Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

Enzim kinetiği ve regülasyonu

17,359 views

Published on

Published in: Health & Medicine
  • Dating for everyone is here: ♥♥♥ http://bit.ly/39pMlLF ♥♥♥
       Reply 
    Are you sure you want to  Yes  No
    Your message goes here
  • Follow the link, new dating source: ❤❤❤ http://bit.ly/39pMlLF ❤❤❤
       Reply 
    Are you sure you want to  Yes  No
    Your message goes here

Enzim kinetiği ve regülasyonu

  1. 1. ENZİM KİNETİĞİ ve REGÜLASYONU Uzm.Dr. Gülsen YILMAZ ŞUBAT 2007
  2. 2. ENZİMLERs Enzimler protein yapıda biyolojik katalizörlerdir.s In vitro koşullarda bağ kırılma reaksiyonları yüksek enerjiye ihtiyaç duyar. (aşırı pH, yüksek ısı ve diğer ölümcül koşullara)s İşte enzimler bu reaksiyonların vücut koşullarında oluşumuna izin verir.
  3. 3. ENZİMLERs Enzimler ilk keşfedildiklerinde enzimlerin canlı hücrelerin yapılarından ayırt edilemeyeceği savunuluyordu.s 1897’de Eduarde Buchner’in canlı maya hücrelerinden şekeri alkole fermentasyonunu katalize eden bir seri enzimleri aktif solüsyon halinde elde etmesi biyokimya tarihinde dönüm noktası oldu.
  4. 4. NEDEN ENZİM KİNETİĞİ?s Bugün enzimler saflaştırılabilmektedir. Ancak enzim katalizli reaksiyonların mekanizmalarını çalışılmasındaki genel yaklaşım hala reaksiyonun hızını belirlemek ve belirlenen hızın deneysel parametrelerdeki değişimlere nasıl cevap verdiğini göstermek üzerine kuruludur
  5. 5. Reaksiyon mekanizmalarının bilinmesinin faydaları :s Bir reaksiyonun mekanizmalarının çözülmesi benzer diğer reaksiyonların mekanizmalarını çözmede yardımcı olur.s Reaksiyonu denetleme olasılığının olması ve reaksiyon şartlarını değiştirmek veya başka bir madde katarak reaksiyon oluşumunu hızlandırmak veya yavaşlatmaktır.
  6. 6. ENZİM KİNETİĞİ
  7. 7. ENZİM KİNETİĞİs Enzim kinetiği, enzimle katalizlenen bir reaksiyonun hızını ve mekanizmasını inceleme anlamına gelmektedir.s Bir kinetik analizin esas amacı kimyasal reaksiyonun nasıl ve ne gibi bir hızla oluştuğunu anlamaktır.s Yani SUBSTRATLARIN ÜRÜNE DÖNÜŞÜNDE İZLENEN YOLUN VE HIZIN BİLİNMESİDİR.
  8. 8. SUBSTRATIN ÜRÜNE DÖNÜŞÜMÜ
  9. 9. SUBSTRATIN ÜRÜNE DÖNÜŞÜMÜ k1 k2E+ S ES (vo) E+ P k-1
  10. 10. Reaksiyon HızıKimyasal reaksiyonların hızı, reaksiyona katılanmaddelerin konsantrasyonlarıyla orantılıdır ve hızeşitliği diye adlandırılan bir eşitlikle ifade edilir. A B n HIZ Hız eşitliğindeki n üsleri, bir tepkimenin derecesini de ifade eder.
