3. Beta-Laktamazlar
• Carbapenemler (imipenem ve penipenem), geniş spektrumlu beta
laktamaz üreten gram negatif çubuklara karşı nispeten kararlı ajanlardır.
• Bu beta-laktamazların çoğu, enzimin aktif merkezinde bir serin kalıntısına
sahiptirler ve bunlar A sınıfı beta laktamlara ( SHV- ve TEM- ‘ nin de dahil
olduğu) aittir.
• Japonya’ da , imipenemin gram negatif bakteri vakalarına karşı serbest bir
şekilde kullanılması, birçok klinik izolatta, karbapenemlere ve geniş
spektrumlu beta-laktamlara karşı direnç ortaya çıktığını göstermiştir.
• Enterobacteriaceae ve Pseudomonas spp. Familyalarından olan bu dirençli
suşlar, fırsatçı olarak yada nosokomiyal (hastane enfeksiyonu)
enfeksiyonlarında konakçıda tehlike oluşturmaktadır.
4. Beta-Laktamazlar
• Yapılan çalışmada imipenem dirençli Serratia marcescens suşları izole
edilmiş ve bu suşların Metallo-Beta-Laktamaz , İMP ürettiği doğrulandı.
• Metallo-Beta-Laktamaz üreten suşlar genellikle yüksek seviyede diranç ve
hemen hemen tüm beta-laktam antibiyotiklere direnç gösteriyor. Bu
nedenle, Japonya’ da ki genel hastanelerde Metallo-Beta-Laktamaz üreten
bakterilerin dağlımı araştırılmış.
5. Materyal ve Metod
• 1993 ylında Aichi’ de bulunan 7 genel hastaneden nisan ve mayıs
aylarında bakteriyal suşlar toplandı ve test edildi.
• Aichi japonya’ nın ortasında bulunur ve yaklaşık olarak nüfusu 6,850,000
dir. Hem Anjyo hemde Okazaki’ ye komşudur.
• Her hastadan tek suş izole edilmiş. Bazı suşlarıın 2 kere izolasyonunu
engellenmesi için ve toplamda 105 Serratia marcescens suşu toplanmış.
6. Hassasiyet testi
• Mueller-Hinton II agar (BBL) agar kullanılarak, agar dilusyon metodu ile
MİCs yapıldı.
• Plaklara logaritmik fazda bulunan kültürden 5 µl alınarak plaklara eklendi.
• Plaklar 18 saat boyunca, 37 ͦ C de inkübasyona bırakıldı.
• Ve daha sonra her bir beta-laktam antibiyotiliğin MİC değeri National
Committee for Clinical Laboratory standartlarına göre belirlendi.
7. Metallo-Beta-Laktamaz’ ın saflaştırılması, inhibisyon
çalışması ve amino asit dizisinin belirlenmesi
• İnhibisyon çalışması için; Metallo-Beta-Laktamaz aktivitesi , imipenemi
hidrolizi ile belirlendi.
• Watanabe ve arkadaşlarının metodu ile Hg, Cu ve EDTA’ nın inhibitör etkisi
test edildi ve imipenem substrat olarak kullanıldı.
• AK9373 suşunun Metallo-Beta-Laktamaz enzimi Osana ve arkadaşlarının
metodu kullanılarak yüksek derecede saflaşrıldı ve aminoasit dizisi, N
terminal peptid sekans cihazı kullanılarak belirlendi. (model 437A; Applied
Biosystems Inc., Foster City, Calif.).
8. DNA manipulasyonu and Southern hibridizasyon
analizi
• Plazmid DNA, hızlı alkalin ekstraksiyon metodu ile hazırlandı.
• Low-Melting agaroz jel elektroforezi yapıldı ve sonra elektroelusyon
yapıldı.
• Restriksiyon endonukleazlar Nippon Gene şirketine hazırlatıldı.
Rekombinant plazmid aşağıdaki şekildeki gibi hazırlandı.
9. Sonuçlar
• Aichi’ deki genel hastanelerden izole edilen Serratia marcescens suşları
tablo 1 de gösterilmiştir. A ve B hastanelerinde dirençli suş
bulunamamıştır.
Yüksek dirençli suşların hepsi G hastanesinden izole edildi. İmipenem dirençli
suşların yüzdesi her hastanede farklı çıktı. En yüksek yüzde C hastanesinde
bulundu.
10. Sonuçlar
• 7 hastaneden toplam 17 klinik izolat imipenem direnç gösterdi.
• 105 izolatın , 13 beta-laktam antibiyotiğe karşı toplam direnç yüzdesi figür
2 de gösterilmiştir.
11. • Serratia marcescens suşları imipenem hassasiyetine göre 3 grupta
sınıflandırılmıştır.
• National Committee for Clinical Laboratory göre 85 suş (%81) MİC değeri
2 µg/ml den daha az bulunduğu için hassas olarak kabul edilmiştir.
• 20 suş (%19) imipeneme dirençli olarak kabul edilmiştir.
• Bu 20 suşun 3 tanesi imipeneme karşı 32 µg/ml den daha yüksek MİC
değeri olduğu için yüksek dirençli olarak kabul edilmiştir.
• Diğer 17 suş orta dirençli grupta sınıflandırılmıtır.
12. • İmipenem dirençli şuşların 9 tanesi, tüm beta-laktam antibiyotiklere
(kloramfenikol ve norflaksosin) karşı 2 µg/ml den daha yüksek değerde
saptlanmış.
13. Plazmidler ve İmipenem Direncinin Transferi
• Her imipenem dirençli suşun plazmid taşıdığı gözlemlenmiştir.
• Suşların plazmid profili , imipeneme karşı MİC değerinin 2 µg/ml daha
fazla olmasıdır.
• İmipenem dirençli AK9373 suşunun plazmidi transfer edildi ,konjugasyon
yolu ile E.coli CSH2 konjugasyon yolu ile ve CSH2 suşunun direnci
imipeneme karşı 4 µg/ml olduğu gözlemlenmiştir.
• Diğer yüksek dirençli suşlar AK9374, AK9385 ve AK9391 ile konjugasyon
yapılamamıştır.
• Elektroporasyon ile plazmid yarıdımı ile aktarılmaya çalışılmıştır. Her
transformat 16 µg/ml ceftazidime ve 4µg/ml imipenem direnci
gözlemlenmiştir.
14. • Konugasyon sonucu büyük bir plazmidin E.coli CSH2 ye transfer
edildiği, hibridizasyon sonucu belirlenmitir.
15. Southern hibridizasyon analizi
• Metallo-Beta-Laktamaz spesifik DNA probu , plazmid ile hibridize olmştur
ve AK9373, AK9374, AK9385, ve AK9391 ve suşlarda kromozomal
pozisyonda hibridizasyon saplanamamıştır.
• Hibridizasyonda AK9374, AK9385 ve AK9391 benzer büyüklükte
plazmidler bulunduğu gözlemlenmiştir.
• AK9373 suşunda iki farklı bölgede hibrdizasyon sinyaline rastlanmıştır ve
bu iki sinyalin benzer plazmidlerin farklı formu olabilileceği
düşünülmektedir.
