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1. Lentivirus (Lv) related experiments should be conducted in biosafety level 2 facilities (BL-2 level).
2. Please equip with lab coat, mask, gloves completely, and try your best to avoid exposing hand and arm.
3. Be careful of splashing virus suspension. If biosafety cabinet is contaminated with virus during operation, scrub
the table-board with solution comprising 70% alcohol and 1% SDS immediately. All tips, tubes, culture plates,
medium contacting virus must be soaked in chlorine-containing disinfectant before disposal.
4. If centrifuging is required, a centrifuge tube should be tightly sealed. Seal the tube with parafilm before
centrifuging if condition allowed.
5. Lentivirus related animal experiments should also be conducted in BL-2 level.
6. Lentivirus associated waste materials need to be specially collected and autoclaved before disposal.
7. Wash hands with sanitizer after experiment.
Storage and Dilution of Lentiviru
Safe Use of Lentivirus (Lv
Lentivirus
)
s
Storage of Lentivirus
Virus can be stored at 4°C for a short time (less than a week) before using after reception. Since Lentiviruses are
sensitive to freeze-thawing and the titer drops with repeated freeze-thawing, aliquot viral stock should be stored at -
80°C freezer immediately upon arrival for long-term usage. While virus titer redetection is suggested before using if
the lentiviruses have been stored for more than 12 months.
Dilution of Lentivirus
Dissolve virus in ice water if virus dilution is required. After dissolving, mix the virus with medium, sterile PBS or
normal saline solution, keeping at 4°C (using within a week).
Precautions
· Avoid lentivirus exposure to environmental extremes (pH, chelating agents like EDTA, temperature, organic
solvents, protein denaturants, strong detergents, etc.)
· Avoid introducing air into the lentivirus samples during vortex, blowing bubbles or similar operations, which
may result in protein denaturation.
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· Avoid repeated freezing and thawing.
· Avoid exposing to “regular” plastics (especially polystyrene or hydrophobic plastics) for prolonged periods in
liquid phase. Most lentivirus viruses are very sticky and loss can occur if exposed to regular plastics, including tubes,
cell culture plates, pipette tips, if not frozen. It is best to store lentivirus in siliconized or low protein binding tubes.
Pluronic F-68 used at 0.01%-0.1% in the formulation buffer will minimize sticking if regular plastics are used.
· Avoid diluting lentivirus into low salt solution. Some lentiviruses aggregate in low salt solution, which will be
non-infectious.
Introduction of Lentivirus
Lentivirus (lente-, Latin for "slow") is a genus of retroviruses, causing chronic and deadly diseases by long
incubation periods in human or other mammalian species [1]. To date, 5 serogroups have been recognized according
to the vertebrate hosts they are associated with (primates, sheep and goats, horses, domestic cats, and cattle). Among
them, the primate lentiviruses are distinguished by the utilization of CD4 surface protein as a receptor and the
absence of dUTPase [2]. Derived from HIV-1, lentiviruses can integrate a significant amount of viral cDNA into the
host genome, mediate stable and long-term transgene expression, and efficiently infect dividing cells and
nondividing cells, which makes lentivirus an attractive gene delivery vehicle in most cell types [3].
Considering the key safety concerns during the use of HIV-derived lentivirus vectors, recombinant lentivirus has
been designed and widely used for gene delivery in most cell types. As a research tool used to introduce a gene
product into in vitro systems or animal models, lentiviral vector has been put into large-scale efforts to down-
regulate or up-regulate gene expression in high-throughput formats, allowing researchers to examine the necessity
and effects of transgenes in disease model systems, which is an indispensable for the discovery of novel transgenic
drugs.
Nowadays, several generations of lentivirus packaging system are developed, in which the second-generation
lentivirus vector and the third-generation lentivirus vector are the two most popular ones. The current method of the
recombinant lentivirus production in Genemedi is based on three plasmids co-transfection system, involving the co-
transfection of 3 plasmids (lentivirus series plasmid containing gene of interest (GOI) pLv-GOI, envelope
expressingplasmid pMD2G and packaging plasmid pSPAX2) into 293T cells to generate lentivirus vectors.
Protocol Overview
A schematic overview of recombinant lentivirus production is shown in Figure 1. The first step is to clone the gene
of interest (GOI) into an appropriate LTR/MCS containing vectors.
The recombinant expression plasmid is co-transfected into the 293T cells with envelope expressingplasmid pMD2G
and packaging plasmid pSPAX2, which together supply all of the trans-acting factors required for lentivirus
replication and packaging in the 293T cells. Recombinant lentivirus particles are prepared from infected 293T cells
and may then be used to infect a variety of mammalian cells.
Upon infection of the host cell, virus genome ssRNA should be converted into double-stranded DNA in order for
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gene expression and virus replication. Together with other viral proteins, the newly synthesized DNA constitutes an
integration-competent nucleoprotein complex, migrating into host cell nucleus and mediating integration of viral
DNA into host chromatin. Integrated viral DNA, named as provirus, becomes part of host genome and serves as a
transcription template for the synthesis of viral mRNA and genomic RNA. Following the synthesis of viral genomes
and proteins, the viral components are assembled together to produce new virions, the virus particles then bud out of
host cell and undergo a maturation step to generate infectious lentivirus.
Figure 1. Lentivirus packaging experiment flow chart.
Experimental Materials
Virus Packaging System
A three-plasmid system is used for packaging recombinant lentivirus (rLv) in this handbook, which includes a
lentivirus series vector (pLv) that can be cloned into engineering sequences for gene overexpression, RNA
interference and CRISPR/Cas9 gene knockouts, an envelope expressingplasmid pMD2G and a packaging plasmid
pSPAX2. For more information regarding how to choose the right lentivirus vector for different experimental
purpose, please consult our technical support.
Bacterium Strain
E.coli strain DH5ɑ is used for amplification of vectors.
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Packaging Cell Line
293T is the virus packaging cell line that can facilitate initial production, titer detection of lentivirus. It is an
epithelial-like cell line required for lentivirus replication, and grows into a monolayer when confluent.
The complete growth medium of 293T is Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10%
Fetal Bovine Serum (FBS) and 1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep). For a continuous culture, cells should not
exceed 70% confluence to maintain proper characteristics. Usually, starting from cell passage number one, optimal
results can be obtained within 30 passages. Once reached, it is best to start a new culture from another frozen stock
in case of any unexpected mutations and unhealthy growth. Therefore, banking your own 293T frozen stocks is very
important to ensure experimental integrity and continuity. Freezing cells at the logarithmic phase will improve post-
thaw viability.
Note: To maintain cells in a healthier condition and improve production efficiency of lentivirus, it is recommended
to use our Genemedi anti-mycoplasma reagent CurePlasmaTM
.
Other Materials and Reagents
Gene of interest
LB broth
Agar and Agarose
Kanamycin
Ampicillin
70 and 100% ethanol
Sterile PBS
Chlorine bleach
DNA gel apparatus and power supplies
Class II Biosafety Cabinet
37℃ orbital shaker
37℃ bacteria incubator
37℃, 5% CO2 incubator
15- and 50-ml conical tubes
25- and 75-cm2
tissue culture flasks
Ultracentrifuge (Beckman) or equivalent with SW28 rotor
Low-speed swinging-bucket centrifuge
Microcentrifuge
Centrifuge tube (thick-wall polycarbonate tube with cap)
Packaging and Concentration of Lentivirus
Vector Construction of Lentivirus
Before lentivirus packaging, gene of interest should be constructed into lentivirus vector. Genemedi has plenty of
premade lentivirus vector goods carrying some genetic tools in stock, such as lentivirus-LC3 autophagy flux
detection biosensors, etc.
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Note:
In order to construct vectors quickly and efficiently, it is strongly recommended to use Genemedi- ClonEasyTM
One
Step Cloning Kit（Cat. GM-GC-01/02/03）.
Transfection of Virus Plasmids into 293T Packaging Cells
a. Propagate 293T cells in DMEM with 10% FBS and 1% pen/strep. The day before transfection, plate the cells in
a 10cm dish such that the cells reach 70-80% confluency the next day. On the day of transfection, set up the 3-
plasmid co-transfection as table 1.
b. DMEM needs to be preheated to 37℃ with water bath. LipoGeneTM
transfection reagent needs to be warmed up
to room temperature before use, and mix gently before use. Replace the transfection medium of 10cm dish with
fresh medium 6 hours after transfection.
c. To prepare viral plasmids for each reaction using a 60-mm dish:
Table 1. Plasmid and transfection reagent required for transfection.
Component Amount
pLv-GOI vector 10μg
pMD2G 5μg
pSPAX2 10μg
LipoGeneTM
100l
d. Mix plasmids with transfection reagent in DMEM and add drop-wise to pre-seeded 293T cells. Incubate in 37℃,
5% CO2 and refresh with complete culture medium in 6 hours.
Note:
1. A detailed protocol of the transfection reagent can be referred to Genemedi LipoGeneTM
Transfection Reagent
User Manual.
2. Cells should be in a healthy growth state for use prior to transfection.
Harvest Virus
Collect the supernatant containing lentivirus particles 48 hours and 72 hours later after transfection, respectively.
Replace fresh DMEM culture medium after the collection of supernatant at 48h.
Virus Purification
a. After collecting virus twice, discard the transfected 293T cells and filter the collected supernatant with 0.45μM
filter membrane to an ultracentrifuge tube.
b. Centrifuge at 72000g for 2 hours at 4℃.
c. Then discard the supernatants and resuspend the lentivirus deposition with 500μl fresh medium and keep at -
80℃ or in liquid nitrogen for long time storage.
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Titration of Purified lentivirus
Determine lentivirus titer with fluorescent microscopy.
a. Seed 293T 1×10^4 cells/well in a 96-well plate one day in advance.
b. Perform gradient dilution of the lentiviral particles to 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10^4, 1:10^5, 1:10^6 in 100ul final
volume in culture medium.
c. Total 100μl viral particle mixture should be added to each well with at least 3 replicates per virus.
d. Two days post infection, count the fluorescent positive cells using fluorescent microscopy and select the dilution
factor with a proper fluorescent positive proportion (10%-30% positive cells/well). Count the triplicates and
average the number of positive cells.
e. Estimate the lentivirus titer using the following formulation: Viral titer (TU/ml) = number of fluorescent positive
cells × 10 × dilution.
Transduction of Target Cells
This protocol is for the stable cell line construction based on puromycin selection.
Note:
MOI: multiplicity of infection, is the number of viral particles to infect one cell. An optimization test of MOI is
strongly recommended as the real MOI to certain cells may be affected by the operations and methods of dealing
with viruses in different labs.
Cell Preparation
Plate robust target cells into 24-well plates at a density of 1 x 105
/ml one day in advance.
Note:
The number of planted cells depends on the growth rate of the relevant cell line. 50% to 70% confluence should be
reached on the following day.
MOI Test of Lentivirus
a. Prepare the virus in 10-fold dilution gradient, and ensure the MOI is within a range of 3 to 1000.
b. Day 0: Plate target cells in good condition at a density of 1 × 105
/ml into 96-well plates, 100 µl per well.
Incubate at 37℃ overnight.
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c. Day 1: Prepare virus in a six-MOI gradient, and dilute proper amount of virus suspension in complete culture
medium of target cell to a final volume of 100 µl (setting MOI = 3, 10, 30, 100, 300, 1000). Add diluted viruses
to pre-seeded cells and incubate for 4 to 8 hours at 37℃, then refresh the medium to remove viruses.
d. Day 3: Detect fluorescence with a microscope. Calculate MOI based on the ratio of fluorescent cells.
Note:
If the virus is not fluorescence-labeled, MOI can be determined by qPCR, WB, IF, IHC, etc.
Table 2. The lentiviral MOIs of commonly used cell lines.
Cell line MOI range Auxiliary infection reagent polybrene
(need/no)
K562 20～40 Need
Jurkat 50～80 No
kasumi 10～30 No
NB4 50～80 No
U937 20～40 Need
THP-1 50～80 Need
GBC-SD 30～50 No
H929 100～150 No
H1299 1～3 Need
95D 2～4 Need
A549 20～40 Need
SPC-A-1 100～150 Need
7402 10～15 Need
Hep 3B 10～30 Need
Hep G2 10～30 Need
SMMC-7721 10～30 Need
Huh-7 10～30 Need
Hela 10～30 Need
HOS 20～40 Need
Hep-2 10～30 Need
HL-60 >100 Need
HT-29 10～30 Need
PKO 2～4 Need
SW480 10～30 Need
DLD-1 10～30 Need
SK-OV-3 2～4 Need
SHG-44 10～30 Need
U251 1～3 Need
U87 1～3 Need
293T 1～3 Need
HUVEC-2C 10～30 Need
PC-3 20～40 Need
MDA-MB-
231
10～30 Need
MCF-7 20～40 No
Tca8113 10～30 Need
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RPE 10～30 Need
AGS 100～150 Need
BGC-823 100～150 Need
SGC-7901 10～30 Need
MKN-28 20～40 Need
MKN-45 20～40 Need
BxPc-3 20～40 Need
CFPAC-1 50～80 Need
Panc-1 2～4 Need
HEC-1-B 2～4 Need
NIH-3T3 20～40 Need
Raw264.7 10～30 No
CHO 20～40 Need
HSC-T6 10～30 No
C6 >100 Need
NRK 10～30 Need
Transduction
a. Before infection, virus should be melted on ice gently and resuspended in culture medium.
b. Prepare the virus in 10-fold dilution gradient, and ensure the MOI is within a range of 3 to 1000.
c. Remove the preceding medium and add lentivirus-containing medium with 1/2 volume of normal culture volume.
d. Culture for 4 hours at 37 ℃ , and supplement fresh medium to normal volume. The recommended medium
volume of lentivirus infection is displayed in the following table 3.
e. Refresh the culture medium 24 hours post infection.
Table 3. The recommended medium volume during lentivirus infection.
Culture
dish
Surface
area
Normal volume for cell
culture
1/2 Volume for lentivirus
infection
96-well 0.3 cm2
100 μl 50 μl
24-well 2 cm2
500 μl 250 μl
12-well 4 cm2
1 ml 500 μl
6-well 10 cm2
2 ml 1 ml
Construction of Stable Transgenic Cell Lines
48 hours post infection, change to fresh medium with puromycin. The recommended concentration of puromycin
ranges from 1 to 10 μg/ml according to cell lines. Set the uninfected wild-type cells as control group and add equal
volume and concentration of puromycin. Replace with fresh puromycin-containing medium every 2 or 3 days until
the control group cells die out. Then choose one of the following steps according to experimental requirements.
a. Non-selecting monoclonal cells
Passage the infected cells and select with puromycin constantly. Freeze the cell mixture in continuous three passages.
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Considering the heterogeneity, we recommend selecting monoclonal cell for a confirmed phenotype.
b. Selecting monoclonal cells
Select at least five monoclonal cells after infection and puromycin selection, and propagate in puromycin-containing
medium. Detection the expression of target genes using western blot or qPCR. Choose the stable cell line with
proper expression level of target genes to passage three generations and freeze the stable cell line.
Notes for infection of special cell lines:
1. Suspension cells
We recommend using flat fillet centrifuging transfection to infect suspension cells or semi-suspension cells. Add
virus suspension into cell culture dish, sealing tightly, and centrifuge at low speed of 200g for 1 hour in the flat fillet
centrifuge. Place cells in cell culture incubator after centrifuging transfection. If the flat fillet centrifuge is
inaccessible, you can suspend the cells and transfer cells into centrifuge tubes, followed by low-speed centrifuge,
and discard the most of supernatant. Add virus suspension into the tubes, resuspending cells, place it at room
temperature for 15 min (no more than 30 min), and transfer the cells and virus suspension into plate to culture.
Replace with fresh culture medium the next day.
2. Cells difficult to infect
For cells difficult to infect, like DC cells, we recommend repeated infections. Replace with fresh virus suspension 24
hours after the first infection. Repeated infections can increase the infection efficiency markedly.
3. Non-dividing primary cells
We recommend high-titer adenovirus to infect these cells like BMSC.
References
1. Salgado CD and JM Kilby. (2009). Retroviruses and other latent viruses: the deadliest of pathogens are not necessarily the best candidates for bioterrorism. J
S C Med Assoc 105:104-6.
2. Piguet V, O Schwartz, S Le Gall and D Trono. (1999). The downregulation of CD4 and MHC-I by primate lentiviruses: a paradigm for the modulation of cell
surface receptors. Immunol Rev 168:51-63.
3. Cockrell AS and T Kafri. (2007). Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol 36:184-204.
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Contact Information
Genemedi Biotech. Inc.
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© 2018 Genemedi Biotech. Inc. All rights reserved.
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About GeneMedi
GeneMedi specializes in creating superior antibody, protein, and vector-based
bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions.
At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field
of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of
unparalleled expertise in the following areas:
Innovative Antigen Design and Robust Assay Development
Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens
and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical
and research settings.
Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUSTM for accelerated
antibody discovery and LIBRATM for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize
molecules with optimal stability and functionality.
Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXTTM platform is our answer to the industry's
need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking
gene therapy approaches.
High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale
production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent
quality controls.
Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on
AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification
techniques to guarantee vector efficacy and integrity
Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for
comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic
accuracy.
Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic
antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions
can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry.
Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability
Scalable Production and Uncompromising Quality
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GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics
and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner.
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1
レンチウイルス(Lv)
レンチウイルス
の安全な使用
1. レンチウイルス

