Isolated aortic rings - vascular reactivity measurements in vitro

1. An experiment on isolated vascular
rings
Doc.dr.sc. Martina Mihalj, dr. med.

2. PHYSIOLOGY OF BLOOD VESSELS
• A good understanding of the physiology of the vascular system is
necessary to understand the course of the experiment
• Vasodilation and vasoconstriction mechanisms

3. Interstitial signaling
Vrste eceptora:
1. Receptor-dependent ion channels (ionotropic receptors)
2. Receptors coupled with G-protein (metabotropic receptors)
3. Kinase receptors
4. Nuclear receptors

4. R R E R
G G
Cellular
response Cellular response Cellular
response
Cellular
response
Hyperpolarization or
depolarization
Change the
world's
excitement
Other messengers
Discharge
Ca2+
Protein
phosphorylatio
n
other
Protein
phosphorylation
Transcription of genes
Protein synthesis
R
Transcription of
genes
Protein synthesis
1. Receptor-
dependent ion
channels
2Receptors coupled with G-proteins
(metabotropic receptors)
3. kinase
receptors
4. nuclear
receptor
Time scale:
msec
Example:
nicotian
receptor for Ach
answer
Time scale:
hours
Example:
cytokine
receptor
Time scale:
hours
Example:
estrogen
receptors
Time scale:
seconds
Example:
Muscarial receptor for Ach

5. Meta 1Meta 2
α
GDP
Meta 1
GTP
βγ
GDP
P
Hidroliza
Receptori spregnuti s G - proteinom

6. Unutarstanična signalizacija
Receptori spregnuti sa G proteinom
Meta
1
Meta
2 α βγ
GDP
Meta
1
Meta
2 α βγ
GDP
GTP
Meta
1
Meta
2 α βγ
GTP
Meta
1
Meta
2 α βγ
GDP
+
P
Receptor zauzet
Meta aktiviranaGTP hidroliziran
1.
4. 3.
2.
GDP

7. Unutarstanična signalizacija

8. Adenilat ciklaza
AC
α
βγ
GTP
ATP
cAMP
Inaktivna
Proteinkinaza A
Aktivna
Proteinkinaza A
Fosfodiesteraza
ATP
cAMP
AC
Pojačana lipoliza
⇣ sinteza glikogena
⇡ razgradnja glikogena
...

9. Ca2+
Fosfolipaza C
Fos.
C
α
βγ
GTP
PIP2
DAG
IP3
IP4
aktivacija
Protein kinaze C
Oslobađanje
Unutarst. Ca++
Ulaz Ca++
kroz membranu
kalmodulin
Ciljni enzimi
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+

11. Metabolizam arahidonske kiseline

12. News Physiol. Sci. 14;238-242, 1999; posuđeno iz prezentacije prof.dr.sc. Ines Drenjančević - Perić
20-HETE and EETs in Control of Renal Vascular Tone

13. α1
Fos.
C
α
βγ
GTP
PIP2
IP3
IP4
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
kalmodulin
Kinaza lakih miozinskih
lanaca
IP3
GLATKA MIŠIČNA STANICA
L Ca2+ kanali
ovisni o naponu
Ca2+ kanali
ovisni o ligandu
ATP
ATP
Ca2+ kanali regulirani
zalihom
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Na+

15. L-arginin NO
eNOS
GMP
Gvanilat
ciklaza cGMP
Endotelna
stanica
Glatka
mišićna
stanica
Bazalna
membrana
PK
NO: endotelni faktor relaksacije
Ca2+ - kalmodulin
+ -

16. Fiziološka humoralna regulacija
VAZOKONSTRIKTORI
• Noradrenalin
• Angiotenzin II.
• Vazopresin (ADH)
• Endotelin
VAZODILATATORI
 Bradikinin
 Serotonin
 Histamin
 Prostaglandini
 NO (EDRF)
 C-natriuretski peptid
 Adrenomodulin
 EDHF (endotelni hiperpolarizacijski
faktor)

17. Fiziološka živčana regulacija
VAZOKONSTRIKTORI
• Simpatikus: NA putem α1 α2
VAZODILATATORI
• Parasimpatikus: Ach
• Simpatikus: Na putem β2

18. UČINCI VAZOAKTIVNIH LIJEKOVA NA
KRVNE ŽILE
• ACETILKOLIN
• L-NAME
• INDOMETACIN
• KOTRIMAZOL
• VERAPAMIL
• NO donori
• KCl
• NORADRENALIN

