Kísérleti módszerek és nagy adathalmazok

1. Improved Medical Education in Basic
Sciences
for Better Medical Practicing
ImproveMEd
Rendszerbiológia orvostudományhoz
II. Kísérleti módszerek és nagy adathalmazok

2. A rendszerbiológiában végzett kísérleteknek nem kell omic-skála ahhoz, hogy megfeleljenek a rendszerbiológia
kritériumainak!
Gondoljunk olyan alrendszerekre irányuló kísérleteket, mint pl. az energia metabolizmus szempontjából releváns mRNS
követése különböző táplálási minták alatt, vagy több időpontban az táplálá kezdetétől.
Amiben a rendszerbiológia különbözik a közös tudományos kutatásoktól:
1. Mennyiségi adatok - hol, mekkora és milyen gyorsan változik (dinamikus, időbeli eltartottság) egy entitás?
2. Számítógépes modellek - pontos számszerűsítésen és időzítésen alapuló szimulációk
Továbbá igényli a pozitív és negatív kontrollokra és legalább 3 ismétlésre van szükség!
2. Hipotézis által vezérelt
tanulmányok, amelyek a molekulák
(vagy a célzott sejtszervecske)
célzott részhalmazát követik - a
kisméretű rendszerek biológiája.
1. Hypothesis generating studies!

3. Molekulák:
• DNS-ek mikroarray-ja és szekvenálás alapú technológiák
RNS-ek mRNS-szekvenálása
Fehérjék Tömegspektrometria-alapú proteomika
Lipidek folyadékkromatográfiás és tömegspektrometriája
Metabolitok folyadékkromatográfiás tömegspektrometria

4. Átlagnépesség technikák
• A sejtek vagy szövetminta
populációja ≈ 1 millió sejt vagy
több
• Álagos sok sejten
Egyedi sejt technikák
• Egysejtes minta
sejt-sejt variabilitás
HepaRG stabil sejtvonalMájszövet Hepatocyte spheroids

5. Microarray - differenciál
expresszió
• A domináns technika a 2000-es években
• Főleg a transzkriptumok szintjének mérésére szolgál
• Egyéb alkalmazások: genotipizálás, DNS-feltérképezés
(kópiaszám variáció), DNS-metiláció
• A Microarray különböző oligonukleotidokkal
nyomtatott foltokból áll
• A fluoreszcensen jelzett minta (próbák) és a
kinyomtatott oligonukletidek közötti hibridizáció
• GEO adatbázis
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/qqtutorial.ht
ml

6. Array CGH összehasonlító genomi
hibridizáció
• molekuláris citogenetikai módszer / kariotipizálás
• CNV relatív a minta teszteléséhez
• Abban a feltételezésen alapul, hogy a szorosan
összefüggő egyénekből származó minták két
különböző (egészséges és beteg) különböznek a
kromoszóma vagy a kromoszómális régió
nyereségében vagy elvesztésében
• A daganat-specifikus DNS kiegyensúlyozatlan
átrendeződések nagy léptékű analízise 5-10
megabázis rezolúcióval
• OMIM adatbázis
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim

7. Microarrays Methylation Assay -
epigenom
• The final nucleoA génexpresszió epigenetikus szabályozása fontos a
fejlődésben, a genetikai lenyomatban, tumorogenezisben ...
• Genom széles CpG metilációs szint 30 000-től 500 000 CpG lokusig, amely az
egész genomot lefedi
• Az első lépés a minták biszulfit átalakítása - a nem metilezett helyek C-t U-be
konvertálják, míg a metilezett metilációt vesztít
• Az átalakított DNS-t tovább erősítjük (és U-t T-re cserélünk)
• A fragmentált és denaturált oligonukleotidokat hibridizálják kétféle allél
specifikus gyöngyökkel minden egyes lokusz esetében
• Az aneloid allél specifikus oligonukleotid végső nukleotidját tovább emeljük
a jelölt dDNT-vel
• A szoftver az egyes helyek és osztályok relatív fluoreszcenciáját 0, 0,5 vagy 1
(homozigóta nem metilezett, heterozigóta vagy homozigóta metilezett)
• ENCODE
https://genome.ucsc.edu/encode/dataMatrix/encodeChipMatrixHuman.htm
l