2
· 繰り返しの凍結と解凍を避けてください。
· 「通常の」プラスチック(特にポリスチレンまたは疎水性プラスチック)に液相で長期間曝露しないようにして
ください。ほとんどのレンチウイルスウイルスは非常に粘着性があり、冷凍しないとチューブ、細胞培養プレー
ト、ピペット先端などの通常のプラスチックにさらされると損失が発生する可能性があります。レンチウイルス
をシリコン化または低タンパク質結合チューブに保存するのが最善です。配合緩衝液で 0.01%~0.1%で使用する
プラロニック F-68 は、通常のプラスチックを使用すると、付着を最小限に抑えることができます。
· レンチウイルスを低塩溶液に希釈しないようにしてください。一部のレンチウイルスは低塩溶液に凝集し、非
感染性になります。
レンチウイルスの導入
レンチウイルス(lente-、ラテン語では「ゆっくり」の意味)はレトロウイルスの属で、ヒトまたは他の哺乳類種で
長い潜伏期間によって慢性および致命的な疾患を引き起こします [1]。これまでに、それらが関連する脊椎動物の
宿主(霊長類、羊、ヤギ、馬、飼い猫、牛)に基づいて 5 つの血清群が認識されています。その中で、霊長類レンチ
ウイルスは、受容体としての CD4 表面タンパク質の利用とダットパーゼの欠如によって区別されます[2]。HIV-1
由来のレンチウイルスは、大量のウイルス cDNA を宿主ゲノムに統合し、安定かつ長期的な遺伝子トランス発現
を媒介し、分割細胞と非分割細胞に効率的に感染させることができ、レンチウイルスはほとんどの細胞の魅力的な
遺伝子送達手段となります。タイプ[3]。
HIV 由来のレンチウイルスベクターの使用中の重要な安全性の懸念を考慮して、組換えレンチウイルスは設計さ
れ、ほとんどの細胞タイプで遺伝子送達に広く使用されています。遺伝子産物を in vitro システムや動物モデルに
導入するための研究ツールとして、ハイスループット形式での遺伝子発現のダウンレギュレーションまたはアッ
プレギュレーションに大規模な取り組みが行われており、研究者は新規遺伝子トランスジェニック医薬品の発見に
欠かせない疾患モデルシステムにおける遺伝子トランスジェニックの必要性と効果を調べることができます。
今日では、複数世代のレンチウイルスパッケージングシステムが開発されており、その中で第 2 世代レンチウイ
ルスベクターと第 3 世代レンチウイルスベクターが 2 つ最も人気のあるものです。ゲネメディにおける組換えレ
ンチウイルス生産の現在の方法は、3 つのプラスミド（関心遺伝子（GOI）pLv-GOI を含むレンチウイルスシリー
ズプラスミド、エンベロープ発現プラスミド pMD2G、およびパッケージプラスミド pSPAX2）を 293T 細胞に共
トランスフェクションする 3 つのプラスミド共トランスフェクションシステムに基づいています。レンチウイル
スベクターを生成します。
プロトコルの概要
組換えレンチウイルス産生の概略的な概要を図 1 に示します。最初のステップは、関心遺伝子（GOI）をベクター
を含む適切な LTR/MCS にクローンすることです。
前記組換え発現プラスミドは、エンベロープ発現プラスミド pMD2G とパッケージングプラスミド pSPAX2 とが
293T 細胞内に共にトランスフェクションされ、これらが 293T 細胞内のレンチウイルスの複製およびパッケージ
ングに必要なすべてのトランス作用因子を供給する。組換えレンチウイルス粒子は、感染した 293T 細胞から調製
され、その後、さまざまな哺乳類細胞に感染するために使用される可能性があります。
宿主細胞が感染すると、ウイルスゲノム ssRNA を二本鎖 DNA に変換する必要があります。