19. Noradrenalin
α1
Fos.
C
α
βγ
GTP
PIP2
DAG
IP3
aktivacija
Protein kinaze C
Oslobađanje
Unutarst. Ca++ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
kalmodulin
Ciljni enzimi
IP3 R-IP3
Ca2+
Ca2+

20. Acetilkolin
L-arginin NO
eNOS
GMP
Gvanilat
ciklaza cGMP
Endotelna
stanica
Glatka
mišićna
stanica
Bazalna
membrana
M
Fosf.
C
αβγ
GTP
PIP2
IP3
Ca2+
kalmodulin
Ca2+

21. L - N A M E
L-arginin NO
eNOS
GMP
Gvanilat
ciklaza
cGMP
Endotelna
stanica
Glatka
mišićna
stanica
Bazalna
membrana

22. Indometacin
Arahidonska
kiselina
PGI2
COX
AMP
Adenilat
ciklaza
cAMP
Endotelna
stanica
Glatka
mišićna
stanica
- Udio PGI2 (prostaciklina) u endotel ovisnoj vazodilataciji je relativno mal
Bazalna
membrana

23. Klotrimazol

24. Na-nitroprusid, SNP
L-arginin NO
eNOS
GMP
Gvanilat
ciklaza
cGMP
Endotelna
stanica
Glatka
mišićna
stanica
Bazalna
membrana

25. PRIPREMA ZA POKUS
• Pokretanje sustava (temp . 37 ⁰C, doprema O2 itd.)
• Kalibracija sustava
• Priprema Krebs Henseleitove otopine
• Razrijađivanje lijekova

26. 4-vero kanalni sustav kupki za izolirane organe
sadrži:
 Četverokanalni standardni sustav kupki za izolirane organe (tkivne prstenove i trakice) sa svom
priključnom opremom (cijevi, kablovi itd.)
 Četverokanalni pojačivać mjerene sile
 Izometrični pretvarač sile
 Softwer za prikupljanje i obradu podataka
 Sustav za primanje i prijenos siganala sa sustava kupki za izolirane organe na računalo (četverokanalni s
mogućnošću proširivanja na osamkanalni sustav)
 Sustav za grijanje i cirkulaciju vode sa spremnikom od 20 l i mogućnošću prilagodbe temperature u
rasponu od 20 – 50 ºC te s preciznošću od ±0,1 ºC

28. Pretvarač sile
20 mL bazenčić
Makro i mikro vijak za
podešenje napetosti

30. Sastojak Koncentracija/mM Masa/g Masa/g
Deionizirana voda - 4 L 6L
NaCl 113 27,580 41,37
KCl 4,7 1,402 2,103
CaCl2 x 2H2O 2,5 1,470 2,205
EDTA 0,026 0,0304 0,05
MgSO4 x 6H2O 1,2 1,185 1,78
KH2PO4 1,2 0,653 0,98
NaHCO3 22 7,395 11,09
Glukoza - 7,999 11,99
Krebs – Henseleitova otopina

31. PRIPREMA LIJEKOVA ZA POKUS
• Lijekovi se pripremaju kao 20 mM (iznimno 3M i 2mM)
• Čuvaju se 2 do 3 mjeseca na -20 ⁰C
• KCl

32. Lijek/aktivna tvar Mr (g/L)
Priprema
20 mM
otopine
Koncentra-cija u
bazenu
Potrebno dodatno razrjeđenje
20 mM otopine
Vol. koji se dodaje
u bazenčić (μL)
KCl 74,56
Priprema se 3M
11,3g/50mL
60 mM Ne 400
Noradrenalin 205,0 41mg/10mL 10-4 M
Zamorac: 100 x (10-6)
Štakor: 1000x (10-7)
100
Acetilkolin 181,7 36,4mg/10mL 10-4 M
Zamorac: 10 x (10-5)
Štakor: 100x (10-6)
100
L-NAME 268,0 53,6mg/10mL 3x10-4 M Ne 300
Indometacin 358,0 71,6mg/10mL 10-4 M 10x (10-5 M) 100
Klotrimazol 344,8 69mg/10mL 10-4 M 10x (10-5 M) 100
Verapamil
491,0
amp: 5mg/2mL
Priprema se 2 mM
4 mL iz amp. + 6 mL H2O
20 μM Ne 200
* Otapalo za Indometasin je 96% etanol ili DMSO/ ponekad i dr. Ovisno o proizvođaču