  11. 11. SUBSTRATIN ÜRÜNE DÖNÜŞÜMÜ k1 k2E+ S ES (vo) E+ P k-1
  12. 12. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 S + E 80 ↓ 60 PÜrün (sabitlenmiş zaman periyodu) 40 20 0 0 2 4 6 8 Substrat ( mole)
  13. 13. ENZİMİN SUBSTRATTARAFINDAN DOYURULMASI (SATURASYONU)
  14. 14. Düşük [S]
  15. 15. Enzimin Substrat ile Saturasyonu A. Düşük [S]
  16. 16. Yüksek [S]
  17. 17. Enzimin Substrat ile Saturasyonu A. Düşük [S] B. 50% [S]
  18. 18. Enzimin Substrat ile Saturasyonu VmaxV0 A. Düşük [S] B. 50% [S] C.Yüksek, sature [S]
  19. 19. Enzim Kinetiğinin Anlamı Enzim konsantrasyonuyla 0º kinetik E3 orantılı E2 1º kinetik E1[S] = Düşük → Yüksek [S] = Sabit konsantrasyon
  20. 20. Michaelis-Menten Denklemi Vm ax [S] vo = Km + [S] s Vo = ilk hız s Vmax= maksimum hız s [S] = substrat konsantrasyonu s Km= hız sabiti
  21. 21. PROBLEM!Hiperbol hiçbir zaman tam olarak yatay hale geçmez 1.0 ~Vmax Vo 0.5 0 0 1 2 [S]
  22. 22. M-M denklemine alternatif denklemlers Lineweaver-Burk denklemis Eadie-Hofstee denklemis Hanes-Woolf denklemis Eisenthal-Cornish-Bowden denklemi
  23. 23. Lineweaver-Burk (çift ters grafik)s M-M eşitliğinin her iki tarafı 1/ şeklinde yazılırsa: 1 / Vm ax [S] 1/vo = Km + [S] sBu ilişki, y = mx + b şeklindedir. sBu şekilde grafik haline aktarılırsa düz bir eğri elde edilir.
  24. 24. 1 V01Km 1 Vmax 1 [s]LINEVEAWER-BURK GRAFİĞİ
  25. 25. Enzim Kinetiği için bir örnek 1) Önceden bilinen miktarda Enzim → E2) Farklı konsantrasyonlarda substrat ekle → S (x 軸 )3) Sabit zamanda oluşan Ürünü ölç(P/t) → vo (y 軸 ) 4) (x, y) eksenindeki hiperbolik eğriden, hesapla→Vmax 5) y = 1/2 Vmax olduğunda x ([S]) → Km 1 Vmax vo vo 1/2 -1 Km 1 VmaxÇift resiprokal (ters) 1/S Km S
  26. 26. Enzim Kinetiği için Gerçek Bir Örnek Substrat Ürün Hız Çift ResiprokalVeri no [S] Absorbance v (( mole/min) 1/S 1/v 1 0.25 0.21 → 0.42 4 2.08 2 0.50 0.36 → 0.72 2 1.56 3 1.0 0.40 → 0.80 1 1.35 4 2.0 0.46 → 0.92 0.5 1.16 (1) Ürün oluşumu 600 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülmüştür (2) Reaksiyon zamanı 10 dakikadır 1.0 2.0 Çift Resiprokal v 1/v 1.0Direk 1.0 Juang RH (2004) BCbasics 0.5 -3.8 0 0 0 1 2 -4 -2 0 2 4 [S] 1/[S]
  27. 27. Enzim Kinetiğindeki Önemli Kavramlars Kms Turnover sayısı (kcat)s Kcat /Km oranıs Enzim aktivite ünitesis Enzim İnhibisyonu
  28. 28. Km: Substrat Afinitesi Vm ax [S] Vm ax vo = Eğer vo= Km + [S] 2 Farklı substratların kullanımı Vm ax Vm ax [S]Vmax = S2 2 Km + [S] S1 S3 1/2 Km + [S] = 2 [S] S1 S2 S3 Km = [S] Km Afinite değişimi
  29. 29. Km: Hexokinaz Örneği Glukoz + ATP → Glc-6-P + ADP Glukoz Alloz Mannoz Substrat sayı 1 CHO CHO CHO 2 H-C-OH H-C-OH HO-C-H 3 HO-C-H H-C-OH HO-C-H 4 H-C-OH H-C-OH H-C-OH 5 H-C-OH H-C-OH H-C-OH 6 H2-C-OH H2-C-OH H2-C-OHKm = 8 8,000 5 M
  30. 30. Km: Substrat Afinitesi
  31. 31. Km nedir?s Km enzimin bir karekteristiğidir. Bir sıvının kaynama noktası gibi. Ancak birden fazla enzim aynı Km e sahip olabilir.s Km bize substrat için enzim afiinitesi hakkında fikir verir. Bir enzim düşük Km e sahip ise substrat için yüksek afiniteye sahiptir. Çünkü düşük substrat konsantrasyonunda maksimim hıza ulaşılmış yani doymuştur.