3
遺伝子発現とウイルス複製。新たに合成された DNA は、他のウイルスタンパク質とともに、統合能力のある核タンパク質複合
体を構成し、宿主細胞核に移動し、宿主クロマチンへのウイルス DNA の統合を媒介します。プロウイルスと名付けられた統合
ウイルス DNA は宿主ゲノムの一部となり、ウイルス mRNA とゲノム RNA の合成のための転写テンプレートとして機能しま
す。ウイルスのゲノムとタンパク質を合成した後、ウイルス成分を組み合わせて新たなウイルスを生成し、ウイルス粒子が宿
主細胞から芽を出し、成熟工程を経て感染性レンチウイルスを生成する。
図 1。レンチウイルスパッケージ実験フローチャート。
実験材料
ウイルス包装システム
このハンドブックでは、組換えレンチウイルス(rLv)のパッケージに 3 プラスミドシステムが使用されており、遺伝子過剰発
現、RNA 干渉、CRISPR/Cas9 遺伝子ノックアウトのためのエンジニアリング配列にクローン可能なレンチウイルスシリーズ
ベクター(pLv)、エンベロープ発現プラスミド pMD2G、およびパッケージプラスミド pSPAX2 を含む。さまざまな実験目的に
適したレンチウイルスベクターの選択方法の詳細については、当社のテクニカルサポートにご相談ください。
細菌株
E.coli 株 dh 5 ɑs はベクターの増幅に使用されます。

