A kórokozó fertőzéses betegségek genotípusos vizsgálati módszerei

1. Improved Medical Education in Basic
Sciences
for Better Medical Practicing
ImproveMEd
A kórokozó fertőzéses betegségek genotípusos vizsgálati módszerei
Domagoj Drenjancevic

2. Nozokomiális fertőzések
• a kórházi körülmények között fontos morbiditási és halálozási források
• az Egyesült Államokban évente 2 millió betegre vonatkozik.
• kórházi betegek körülbelül 5% -át érinti
• Kb. 88 000 haláleset
• 4,5 milliárd dollár felesleges egészségügyi költséget generál

3. Multirezisztens (MDR) baktériumok - egészségügyi
ellátással járó fertőzések kórokozói
Meticillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA)
Vankomicin-rezisztens Enterococcus (VRE)
Többváltozós rezisztens Pseudomonas aeruginosa
Többgyógyszer-ellenálló Acinetobacter baumannii

4. Multirezisztens (MDR) baktériumok - egészségügyi
ellátással járó fertőzések kórokozói folyt..
 ESBL Escherichia coli
 ESBL * Klebsiella pneumoniae
 * ESBL = kiterjesztett spektrumú betalaktamáz
 Klebsiella pneumoniae karbapenemáz (KPC) termelő
baktériumok
 Karbapenem-rezisztens Enterobacteriaceae (CRE)

5. A kórokozók eloszlásának és összefüggésének
megértése
• elengedhetetlen a hospitalizált fertőzések epidemiológiájának
meghatározásához
• és segíti a racionális patogén kontroll módszerek kialakítását.
• A patogén tipizálás szerepe az, hogy meghatározzuk, hogy az
epidemiológiailag összefüggő izolátumok genetikailag is
összefüggnek-e
• Történelmileg: olyan fenotípusos jellemzők, mint a biotípusok,
szerotípusok, bakteriofág vagy bakteriocin típusok, és az
antimikrobiális érzékenységi profilok

6. GENOTIPIZÁLÁS
• eljárás az egyén genetikai összetételének különbségének
meghatározására az egyén DNS-szekvenciájának összehasonlítása
más egyének vagy referenciaszekvenciák sorozatával
Singh A et al. Application of molecular techniques to the study of hospital infection. Clin
Microbiol Rev. 2006
Andrei A, Zervos MJ. The application of molecular techniques to the study of hospital
infection. Arch Pathol Lab Med. 2006

7. Molekuláris analízis
• Ezek a DNS-alapú molekuláris módszerek közé tartoznak
• impulzus-mező gélelektroforézis (PFGE) és más restrikciós alapú módszerek,
• plazmid-analízis
• PCR-alapú gépelési módszerek.
• A kórokozók klónosságának megállapítása segíthet a kórokozóban
• az élőlények (környezeti vagy személyi) azonosítását, a fertőző és nem
fertőző törzsek megkülönböztetését
• és megkülönböztetjük a visszaesést az újrafertőzésektől.

8. GENOTIPIZÁLÁSI MÓDSZEREK
• PFGE
• Southern-blot analízis-ribotípusok
• Plazmid-analízis
• Tpizálási módszerek PCR használatával
• Multiplex PCR
• Beágyazott PCR
• Véletlenül alapozott PCR (AP-PCR)
• Erősített fragmenshosszú polimorfizmus (AFLP)
• Változó szám tandem ismétlés (VNTR) gépelés
• A Mycobacterium tuberculosis spoligotípálása

9. GENOTIPIZÁLÁSI MÓDSZEREK
• NUCLEOTIDE SEQUENCE-ALAPELT ELEMZÉS
• egyszeri helymeghatározás (SLST)
• több helytartó szekvencia tipizálás (MLST)

10. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, July 2006, p.
512–530

11. Restrikciós fragmens hosszúságú polimorfizmusok
(RFLPs)
• a kromoszómális DNS-t restrikciós enzimekkel emésztjük
• az agaróz gélelektroforézissel analizált különböző méretű fragmensek
sorozatát képezik.
• A kapott DNS-fragmensek túl nagyok ahhoz, hogy hagyományos
agaróz-gélelektroforézissel lehessen elválasztani.
• PFGE
• képesek ezeket a nagy DNS-fragmenseket elválasztani

12. Restrikciós enzimek

13. PFAGE
• A hagyományos agaróz gélelektroforézis során a
40-50 kb-nál nagyobb méretű DNS-molekulák
nem képesek hatékonyan vándorolni.
• A PFGE lehetővé teszi az 1000 kbp hosszúságú
DNS-molekulák elválasztását (gyakran megabázis
méretű DNS-ként), periodikusan megváltoztatva
a DNS elválasztását.
• A leggyakrabban használt megközelítések közül
kettő
• kontúrbilincselt homogén elektromos mező (CHEF)
• mező inverziós gélelektroforézis