  32. 32. Km nedir?s Metabolizmada düşük Km e sahip (yüksek affinitedeki) enzimler büyük önem taşır. Düşük Km değerleri (1/1.000.000) 10-6 M olarak verilir. Veya hatta daha da küçük 10-7,10-8 M olabilir.s Düşük affinitedeki yüksek Km e sahip enzimler ise metabolizma için az önemlidir. Bu Km değerleri 1/100 M-> 10-2 veya 10-1 M olarak verilir.s Enzim üzerine bir inhibitör etki ediyorsa Km etki tarzı hakkında bilgi verir.
  33. 33. Turn Over Sayısı, kcat ve kcat / Km oranı k1 k2 E+ S ES (vo) E+ P k-1kcat: Bir saniyede bir enzim molekülünün substrattanoluşturduğu ürün sayısı. Enzim substrata bağlandıktansonraki dönemde enzim aktivitesini gösterir. [S]>>Kmkoşullarında kullanılır.kcat / Km oranı: Enzim molekülünün total aktivitesinigösterir. Enzimin substrata bağlanmadan önceki dönemideiçerir. [S]<<Km koşullarında kullanılır.
  34. 34. Enzimlerin Turn Over SayılarıEnzim Substrat kcat (s-1)Katalaz H2O2 40,000,000Karbonik anhidraz HCO3- 400,000Asetilkolinesteraz Asetilkolin 140,0001-Laktamaz Benzilpenisilin 2,000Fumaraz Fumarat 800RecA protein (ATPaz) ATP 0.4 Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263
  35. 35. Kimotripsin farklı substratlara karşı farklı kcat / Km oranına sahiptir O R O = = – – H3C–C–N–C–C–O–CH3 – H H R= kcat / KmGlisin –H 1.3 ╳ 10-1Norvalin –CH2–CH2–CH3 3.6 ╳ 102Norlösin –CH2–CH2–CH2–CH3 3.0 ╳ 103Fenilalanin –CH2– 1.0 ╳ 105 (M-1 s-1) Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379
  36. 36. Enzim Aktivite Ünitesi S→P mol Ürün [P] t vo = [P] / dak Slope tan Ünite = mol /dak 0 10 20 30 40 Reaksiyon zamanı (dak)Spesifik Aktivite Unitesi yAktivite = Protein (mg) y = tan x x
  37. 37. Enzim Aktivitesi İnhibisyonu Enzimlerin katalitik etkileri, bazı kimyasal bileşiklerle değişikliğe uğrar veya tamamiyle yok edilebilir. Enzim Aktivitesi İnhibisyonu enzimlerin katalitik etkilerinin bazı kimyasal bileşiklerle durdurulması veya sınırlandırılması demektir.
  38. 38. Enzim Aktivitesi İnhibisyonunun Önemi:s Aktiviteleri düzenlenerek kontrol sisteminde etkili olurlar.s Enzim fonksiyonlarını inhibe eden ilaç ve zehirli bileşiklerin fonksiyon mekanizmalarının anlaşılması.s Substrat analogları kullanarak önemli araştırma olanakları sağlanması.
  39. 39. s İNHİBİSYON TİPLERİ: x Yarışmalı inhibisyon (Kompetetif) x Yarışmasız inhibisyon (Nonkompetetif) x Bağımlı inhibisyon (Unkompetetif)
  40. 40. Enzim İnhibisyonu (Mekanizma) I Kompetetif I Non-kompetetif I Unkompetetif Substrat E S S E I S X E S I I I Aktif bölge için S I inhibitör yarışırlar Farklı bağlanma bölgesiE + S ← ES → E + P → E + S ← ES → E + P → E + S ← ES → E + P → + + + + I I I I↓↑ ↓↑ ↓ ↑ ↓↑EI EI + S →EIS EIS[I] sadece serbest [E]’e [I] serbest [E] ya da [ES] [I] sadece [ES] kompleksinebağlanır ve [S] ile yarışır; Kompleksine bağlanabilir; Bağlanır, [S]’ı arttırmak[S]’ı arttırmak [I] etkisiniengeller. [S]’ı arttırmak etkiyi kaldırmaz. [I] etkisini arttırır. Juang RH (2004) BCbasics