4
包装細胞株
293T は、レンチウイルスの初期生産、価検出を容易にすることができるウイルス包装細胞株である。これ
はレンチウイルスの複製に必要な上皮様細胞株であり、合流すると単層に成長します。
293T の完全な成長培地は、10%胎児ウシ血清(FBS)と 1%ペニシリンストレプトマイシン(Pen-Strep)を補
充した Dulbecco の修飾イーグル培地(DMEM)です。連続培養の場合、細胞は適切な特性を維持するために
70%の合流を超えてはいけません。通常、セル通路番号 1 から始めて、30 通路内で最適な結果を得ることが
できます。到達したら、予期せぬ突然変異や不健康な成長の場合に備えて、別の冷凍株から新しい文化を開
始するのが最善です。したがって、実験の完全性と継続性を確保するためには、独自の 293 トンの凍結株を
銀行化することが非常に重要です。対数相で細胞を凍結することで、解凍後の生存性が向上します。
注：細胞をより健康的な状態に維持し、レンチウイルスの生産効率を向上させるために、当社のゲネメディ
抗マイコプラズマ試薬キュレプラスマットを使用することをお勧めします。
その他の材料および試薬
関心のある遺伝
子ポンドスープ
寒天及びアガ
ロースカナマイ
シンアンピシリ
ン
70、100%エタノール
滅菌 PBS
塩素漂白剤
DNA ゲル装置および電源クラス II バイ
オセーフティキャビネット
37℃軌道シェーカー
37℃細菌インキュ
ベーター
37℃、5%CO2 インキュベーター
15、50ml 円錐チューブ
25 cm × 75 cm × 2 の組織培養フラスコ
超遠心分離機(Beckman)または SW28 ローター低速
スイングバケット遠心分離機と同等
微小遠心分離機
遠心管（キャップ付き厚壁ポリカーボネート管）
レンチウイルスの包装と濃度
レンチウイルスのベクター構築
レンチウイルスのパッケージ化の前に、関心のある遺伝子をレンチウイルスベクターに構築する必要があり
ます。ジェネメディには、レンチウイルス-LC3 オートファジーフラックス検出バイオセンサーなど、いく
つかの遺伝子ツールを備えたプレメイドのレンチウイルスベクターグッズがたくさんあります。

5
注意：
ベクターを迅速かつ効率的に構築するためには、genemedi-cloneasytm ワンステップクローニングキット(cat.gm-gc-
01/02/03)を使用することを強くお勧めします。
293T の包装細胞へのウイルスプラスミドのトランスフェクション
a. 10%の FBS と 1%の pen/strep で DMEM で 293T 細胞を増殖させます。トランスフェクションの前日、次の日に細胞が
70〜80%の合流に達するように 10cm の皿に細胞をプレートします。トランスフェクション当日は、3-プラスミド共トラ
ンスフェクションを表 1 に設定する。
b. DMEM は水浴で 37℃に予熱する必要があります。リポゲネットトランスフェクション試薬は暖房する必要があります
使用前に室温にし、使用前に穏やかに混ぜます。10cm 皿のトランスフェクション媒体を、トランスフェクション後 6 時
間後に新鮮な媒体に置換します。
c. 60 mm の皿を使用して各反応のためのウイルスプラスミドを調製する。
表 1。トランスフェクションに必要なプラスミドおよびトランスフェクション試薬。
成分額
pLv-GOI ベクトル 10 μ g
pMD2G 5 μ g
pSPAX2 10 μ g
脂肪遺伝子 100 μ l
d. プラスミドとトランスフェクション試薬を DMEM で混合し、事前播種された 293T 細胞に滴下します。37℃、5%CO2 で
インキュベートし、6 時間で完全な培地でリフレッシュします。
注意：
1. 前記トランスフェクション試薬の詳細なプロトコルは、ゲネメディリポゲネットトランスフェクション試薬使用マニュア
ルを参照することができる。
2. 細胞は、トランスフェクション前に使用するために健康な成長状態である必要があります。
収穫ウイルス
レンティウイルス粒子を含む上澄み液を、トランスフェクション後 48 時間、72 時間後にそれぞれ採取することを特徴とする。
上清を 48 時間で採取した後、新鮮な DMEM 培地を交換します。
ウイルス浄化
a. ウイルスを 2 回回収した後、トランスフェクションした 293T 細胞を廃棄し、回収した上清を 0.45 μ m の濾過膜で超遠心
管に濾過する。
b. 遠心分離装置 72000g で、4℃で 2 時間。
c. 次に、上清を廃棄し、レンチウイルスの堆積物を 500 μ l の新鮮な培地で再停止し、-80℃または液体窒素で長時間保存し
ます。