14. Az Acinetobacter baumannii izolátumok
pulzált gélelektroforézis analízisének
dendrogramja
A legtöbb elemző program olyan
algoritmusokat is tartalmaz, amelyek
lehetővé teszik a törzsek filogenetikai
elemzését, amely lehetővé teszi a
törzsfejlődés és az izolátumok őssejtek
közötti kapcsolatának kimutatását.
Bogdan M, Drenjancevic D, Harsanji Drenjancevic I et al. J
Chemother 2018;30:16-24

15. Southern-blot analízis-ribotípusok
• A Southern blotting egyik leggyakoribb célja a rRNS génje
• kimutatták, hogy a ribotipizálás diszkriminatív ereje kisebb, mint a
PFGE vagy néhány PCR-alapú módszeré
• a specifikus antimikrobiális rezisztencia gének vagy virulencia faktorok
kimutatására is használják

16. Plazmid Analízis
• A plazmid tipizálás volt az első molekuláris módszer,
amelyet bakteriális tipizáló eszközként használtunk
• A tipizálást plazmid DNS izolálása és a plazmidok
számának és méretének összehasonlítása agaróz
gélelektroforézissel végezzük.
• A plazmidtartalom értékelése általában nem
alkalmazható a törzs összefüggésének
meghatározásában
• alkalmazzák olyan klinikai helyzetekben, hogy
meghatározzák az antibiotikum rezisztencia alakulását
és terjedését a különböző PFGE profilokkal rendelkező
izolátumok között, vagy a különböző kórházakban élő
szervezetek között

17. Multiplex PCR
• a PCR tipizálás hatékonyságának növelése és a reagensek költségeinek
csökkentése
• egyetlen reaktorcsőben több primer készletet is be lehet vonni
• az amplifikációs termékek mérete túl közeli volt, nehéz lenne
meghatározni az amplifikációs termék egyediségét
• A multiplex PCR további problémája az, hogy a különböző primerek keverése
potenciálisan interferenciát okozhat az amplifikációs folyamatban
• a reakció optimalizálása nehéz

18. Beágyazott PCR
• Ha rendkívül szükség van a PCR érzékenységére és specifitására
• magában foglalja két PCR primer készlet egymást követő használatát
• Az első primer készletet egy célszekvencia amplifikálására használjuk (amely
növeli a második primerkészlet érzékenységét);
• az előállított amplikon ezután az első amplikonhoz tartozó primerekkel végzett
második amplifikáció templátjaként szolgál.
• Ez a másodlagos amplifikáció csak akkor megy végbe, ha a tervezett célt
eredetileg amplifikáltuk

19. Véletlenül alapozottPCR (AP-PCR)
• az amplifikáláshoz véletlenszerű primert alkalmazunk, amely
semmilyen specifikus bakteriális DNS-szekvenciát nem amplifikál
• A véletlenszerű alapozás kulcsa az, hogy az amplifikáció során
(legalábbis kezdetben) alacsony kezelési hőmérsékletet alkalmazunk,
lehetővé téve a töredéktelen hibridizációt több véletlenszerű
kromoszómahelyen, és megindítja a DNS szintézist.

20. Erősített fragmenshosszú polimorfizmus (AFLP)
• tipizálási módszer, amely restrikciós enzim-emésztés és PCR
kombinációját használja
• Az AFLP eljárásban a DNS-t két különböző restrikciós endonukleázzal
emésztjük
• az izoláláshoz csak egy meghatározott részhalmaz kerül felhasználásra

21. A TÍPIZÁLÁSI MÓDSZEREK KÖLTSÉGHATÉKONY
ALKALMAZÁSA
• Chicago, Illinois Northwestern Memorial Kórház létrehozott egy házi
molekuláris tipizálási programot, hogy gyorsan kiértékelje a
mikrobiális klónozást és integrálja a tipizálást a fertőzésellenőrzési
programjába
• A hatékonyságot úgy értékelték, hogy a programban résztvevő 24
hónapos időszakban és egy 60 hónapos időszakban megvizsgálták a
hospitalizált fertőzésekre vonatkozó adatokat.

22. A TÍPIZÁLÁSI MÓDSZEREK KÖLTSÉGHATÉKONY
ALKALMAZÁSA
• A bevezetést követően 1000 betegnaponként a
fertőzések 13 százalékkal csökkentek, a kórházi
betegek száma pedig 23 százalékkal csökkent.
• A fertőzés aránya 43% -kal csökkent az országos
átlag alá, és az ötéves időszakban mintegy 50
halálesetet kerültek el.
• A tipizálási program végrehajtásának költsége 400
000 dollár volt évente;
• ez a kiadás 5,00 dolláros megtakarítást
eredményezett minden egyes dollárral szemben,
amelyet a programra költöttek a fertőzések
nagymértékű csökkentése miatt.

23. Következtetés
• A molekuláris tesztelés továbbra is alapvető eszköz lesz
• költséghatékonysági és orvosi szempontból is szükséges
• A molekuláris tipizálás hatékony eszköz a problémás
mikroorganizmusok kórházi környezetben való terjedésének
leküzdésére