  41. 41. Enzim İnhibisyonu I Kompetetif I Non-kompetetif I Unkompetetif Vmax Vmax Vmax vo vo Vmax’ Vmax’ I I IDirek Km Km’ [S], mM Km = Km’ [S], mM Km’ Km [S], mM Vmax değişmez Vmax azalır Km artar Km değişmez Vmax & Km azalır 1/vo 1/vo 1/voÇift resiprokal I I I Paralel çizgi kesişim y ekseni 1/ Vmax Kesişim 1/ Vmax 1/ Vmax x ekseni 1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S]
  42. 42. Kompetitif İnhibisyonÜrün Substrat Kompetitif İnhibitor Süksinat Glutarat Malonat OxalatC-OO- C-OO- C-OO- C-OO- C-OO-C-H H-C-H H-C-H H-C-H C-OO-C-H H-C-H H-C-H C-OO-C-OO- C-OO- H-C-H C-OO- Süksinat Dehidrogenaz Kleinsmith & Kish (1995) Principles of Cell and Molecular Biology (2e) p.49
  43. 43. Sulfanilamid Kompetitif İnhibitördür Para-aminobenzoik acid (PABA) Bakteriler folik asit sentezi için H2N- -COOH PABA’ya ihtiyaç duyarlar Folik Tetrahidro-Prekürsör asit folik asit Sulfanilamid PABA ile benzer H2N- -SONH2 Yapıya sahiptirler ve Bakteriyal büyümeyi İnhibe ederler. Sulfanilamid Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197
  44. 44. Enzim Kinetiğinin Özeti Direk Önem kcat / Km Vmax [S] O. derece vo= Km + [S] 1. derece kcat Farklı [S] koşullarında, vo değişikliklerini izle ve E3 Turn over E2 sayısı Vmax and Km E1 elde etmek için işaretle k2 [Et] Vmax & Km CompetitiveAktivite Unitesi Maksimum Substrat Çift Resiprokal 1 1mol Hız Afinitesi İnhibisyon dak Non-competitive Spesifik Aktivite Bi-substrat reaksiyonlarda unit Aktivite M-M denklemine uyar mg Ancak bir substratla çalışırken Uncompetitive diğeri satüre edilmelidir.
  45. 45. Enzimlerin Laboratuvarda kullanımıs Enzimler laboratuvarda; 1. Reaktif olarak (enzimatik madde analizi) Hexokinazla glukoz tayini vb. 2. Biyokimyasal marker (enzim analizi) ALT, AST, LDH vb. olarak kullanılmaktadır.
  46. 46. s Enzimler yardımıyla madde ölçümü (enzimatik madde analizi) yöntemleri ile enzim aktivitesini gösterme (enzim analizi) ve ölçme yöntemlerini karıştırmamak gerekir.s Bu iki grupta yer alan yöntemler aslında aynı deney sistemini ve koşullarını içermekle birlikte, enzim ve substrat derişimleri ve deneylerin tasarımı açısından oldukça farklıdırlar.s Her iki ölçümde uygun koşullara karar vermek için enzimatik tepkimenin M-M grafiğini incelemek yararlı olur.
  47. 47. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 80 [S]>>Km 60Ürün 40 [S]=Km 20 [S]<<Km 0 0 2 4 6 8 Substrat ( mol)
  48. 48. k1 k2 E+ S ES (vo) E+ P k-1 [S]< < Km vo = [S]Substrat düşük iken Fazla miktarda Vm ax [S] k2 [E][S] k2 vo = = = [E][S] Km + [S] Km + [S] Km [substrat] ihmal edilir Sabit
  49. 49. [S]<<Km SUBSTRAT TAYİNLERİ İÇİN KULLANILAN ARALIK
  50. 50. k1 k2 E+ S ES (vo) E+ P k-1 [S]> > Km vo = [E]Substrat yüksek iken Vm ax [S] Vmax [S] k2 vo = = = [E] Km + [S] Km + [S] Km [Km] ihmal edilir Sabit
  51. 51. ENZİM TAYİNLERİ İÇİNKULLANILAN ARALIK [S]>>Km
  52. 52. Enzimlerin lab.’da kullanımları yüksek spesifiteleri, kısa reaksiyon zamanı gibi nedenlerle kullanımı giderek artmaktadır. Bu durum enzim kinetiğinin anlaşılması gereğini de artırmaktadır.
  53. 53. Enzim Regülasyonu on veya Enzim Aktivitesi Kontrolü
  54. 54. Niçin regüle edilir?