6
精製レンチウイルスの滴定
蛍光顕微鏡でレンチウイルス価を決定します。
a. 1 日前に 96 井戸プレートに 293T 1 × 10^4 細胞/井戸をシードします。
b. 培地中 100ul の最終体積中で、前記レンチウイルス粒子を 1:10 、 1 ： 100 、 1 ：
1000、1:10^4、1:10^5、1:10^6 に勾配希釈する。
c. 合計 100 μ l のウイルス粒子混合物を各ウェルに添加し、1 ウイルスあたり少なくとも 3 回の複製を
行う必要があります。
d. 感染 2 日後、蛍光顕微鏡を使用して蛍光陽性細胞をカウントし、適切な蛍光陽性割合(10%~30%陽
性細胞/井戸)の希釈因子を選択します。三重細胞を数え、陽性細胞の数を平均します。
e. ウイルス価(TU/ml)=蛍光陽性細胞数× 10 ×希釈の処方を用いてレンチウイルス価を推定する。
標的細胞の伝達
このプロトコルは、ピューロマイシン選択に基づく安定した細胞株構築のためのものです。
注意：
MOI：感染の多数は、1 つの細胞に感染するウイルス粒子の数です。特定の細胞への本物のモイは、さ
まざまなラボでのウイルスへの対処の操作や方法の影響を受ける可能性があるため、モイの最適化テス
トを強くお勧めします。
細胞調製
ロバストターゲット細胞を 1 日前に 1 x 105/ml の密度で 24 ウェルプレートにプレートします。
注意：
植えられた細胞数は、当該細胞株の成長速度に依存することを特徴とする。次の日に 50%から 70%の合
流に達する必要があります。
レンチウイルスのモイ検査
a. ウイルスを 10 倍の希釈勾配で調製し、モイが 3~1000 の範囲内であることを確認します。
b. 日 0：1 × 105/ml の密度で良好な状態のプレートターゲット細胞を 96 ウェルプレートに、1 ウェ
ルあたり 100 μ l にします。一晩 37℃でインキュベートします。

7
c. 1 日目：6 モイ勾配でウイルスを調製し、標的細胞の完全培地中で適量のウイルス懸濁液を最終体積 100 μ l に希釈します
(モイ=3、10、30、100、300、1000 を設定します)。希釈されたウイルスを事前播種細胞に加え、37℃で 4~8 時間イ
ンキュベートし、培地をリフレッシュしてウイルスを除去します。
d. 3 日目：顕微鏡で蛍光を検出します。蛍光セルの比率に基づいて MOI を算出することを特徴とする。
注意：
ウイルスが蛍光標識されていない場合、MOI は qPCR、WB、If、IHC などで決定することができる。
表 2。一般的に使用される細胞株のレンチウイルスモイス。
細胞株モイ範囲補助感染試薬ポリブレン
K562 20～40 必要な
ジュールカット 50～80 いいえ
かすみ；かすみ 10～30 いいえ
NB4 50～80 いいえ
U937 20～40 必要な
THP−1 50～80 必要な
GBC-SD 30～50 いいえ
H929 100～150 いいえ
H1299 1～3 必要な
95D 2～4 必要な
A549 20～40 必要な
SPC-A-1 100～150 必要な
7402 10～15 必要な
ヘプ 3B 10～30 必要な
ヘプ G2 10～30 必要な
SMC-7721 10～30 必要な
うーん 7 10～30 必要な
ヘラ；ヘラ；ヘ
ラ
10～30 必要な
ホス；ホス；ホ
ス
20～40 必要な
肝臓-2 10～30 必要な
HL-60 >100 必要な
HT-29 10～30 必要な
PKO；PKO 2～4 必要な
SW480 10～30 必要な
DLD-1 10～30 必要な
SK-OV-3 2～4 必要な
SHG-44 10～30 必要な
U251 1～3 必要な
U87 1～3 必要な
293T 1～3 必要な
フーベック-2C 10～30 必要な
PC-3 20～40 必要な
MDA-MB- 10～30 必要な
MCF-7 20～40 いいえ
Tca8113 10～30 必要な

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RPE；RPE 10～30 必要な
AGS；AGS 100～150 必要な
BGC-823 100～150 必要な
SGC-7901 10～30 必要な
MKN-28 20～40 必要な
MKN-45 20～40 必要な
BxPc-3 20～40 必要な
CFPAC-1 50～80 必要な
パン 1 2～4 必要な
HEC-1-B 2～4 必要な
ニー-3T3 20～40 必要な
生 264.7 10～30 いいえ
チョー；チョー 20～40 必要な
HSC-T6 10～30 いいえ
C6 >100 必要な
NRK；NRK 10～30 必要な
伝導；伝導
a. 感染する前に、ウイルスを氷の上で穏やかに溶かし、培地に再懸濁させる必要があります。
b. ウイルスを 10 倍の希釈勾配で調製し、モイが 3~1000 の範囲内であることを確認します。
c. 前の培地を除去し、通常の培養量の 1/2 体積のレンチウイルス含有培地を加えます。
d. 37℃で 4 時間培養し、正常な量に新鮮な培地を補給します。レンチウイルス感染の推奨中量を次の表 3 に示
します。
e. 感染後 24 時間後に培地をリフレッシュします。
表 3。レンチウイルス感染時の推奨中量。
文化表面細胞の正常体積レンチウイルス用 1/2 ボリューム
96-ウェル 0.3cm2 100 μ l 50 μ l
24-ウェル 2cm2 500 μ l 250 μ l
12-ウェル 4cm2 1 ml 500 μ l
6-ウェル 10cm2 2 ml 1 ml
安定したトランスジェニック細胞株の構築
感染後 48 時間後、ピューロマイシンで新鮮な培地に変更します。ピューロマイシンの推奨濃度は、細胞株に応じ
て 1~10 μ g/ml の範囲である。未感染の野生型細胞を対照群とし、同等の体積と濃度のピューロマイシンを添加
する。対照群細胞が死滅するまで、2~3 日ごとに新鮮なピューロマイシン含有培地に置き換えます。次に、実験
的要件に応じて次の手順のいずれかを選択します。
a. 非選択モノクローナル細胞
感染した細胞を通過させ、絶えずピューロマイシンで選択します。細胞混合物を連続した 3 つの通路で凍結しま
す。

9
不均一性を考慮して、確認された表現型にモノクローナル細胞を選択することをお勧めします。
b.モノクローナル細胞の選択
感染後、ピューロマイシン選択後、少なくとも 5 個のモノクローナル細胞を選択し、ピューロマイシン
含有培地中で繁殖する、ウェスタンブロットまたは qPCR を用いて標的遺伝子の発現を検出することを
特徴とする。標的遺伝子の発現レベルが適切である安定した細胞株を選択して 3 世代を通過し、安定し
た細胞株を凍結する。
特殊細胞株の感染に関する注意事項：
1. 懸濁細胞
懸濁細胞または半懸濁細胞に感染するために、平板フィレット遠心分離トランスフェクションを使用す
ることをお勧めします。細胞培養皿にウイルス懸濁液を加え、しっかり密封し、平板フィレット遠心分
離機で 200g の低速で 1 時間遠心分離します。遠心トランスフェクション後、細胞培養インキュベー
ターに細胞を置きます。フラットフィレット遠心分離機にアクセスできない場合は、細胞を懸濁させて
遠心分離機チューブに移し、次に低速遠心分離機に移し、上清の大部分を廃棄することができます。
チューブにウイルス懸濁液を加え、細胞を再懸濁させ、室温で 15 分間（30 分以下）置き、細胞とウイ
ルス懸濁液をプレートに移して培養します。翌日新鮮な培地に置き換えます。
2. 感染しにくい細胞
DC 細胞のように感染しにくい細胞には、繰り返し感染することをお勧めします。最初の感染から 24 時
間後に新鮮なウイルス懸濁液に置き換えます。繰り返し感染は感染効率を著しく高める可能性がありま
す。
3. 分裂していない一次細胞
BMSC のようなこれらの細胞に感染するために、高価アデノウイルスをお勧めします。
参照
1. サルガド CD と JM キルビー。(2009).レトロウイルスやその他の潜在ウイルス：最も致命的な病原体は必ずしもバイオテロリズムの最良の
候補であるわけではありません。J S C Med Assoc 105：104-6。
2. ピゲ・V、オ・シュワルツ、スレ・ガル、ド・トロノ。(1999).霊長類レンチウイルスによる CD4 および MHC-I のダウン調節：細胞表面受
容体の調節のためのパラダイム。イムノール Rev 168：51-63。
3. コックレルアスと T カフリ。(2007).レンチウイルスベクターによる遺伝子送達。Mol Biotechnol 36：184-204。