8. Szekvenálás alapú technológiák
• DNS- vagy RNS-elkülönítéssel kezdődik,
amelyet DNS fragmentáció vagy cDNS-
szintézis követ
• A következő lépés az amplifikáció
(klónfragmentumok vektorba, transzformáló
baktériumok vektorokkal és amplifikálással)
• Sok rövid DNS-darab párhuzamos
szekvenálása
• Összefüggő töredékek összeállítása

9. Egész genom szekvenálás (WGS) vs.
teljes egzóma szekvenálás (WES)
• A WGS megpróbálja az egész genomot szekvenálni. Egyes
szekvenciák technikailag kihívást jelentenek a szekvenciák
(telomerek, centromerek, magas CG tartalom vagy ismétlődő
lókuszok) számára, és azokat a közös szekvenáló platformnak nem
fogadták el, ami a genom lefedettségének 95-98% -át jelenti, de
uniformizált módon.
• A WES szekvencia csak exomes (kódoló szekvenciák) vagy a genom
2% -a, mindegyik exomes szekvencia 30-100x (nagy mélység). A
DNS-RNS hibridizációt a kódoló régiók kiválasztására használják,
ami az úgynevezett "forró pontok" túlreprezentáltáságt és a
kimaradt variánsok alulreprezentációját okozza. Gyorsabb,
aprólékosabb és könnyebb adatelemzés, de alacsony általános
lefedettség.
uniform
bias

10. Az exome szekvenálás során dúsítási
lépést alkalmaznak a célzott DNS
kiválasztására
• A mendel-rendellenességek gyakran megzavarják a
fehérjét kódoló régiókat
• Az Exom a ritka betegségek változatainak jó forrása
• A fragmentumok izolálására a Microarreys használható
• A WES nagy mélységű szekvenciát ad
• Bamshat et al. (2011) Nature Review Genetika

11. A genomonkénti költség megnyerte a versenyt,
és a WGS vált laginkább alkalmazott
módszerré, különösen a tumor-specifikus
átrendeződések esetén
A szekvenálási módszerek fejlődése
1. Az első generációs Sanger szekvenálás;
lánclezáró technológia - a lánc szintézis
megszüntetésére használt ddNTP-k kapilláris
elektroforéziseivel (egy szál egyszerre, lassú,
pontos, drága)
2. A második (következő) generációs
szekvenálás - szekvenálás szintézissel - nano-
technologia bevezetése - párhuzamos
szekvenálás és nincs szükség szétválasztási
lépésre - korlátozások az olvasási hosszban
3. A harmadik generációs szekvencia -
immobilizált polimeráz + fluoreszcens dNTP +
kiváló optika - a bázis beépítés és a bázis
módosítása

12. A WGS vagy a WES-ből érkező
adatoknak nagyszámú populáción
végzett verifikációra van szükségük!
(több mint 1000 egyénen) •
Genotípusok és fenotípusok
adatbázis (dbGaP)? https:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/gap?
Genommal összefüggő
tanulmányok
Foo et al. (2012) Nature Review Neurology

13. RNS-Seq
Transzkriptom
• Az mRNS, az rRNS, a miRNS párhuzamos szekvenálása ...
• Gén expressziós profil
• Kvantitatív módszer ideális a rendszerbiológiai kísérletekhez
• Alternatív összekapcsolási változatok és új transzkripciós
változatok azonosítása
• GEO adatbázis
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/qqtutorial.html
• Target Scan adatbázisok (miRNS)
http://www.targetscan.org/vert_71/
Wang et al.(2009) Nature Reviews Genetics

14. Az RNS-szekvencia domináns transzkripciós
módszerré válik, és helyettesíti a microarray-ot
Wang et al.(2009) Nature
Reviews Genetics

15. ChIP-seq? Chromatin Immunprecipitációs
szekvenálás
• Kombinálja a transzkripciós faktorok vagy
egyéb DNS-kötő fehérjék kicsapódását
(specifikus antitestek alkalmazásával) vagy a
hiszton módosításait és a
koimmuniprecipitált DNS mély szekvenciáját
• Megtalálja a szabályozó szekvenciákat,
promotereket, erősítőket, halkítókat,
távtartókat ...
• A genom funkcionális szervezése