33. KIRURGIJA

37. STANDARDNI PROTOKOL
1. Stabilizacija krvne žile
2. Inicijalni prekontrakcijski test
3. Test intaktnosti endotela
4. Ispitivanje vazoaktivne tveri

38. 1. Stabilizacija krvne žile (60 min)
 Krvna žila se prenapregne za 20 mN
 U više navrata napetosti krvne žile se ispravlja
na 20 mN (ili 0 mN ako sustav bazično podešen
na – 20 mN)
 Tijekom tog perioda bazenčići se ispiru 3-4puta
(cca. svakih 15 min)

39. 2. Inicijalni prekontrakcijski test
400μL 3M KCl
(60 mM)
Ispiranje
Ispiranje
Ispiranje
4 min
1 min
1 min
1 min
3 x

40. 3. Testiranje intaktnosti endotela
100μL 1000x razr. 20 mM
NORADRENALINA
(10-7M)
100μL 100x razr. 20 mM
ACETILKOLINA
(10-6M)
Ispiranje4 min 1 min
1 min
Ispiranje
Ispiranje
4 min

41. 4. Testiranje vazoaktivne tvari
100μL 1000x razr. 20 mM
NORADRENALINA
(10-7M)
VAZODILATATOR
u različitim dozama
4 min

43. OBRADA PODATAKA
Formule za izračun % vazodilatacije...

44. X0
Xmax
X3
% Vazodilatacije =
Xmax – X3
Xmax – X0
% Preostale kontrakcije =
X3 – X0
Xmax – X0

45. POKUS
Primjer pokusa: Učinci hiperbarične terapije na konduktivne krvne žile
DM štakora

46. 24 štakora
12 Ctrl.
(kontrola)
12 DM
(diabetičkih
tretirani s STZ)
6 Ctrl.
6 Ctrl. + Citrat
6 DM
6 DM + HBOT
L-NAME
Klotrimazol
1. 2.
Ctrl. + HBOT

47. Skupina GUK (mmol/l) Težina (g) Sustav na kojem se radilo Opaske Oznake prstenova
A - Kontrola Citrat (okot
10.08.2009., TH: 09.09.2009, m 90. g)
A1a 9,7 310 I. Aorta bila skvrčena i kontrahirana A1a 1-4
A1b 9,7 320 II. A1b 1-4
A1c 9,7 305 I. Aorta bila skvrčena i kontrahirana A1c 1-4
A2a 11,3 310 I. A2a 1-4
A2b 10 290 II.
Problemi tijekom pokusa - žila bila duže na suhom jer
sust. nije bio spreman
A2b 1-4
A2c Falilo trakica 300 II. A2c 1-4
B - Kontrola netretirana (okot
12.08.2009.)
B1a 9,3 360 I. B1a 1-4
B1b 8,6 320 II. B1b 1-4
B1c 10,9 305 I. B1c 1-4
B2a 9,5 350 I.
Serum odmrzavan zajedno s A2a, A2b i B2b - da
Danijeli ostavim 0,5 ml za Oksi.kapac.
B2a 1-4
B2b 10,7 285 II. Serum moguće razrijeđen kod odmrzavanja B2b 1-4
B2c 10,3 280 I. B2c 1-4
C - Dijabetičari + HBTh (okot
25.07.2009., TH: 09.09.2009, m 90. g)
C1a > 33 250 I. C1a 1-4
C1b > 33 285 II. C1b 1-4
C1c 8 290 II. C1c 1-4
C2a > 33 225 I. C2a 1-4
C2b > 33 250 II. C2b 1-4
C2c > 33 225 II. C2c 1-4
D - Dijabetičari netretirani (okot
01.08.2009., TH: 09.09.2009, m 90. g)
D1a > 33 250 I. D1a 1-4
D1b 7,8 320 II. D1b 1-4
D1c > 33 210 II. D1c 1-4
D2a > 33 200 I. D2a 1-4
D2b > 33 170 II. D2b 1-4
D2c 10,2 300 I. Kod odvajanja serum bijel + bijeli ugrušak D2c 1-4
Nisu razvili dijabetes

48. Inicijalni prekontrakcijski test
400μL 3M KCl
(60 mM)
Ispiranje
Ispiranje
Ispiranje
4 min
1 min
1 min
1 min
3 x

49. A: kontr.
D: diabet.

50. A: kontr.
C: diabet. + HBTh
10 min

51. A: kontr.
C: diabet. + HBTh

52. Vazodilatacija posredovana s Ach

53. Ach 10 min. nakon L-NAME

54. Ach 10 min. nakon klotrimazola