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連絡先情報
ジェネメディバイオテクノロジー。株式会社。
レンチウイルスの詳細については、www.genemedi.net/i/lentivirus-packaging をご覧ください。
genemedi 製品の詳細および PDF 形式のマニュアルをダウンロードするには、当社の web サイト：
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렌티바이러스
렌티바이러스(Lv) 안전한 사용
1. 렌티바이러스(Lv) 관련 실험은 생물 안전 2 급 시설(bl-2 급) 내에서 진행되어야 한다.
2. 실험실 코트, 마스크, 장갑을 완전히 갖추고 손과 팔을 노출하지 않도록 최선을 다해 주십시오.
3. 바이러스 현액을 뿌리지 않도록 조심하세요. 만약 생물 안전 캐비닛이 작동 중에 바이러스에 오염되면, 즉시
70% 알코올과 1% sds 를 포함한 용액으로 탁자 보드를 닦아라. 모든 첨단, 튜브, 배양판, 바이러스와 접촉하
는 매질은 폐기하기 전에 염소를 함유한 소독액에 담그어야 한다.
4. 원심분리가 필요하다면 원심분리기 튜브를 단단히 밀봉해야 한다. 조건이 허용되면 원심분리하기 전에 파라
필름으로 튜브를 밀봉합니다.
5. 렌티바이러스와 관련된 동물 실험도 bl-2 수준에서 진행되어야 한다.
6. 렌티바이러스와 관련된 폐기물은 처리하기 전에 특별히 수집하고 자제해야 한다.
7. 실험 후 세정제로 손을 씻어라.
렌티바이러스의 저장 및 희석
렌티바이러스 저장
바이러스는 수신 후에 사용하기 전에 짧은 시간 (일주일 미만)에 4 ° c 에서 저장될 수 있습니다. 렌티바이러스
는 냉동-해동에 민감하며, 반복적인 냉동-해동에 따라 적량이 떨어지기 때문에, 알리코트 바이러스 재고는 도착
하면 즉시 -80°C 냉동고에 보관하여 장기간 사용해야 한다. 만약 렌티바이러스가 12 개월 이상 저장되어 있다
면, 사용하기 전에 바이러스 적정을 재검사하는 것이 좋다.
렌티바이러스 희석
바이러스 희석이 필요하다면 바이러스를 얼음물에 용해시킨다. 용해한 후, 바이러스를 중간, 무균 pbs 또는 생
리식염수 용액과 섞어, 4°C 에서 유지하십시오 (일주일 이내에 사용하십시오).
주의사항
· 렌티바이러스가 환경적으로 극단적인 환경(pH, edta 와 같은 킬레이트제, 온도, 유기용매, 단백질 변성제,
강한 세제 등)에 노출되는 것을 피합니다.
· 소용돌이, 거품 불기 또는 유사한 작업 중에 렌티바이러스 샘플에 공기를 도입하는 것을 피하십시오. 이는
단백질 변성을 초래할 수 있다.

2
· 반복적인 얼음과 해동을 피하세요.
· 액상에서 장기간 '일반적' 플라스틱(특히 폴리스티렌이나 소수성 플라스틱)에 노출되지 않도록 하십시오. 대부분의 렌티바이
러스 바이러스는 매우 끈적끈적하며, 파이프, 세포 배양 판, 피펫 끝을 포함한 일반적인 플라스틱에 노출되면 손실이 발생할 수 있
다. 렌티바이러스를 실리콘화되거나 낮은 단백질 결합관에 저장하는 것이 좋다. Pluronic f-68 은 0.01%-0.1%의 배합 완충기에
서 사용되는 일반적인 플라스틱을 사용하는 경우 점착을 최소화합니다.
· 렌티바이러스를 저염용액으로 희석시키는 것을 피하세요. 일부 렌티바이러스는 저염용액에 모여 전염성이 없다.
렌티바이러스의 도입
렌티바이러스(lente-, 라틴에서 "느리다"는 뜻)는 인간이나 다른 포유동물의 긴 잠복기로 만성적이고 치명적인 질병을 유발하는
레트로바이러스의 속이다. 지금까지 5 개의 혈청군(영장류, 양과 염소, 말, 가정고양이, 소)과 관련된 척추동물의 숙주에 따라 인
식되었다. 그 중 영장류 렌티바이러스는 cd4 표면 단백질을 수용체로 이용하고 Dutase 의 부재로 구별된다 [2]. HIV-1 에서 유래
된 렌티바이러스는 상당한 양의 바이러스 cdna 를 숙주 게놈에 통합하여 안정적이고 장기적인 유전자 전환 발현을 매개하고 분할
세포와 비분할 세포에 효율적으로 감염시켜 렌티바이러스를 대부분의 세포 유형에서 매력적인 유전자 전달 수단으로 만들 수 있
다 [3].
HIV 유래형 렌티바이러스 매개체를 사용하는 과정에서 중요한 안전성 문제를 고려하여 재조합 렌티바이러스는 대부분의 세포 유
형에서 유전자 전달에 널리 사용되고 설계되었다. 유전자 제품을 체외 시스템이나 동물 모델에 도입하는 연구 도구로서, 렌티바이
러스 매개체는 고처리량 형식으로 유전자 발현을 하향 조절하거나 상향 조절하기 위해 대규모 노력에 투입되어 연구자들이 질병
모델 시스템에서 유전자 변환의 필요성과 효과를 검사할 수 있도록 하였는데, 이는 새로운 유전자 변환 약물을 발견하는 데 없어
서는 안 될 것이다.
오늘날 몇 세대의 렌티바이러스 포장 시스템이 개발되었는데, 그 중 제 2 세대 렌티바이러스 매개체와 제 3 세대 렌티바이러스 매
개체가 가장 인기있는 두 가지이다. 현재 genemedi 에서 재조합 렌티바이러스를 생산하는 방법은 3 개의 플라스미드 공동 전염
시스템을 기반으로 하여 3 개의 플라스미드(관심 유전자(GOI) pLv-GOI, 봉투 표현 플라스미드 pmd2g 및 포장 플라스미드
pspax2)를 293t 세포로 공동 전염시켜 렌티바이러스 매개체를 생성한다.
프로토콜 개요
재조합 렌티바이러스 생산에 대한 구조적 개요는 그림 1 과 같다. 첫 번째 단계는 관심 유전자(GOI)를 매개체가 포함된 적절한
ltr/mcs 로 복제하는 것이다.
재조합 발현 질립은 293t 세포로 공동으로 전염되며, 포장된 질립 pmd2g 와 포장된 질립 pspax2 는 293t 세포에서 렌티바이러
스의 복제와 포장에 필요한 모든 트랜스작용 인자를 공급한다. 재조합 렌티바이러스 입자는 감염된 293t 세포에서 제조되고 다양
한 포유류 세포에 감염되는 데 사용될 수 있다.
숙주 세포에 감염되면 바이러스 게놈 ssrna 는 이중 체계 DNA 로 전환되어야 합니다.

