrato
al complesso
colonna-cartuccia e
lasciare filtrare per
gravità, poi lavare
con 5 ml di CHCl3 e
poi con 20 ml di
MeOH; poi scartare i
componenti
dell’eluito
(attenzione: nel
frattempo
controllare che la
colonna-cartuccia
non vada a
secchezza)

14. Eluire le AF con 40
ml di
acetonelacqua e
raccogliere
l’eluato che si
ottiene
Utilizzando il
rotavapor,
concentrare
l’eluato, anche per
eliminare i residui di
acetone rimasti
che porterebbero
a perdita di analita
(le AF) nella
cartuccia C18;
riprendere questo
residuo con 1 ml di
MeOH e 4 di
acqua
Collegare il
rubinetto al
gambo corto della
cartuccia di C18 e
far passare con la
siringa 10 ml di
MeOH, per togliere
l’aria; prelevare 10
ml di acqua e
farne passare 8
attraverso la
cartuccia

15. Collegare il gambo
lungo della
cartuccia a una
colonna di vetro e
far passare,
attraverso la
cartuccia, gli altri 2
ml di acqua, nella
colonna; poi
chiudere il
rubinetto e
staccare la siringa
Mettere l’estratto
ottenuto nella
colonna e, con
acqualmetanolo,
lavare il pallone
almeno 2 volte;
lasciare filtrare per
gravità; controllare
che la colonna-
cartuccia non
vada a secchezza
Eluire le AF con 50
ml di
acqualacetone;
raccogliere, in un
cilindro graduato,
tutto l’eluato; se
ritenuto
necessario, portare
a volume 50 ml
con acqua e
mescolare.

16. Impostare il flusso
della pompa a
0,5/0,3 ml/min,
rispettiv. per
colonna da 5 o
da 311 u; la fase
mobile (eluente)
è
acqualmetanolo
/acetonitrile
Il flusso dell’altra
pompa
dev’essere
impostato a
0,4/0,2 ml/min di
soluzione satura
di iodio per flussi
rispettiv. di 0,5 e
0,3 ml/min
dell’eluente
Il rivelatore a
fluorescenza va
impostato alle λ
di lavoro;
regolare il
detector
impostando una
deviazione di
circa l’80% del
fondo scala del
registratore per 1
ng di AFB1

17. Introdurre per iniezione
nello strumento 250 μl
delle soluz. Di
calibrazione,
precedentemente
preparate, e
dell’estratto del
campione
Verificare la linearità della
risposta fluorimetrica
calcolando la curva di
regressione lineare
y=ax+b che si ottiene
dalla correlazione della
quantità x delle AF in ng
iniettate, con le aree
proporzionali all’intensità
di fluorescenza y

18. II contenuto delle aflatossine totali del campione, in μg/Kg, è
calcolato con questa formula:
AF = (m ∙ Vn) / (Vm ∙ M ∙ Vf ∙ 250)
Dove:
m = quantità di AF (espressa in ng) che si ottiene dal picco
del campione estratto, e che si calcola sulla curva di regress.
lineare
Vn = i ml di estratto di campione che sono stati iniettati
Vm = il ml finali dell'estratto di campione
M = la massa (g) del campione
Vf = il volume (ml) del filtrato ottenuto
250 = i ml di CHCl3 usato per estrarre il campione
Se l’analisi e stata effettuata secondo le indicazioni la
formula diventa:
AF (espressa in μg/kg) = 20 ∙ m

19.  ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’, Metodi di analisi utilizzati
per il controllo chimico degli alimenti, raccolta a cura di
Massimo Baldini, Fabio Fabietti, Stefania Giammarioli,
Roberta Onori, Leucio Orefice e Angelo Stacchini, 1996, v,
265 p. Rapporti ISTISAN 96/34
 RICERCA SULLE CARATTERISTICHE DI FILTRABILITA’ DELLA
BIRRA E OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO DI FILTRAZIONE,
tesi Presentata da: MICHELE SENSIDONI, Università di
Bologna
 http://eur-
lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:364:0
005:0024:IT:PDF
 http://www.confindustria.tn.it/confindustria%5Ctrento%5C
news.nsf/web/42904D24BD27A724C125774A004E1205/$File
/Decreto%20Legislativo%2010%20maggio%202004%20n.%2
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