  55. 55. Niçin regüle edilir?Bu reaksiyonudaha yakındanincelersek
  56. 56. Glikolizin ilk basamağı PFK-1Fructose-6-P + ATP -----> Fructose-1,6-bisphosphate + ADPs Hücredeki enzim miktarını düzenlenmesi Yeni enzim moleküllerinin sentezi Enzim molekülü sayısında azalmas Var olan enzimin aktivitesinin düzenlenmesi Non-kovalent modifikasyon Kovalent modifikasyon
  57. 57. Mekanizmalars Enzim miktarının düzenlenmesi Yeni enzim moleküllerinin sentezi Enzim molekülü sayısında azalmas Enzim aktivitesinin düzenlenmesi Non-kovalent modifikasyon Kovalent modifikasyon
  58. 58. Yeni enzim molekülü sentezi (Indüksiyon) DNA ReplikasyonTranskripsiyon DNA RNA GenTranslasyon Expresyonu Protein (Bizim enzimimiz)
  59. 59. Mekanizmalars Enzim miktarının düzenlenmesi Yeni enzim moleküllerinin sentezi Enzim molekül sayısında azalmas Enzim aktivitesinin düzenlenmesi Non-kovalent modifikasyon Kovalent modifikasyon
  60. 60. ENZİM MOLEKÜLSAYISINDA AZALMAs Transkripsiyon inhibisyonu (represyon)s Protein (enzim) metabolizma hızını artırmak
  61. 61. Mekanizmalars Enzim miktarının düzenlenmesi Yeni enzim moleküllerinin sentezi Enzim molekül sayısında azalmas Enzim aktivitesinin düzenlenmesi Non-kovalent modifikasyon Kovalent modifikasyon
  62. 62. Non-kovalent Modifikasyons Feed-back inhibisyons Feed-forward aktivasyons Allosterik regülasyon
  63. 63. Non-kovalent Modifikasyons Feed-back inhibisyon
  64. 64. Feed-back inhibisyon
  65. 65. Non-kovalent Modifikasyons Feed-forward aktivasyon
  66. 66. Fructosepiruvat kinaz’ın1,6-bifosfat tarafındanaktivasyonu
  67. 67. Non-kovalent Modifikasyon Allosterik regülasyon
  68. 68. Michaelis - Menten EnzimVmaxv allosterik enzim [S]
  69. 69. Allosterik regülasyonv [S]
  70. 70. Mekanizmalars Enzim miktarının düzenlenmesi Yeni enzim moleküllerinin sentezi Enzim molekül sayısında azalmas Enzim aktivitesinin düzenlenmesi Non-kovalent modifikasyon Kovalent modifikasyon
  71. 71. Kovalent Modifikasyons Polipeptid zincirlerin parçalanmasıs Reversibl fosforilasyon
  72. 72. Polipeptid zincirlerin parçalanmasıs Proenzimler (zimojenler) Bir enzimin etkin olmayan öncüsüne denir. Zimojenler diğer bir enzim, asid veya diğer etkenlerle etkin şekillerine dönüşür.
  73. 73. Pankreatik Zimojenler
  74. 74. Kovalent Modifikasyons Polipeptid zincirlerin parçalanmasıs Reversibl fosforilasyon
  75. 75. Kovalent Modifikasyons Fosforilasyon
  76. 76. Reversibl fosforilasyon
  77. 77. Hormonal kontrol
  78. 78. Diğer mekanizmalars Kompartmentasyons Izoenzimler
  79. 79. KompartmentasyonEnzim ve substratların ayırımıdır.Örn: enzimler substratlarından bazımembranlarla ayrılır, organel membranı gibi.(mitokondri)
  80. 80. Kompartmentasyon glucose cytosol glycolysis malic enzyme** mitochondrion CO2 NADPH NADP+ pyruvate pyruvate malate PC PDH* malate NAD+ OAA acetyl CoA dehydrogenase NADH ATP ADP + Pi citrate citrate OAA CoASH acetyl CoA citrate lyase** fatty acid synthesis
  81. 81. İzoenzimlerİzoenzimler aynı kimyasal reaksiyonukatalizleyen farklı kimyasal kompozisyonasahip enzimlerdirİzoenzimlere örnek:laktat dehidrogenaz (LDH),hexokinaz/glukokinaz,kreatin fosfokinaz (CPK).
  82. 82. REGÜLASYON SONUÇ ZAMANMEKANİZMASISubstrat miktarı Hızda değişiklik HemenÜrün inhibisyonu Vmax ve/veya Hemen Km’de değişiklikAllosterik kontrol Vmax ve/veya Hemen Km’de değişiklikKovalent Vmax ve/veya Hemen-dakikalarmodifikasyon Km’de değişiklik içindeHormonal kontrol Enzim miktarında Saatler-günler değişiklik içinde

×