3
유전자 발현과 바이러스 복제. 새로 합성된 dna 는 다른 바이러스 단백질과 함께 통합할 수 있는 핵단백질 복합체를 구성하여 숙
주 세포 핵으로 이동하고 바이러스 dna 가 숙주 염색질에 통합되도록 매개한다. 통합 바이러스 DNA 는 프로바이러스로 명명되어
숙주 게놈의 일부가 되며 바이러스 mrna 와 게놈 rna 의 합성을 위한 전사 템플릿이 된다. 바이러스 게놈과 단백질이 합성된 후,
바이러스 성분이 함께 조립되어 새로운 바이러스를 생성하고, 바이러스 입자는 숙주 세포에서 싹을 틔우고, 성숙한 단계를 거쳐
전염성 렌티바이러스를 생성한다.
그림 1. 렌티바이러스 포장 실험 흐름도
실험 재료
바이러스 포장 시스템
이 매뉴얼은 유전자 과발현, rna 간섭 및 crispr/cas9 유전자 토너먼트를 위한 엔지니어링 서열로 복제할 수 있는 렌티바이러스
계열 매개체(pLv), 봉투 표현 플라즈드 pmd2g 및 포장 플라즈드 pspax2 를 포함한 재조합 플라즈드 시스템을 사용한다. 다른
실험 목적에 적합한 렌티바이러스 매개체를 선택하는 방법에 대한 자세한 내용은 기술 지원에 문의하십시오.
박테리아 주
대장주 dh5 는 벡터의 증폭에 사용된다.

4
포장 세포 라인
293t 는 렌티바이러스의 초기 생산, 적사 검사를 용이하게 할 수 있는 바이러스 포장 세포계이다. 그것은 렌티바이러스의 복제에 필요한 상피 모
양의 세포계이며, 합류할 때 단층으로 자란다.
293t 의 완전한 성장 배양기는 돌베코 개식 독수리 배양기(DMEM)가 10% 태소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트레프트마이신(펜-스트레프)을 보
충한다. 지속적인 배양의 경우, 세포는 적절한 특성을 유지하기 위해 70%의 합류를 초과해서는 안 된다. 일반적으로 세포 통행 번호부터 시작하
면 30 개 통행 이내에 최적의 결과를 얻을 수 있다. 일단 도달하면 예상치 못한 돌연변이와 불건강한 성장이 발생할 경우 다른 냉동 주식에서 새로
운 문화를 시작하는 것이 가장 좋다. 따라서 자신의 293t 의 동결 주식을 은행하는 것은 실험의 무결성과 연속성을 보장하는 데 매우 중요하다. 대
수 단계의 세포를 얼어붙이면 해동 후의 생존력이 향상된다.
참고: 세포를 더 건강하게 유지하고 렌티바이러스의 생산 효율을 높이기 위해, 우리의 genemedi 항 mycoplasma 시약인 cureplasmatm 를 사
용하는 것이 좋습니다.
기타 재료 및 시약
관심 유전자 파운드 수
프
석가와 석가로스 카나
마이신 암피실린
70 및 100% 에탄올 무균
pbs
염소 표백제
dna 젤기구 및 전원 공급 장치 II 등급 생물안전장
37℃ 궤도 흔들기 37℃ 박테
리아 부화기
37℃, 5% CO2 인큐베이터
15ml 및 50ml 원추관
25cm2 및 75cm2 조직 배양 병리
초원심분리기(Beckman) 또는 sw28 로터 저속 스윙-버킷 원심분리기
와 동등한
마이크로 원심기
원심분리관 (뚜껑이 있는 두벽 폴리카보네이트 튜브)
렌티바이러스의 포장 및 농도
렌티바이러스의 매개체 구축
렌티바이러스를 포장하기 전에 관심있는 유전자는 렌티바이러스 매개체로 구축되어야 한다. genemedi 는 렌티바이러스-lc3 자가식용 흐름 검사
생물센서 등과 같은 유전자 도구를 가지고 있는 사전 제작된 렌티바이러스 매개체물을 많이 보유하고 있다.

5
참고:
벡터를 빠르고 효율적으로 구축하기 위해 genemedi-cloneasytm 1 단계 복제 키트(cat.gm-gc-01/02/03)를
사용하는 것이 강력하다.
바이러스 플라스미드를 293t 포장세포로 전염시키다
a. Dmem 에서 293t 세포를 10%의 fbs 및 1%의 pen/strep 으로 번성한다. 전염되기 전날, 세포가 다음날
70-80%의 합류에 도달하도록 10cm 접시에 세포를 접시한다. 전염당일, 3-플라스미드 공동전염을 표 1 로
설정한다.
b. dmem 는 물욕과 37 ℃까지 사전 가열되어야 합니다. lipogenetm 전염 시약은 따뜻해야합니다.
사용하기 전에 실온에 도달하고 사용하기 전에 가볍게 섞어라. 전염 후 6 시간 동안 10cm 접시의 전염 매
질을 신선한 매질로 교체한다.
c. 60mm 접시를 사용하여 각 반응에 대해 바이러스 플라스미드를 준비합니다.
표 1. 전염에 필요한 플라스미드와 전염시약
구성 요소 금액
plv-goi 벡터 10μg
pMD2G 5μg
pSPAX2 10μg
지방 제품 100μl
d. 플라즈미드와 전염 시약을 dmem 에서 혼합하고, 사전 파종된 293t 세포에 방울을 첨가한다. 37℃, 5%의
CO2 에서 부화하고 6 시간 동안 완전한 배양체로 새로워한다.
참고:
1. 상기 전염 시약의 상세한 프로토콜은 genemedi lipogenetm 전염 시약 사용자 설명서를 참조할 수 있다.
2. 세포는 전염되기 전에 사용하기 위해 건강한 성장 상태에 있어야 한다.
수확 바이러스
전염된 후 각각 48 시간과 72 시간 후에 렌티바이러스 입자를 함유한 상청액을 채취한다. 48 시에 상청액을 채
취한 후 신선한 dmem 배양체를 교체한다.
바이러스 정화
a. 바이러스를 두 번 채취한 후, 전염된 293t 세포를 버리고 0.45μm 필터막으로 채취한 상청액을 초원심기
튜브에 여과한다.
b. 4℃에서 2 시간 동안 72000g 에 원심분리기.
c. 그런 다음 상청액을 버리고 500μl 의 신선한 매질로 렌티바이러스의 퇴적을 다시 중단하고 -80℃ 또는 액
체 질소에서 장시간 저장한다.