16. A Western Blot volt az első módszer egynél
több fehérje mennyiségi meghatározására
és azonosítására
• Semi-kvantitatív az enzim mögötti nemlineáris
kinetika miatt - másodlagos antitestek és szubsztrát
reakció
• A nem-lineáris kinetikát kemilumineszcens reakció
vagy röntgenkészítési film esetében is mutatják
• A LICOR olyan infravörös fluoreszcencia, amely kevés
hátteret biztosít és a fluoreszcens jel lineárisan
arányos az antitest mennyiségével
• https://www.licor.com/bio/applications/quantitative_
western_blots/

17. Előremenő és fordított fázisú
fehérje array (FPPA & RPPA)
• Kísérletet tesz az alacsony átbocsátási sebességű
Western blot módszer (8-16 sávok minták) nagy
átbocsátási módszerré történő átalakítására
• Előretekintő változatban egy ellenanyagot észlelünk a
csúszdán, és a főbb mintákat megvizsgáljuk az epitóp
jelenlétére
• Fordított változatban számos ellenanyagot (nagy
fajlagossággal) látunk el a csúszdán, és egy mintát
vizsgálunk az összes antitest számára.
• Nagy fajsúlyú antitesteket igényel, drága.

18. Tömegspektrometria, proteomika,
lipidomika, metabolomika
• A proteomika gyakran tandem tömegspektrometriát használ
(két tömegspecifikáció párhuzamosan)
• Mennyiségi, mivel a fehérjék teljes szintjét méri
• Részleteket ad a poszttranszlációs módosításokról
• Ha immunprecipitációval kombináljuk, információt nyújt a
fehérje kölcsönhatásokról
• Számos lépést foglal magában: elválasztás, emésztés,
dúsítás, ismételt elválasztás, ionizáció, tömegszűrés (MS1),
fragmentáció és tömegelemzés (MS2), azonosítás,
mennyiségi meghatározás
• Sok változat

19. Tömegspektrometria (MS),
proteomika, lipidomika,
metabolomika
Az utolsó lépés az ismert peptidek nagy
adatbázisán és a bioinformatikai keresésen
alapul.
Az MS és a különböző adatbázisok eltérő
verzióját alkalmazzák a lipidomikra és a
metabolomikára.
UniProtKB
adatbázishttps://web.expasy.org/docs/swiss-
prot_guideline.html

20. Proteomikai analízis dekódolt különbségeket a MAPK
pathway között a normál és a tumorsejtekben.
Choudhary & Mann (2010) Nature Reviews Molecular and Cell Biology

21. proteomika, lipidomika,
metabolomika
Az utolsó lépés az ismert peptidek nagy
adatbázisán és a bioinformatikai keresésen
alapul.
Az MS és a különböző adatbázisok eltérő
verzióját alkalmazzák a lipidomikra és a
metabolomikára.
UniProtKB
adatbázishttps://web.expasy.org/docs/swiss-
prot_guideline.html

22. Folyadékkromatográfia (LC) és LC /
MS
lipidomikumok, metabolomika
Palermo et al. (2017) Analytica Chimica Acta
Nagyon gyakran LC és MS
eljáráoskat kombinálva és
szekvenciában használatják.
Ugyanezeken a mintákon a
lipidomikus és metabolomikus
vizsgálatok egymás után is
elvégezhetők unyanazon a mintán.
Az LC-t arra használják, hogy a
mintát frakciók formájában osztják
mint elválasztási technika, míg az
MS molekulák azonosítására
szolgálnak.

23. A rendszer biológiai kísérletei nagy
adathalmazt használnak nagy áteresztő
képességű módszerek alkalmazásával :
• DNS-ek mikroarrayjei és szekvenálás alapú technológiái (NGS) exome / genom
• DNS + szabályozó fehérjék ChIP-seq ReMap
• RNS-ek RNS-szekvenciát tartalmaznak
• Proteinek MS proteom
• Lipidek LC / MS lipidom
• Metabolitok LC / MS metabolom