6
순화된 렌티바이러스의 적정
형광 현미경으로 렌티바이러스의 적사를 측정한다.
a. 하루 전에 96 정 판에 293t 1×10^4 세포/정을 넣어라.
b. 렌티바이러스 입자를 배양기에서 100ul 의 최종 부피에서 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10^4, 1:10^5, 1:10^6 로 그라데이션
으로 희석시킨다.
c. 모든 우물에 100μl 바이러스 입자 혼합물을 첨가하여 바이러스당 적어도 3 개의 복제를 사용해야 한다.
d. 감염 후 이틀 후에 형광 현미경을 이용하여 형광 양성 세포를 계산하고 적절한 형광 양성 비율(10%-30% 양성 세포/우물)의
희석 인자를 선택한다. 세 개의 세포를 세고 양성 세포의 수를 평균적으로 계산합니다.
e. 다음과 같은 공식을 사용하여 렌티바이러스 적사를 추정한다. 바이러스 적사(TU/ml)=형광 양성 세포의 수×10×희석이다.
표적 세포의 전도
이 프로토콜은 푸로마이신 선택에 기반한 안정적인 세포계 구축을 위한 것이다.
주의:
MOI: 감염의 다중성은 하나의 세포에 감염되는 바이러스 입자의 수이다. 특정 세포에 대한 실제 moi 는 다른 실험실에서 바이러
스를 처리하는 조작과 방법에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 moi 의 최적화 테스트를 강력히 권장한다.
세포 준비
강력한 표적 세포를 하루 전에 1x105/ml 의 밀도로 24 정 플레이트로 만듭니다.
참고:
심은 세포의 수는 관련 세포계의 성장속도에 따라 달라진다. 다음날 50~70%의 합류에 도달해야 한다.
렌티바이러스 moi 검사
a. 바이러스를 10 배의 희석 그라데이션으로 준비하고 moi 가 3 에서 1000 의 범위 내에 있도록 보장한다.
b. 제 0 일: 1×105/ml 의 밀도로 양호한 상태의 플레이트 표적 세포가 96 개의 플레이트로 들어가고, 1 개의 플레이트당 100μl
이다. 하룻밤 사이에 37℃에서 부화한다.

7
c. 1 일: 6moi 그라데이션으로 바이러스를 준비하고, 표적 세포의 완전한 배양기에서 적당량의 바이러스 현탁액을
100μl 의 최종 부피로 희석시킨다(moi=3, 10, 30, 100, 300, 1000 을 설정한다). 희석된 바이러스를 사전 파
종된 세포에 넣고 37℃에서 4~8 시간 동안 부화한 다음 매질을 새로워하여 바이러스를 제거한다.
d. 3 일: 현미경으로 형광을 검사합니다. 형광 세포의 비율에 따라 moi 를 계산합니다.
참고:
만약 바이러스가 형광 표지가 없다면, moi 는 qpcr, WB, IF, IHC 등으로 측정할 수 있다.
표 2. 일반적으로 사용되는 세포계의 렌티바이러스 모이스
세포 줄기 moi 범위 보조감염 시약 폴리브렌
K562 20～40 필요
주르 카트 50～80 아니요
카스미 10～30 아니요
NB4 50～80 아니요
U937 20～40 필요
THP-1 50～80 필요
GBC-SD 30～50 아니요
H929 100～150 아니요
H1299 1～3 필요
95D 2～4 필요
A549 20～40 필요
SPC-A-1 100～150 필요
7402 10～15 필요
헤프 3b 10～30 필요
헤프 g2 10～30 필요
SMMC-7721 10～30 필요
어 -7 10～30 필요
헬라 10～30 필요
호스 20～40 필요
간-2 10～30 필요
HL-60 >100 필요
HT-29 10～30 필요
PKO 2～4 필요
SW480 10～30 필요
DLD-1 10～30 필요
SK-OV-3 2～4 필요
SHG-44 10～30 필요
U251 1～3 필요
U87 1～3 필요
293T 1～3 필요
HUVEC-2C 10～30 필요
PC-3 20～40 필요
MDA-MB- 10～30 필요
MCF-7 20～40 아니요
Tca8113 10～30 필요

8
RPE 10～30 필요
AGS 100～150 필요
BGC-823 100～150 필요
SGC-7901 10～30 필요
MKN-28 20～40 필요
MKN-45 20～40 필요
BxPc-3 20～40 필요
CFPAC-1 50～80 필요
Panc-1 2～4 필요
HEC-1-B 2～4 필요
NIH-3T3 20～40 필요
원료 264.7 10～30 아니요
CHO 20～40 필요
HSC-T6 10～30 아니요
C6 >100 필요
NRK 10～30 필요
전도
a. 바이러스는 감염되기 전에 얼음에 부드럽게 녹이고 배양기에 다시 부유해야 한다.
b. 바이러스를 10 배의 희석 그라데이션으로 준비하고 moi 가 3 에서 1000 의 범위 내에 있도록 보장한다.
c. 앞의 배양기를 제거하고 정상적인 배양량의 1/2 부피의 렌티바이러스를 함유한 배양기를 첨가한다.
d. 37℃에서 4 시간 동안 문화, 그리고 정상적인 양에 신선한 매체를 보충합니다. 렌티바이러스 감염의 권장 중간 양은 아래 표
3 에 표시됩니다.
e. 감염 후 24 시간 배양 매질을 새로 고치십시오.
표 3. 렌티바이러스 감염 시 권장 중간 용량
문화 표면 셀의 정상 부피 렌티바이러스의 1/2 볼륨
96 -정 0.3cm2 100 μl 50 μl
24 -응 2cm2 500 μl 250 μl
12 -응 4 센티미터 2 1ml 500 μl
6 -응 10cm2 2ml 1ml
안정적인 유전자 변형 세포계 구축
감염 후 48 시간, 푸로마이신과 신선한 매체로 바꾸세요. 포로마이신의 권장 농도는 세포계에 따라 1~10μg/ml 이다. 감염되지
않은 야생형 세포를 대조군으로 설정하고 같은 부피와 농도의 푸로마이신을 첨가한다. 대조군 세포가 사라질 때까지 2~3 일마다
신선한 푸로마이신을 함유한 매질로 교체한다. 그런 다음 실험 요구에 따라 다음 단계 중 하나를 선택합니다.
a. 단일클론세포를 선택하지 않습니다.
감염된 세포를 통과시키고 끊임없이 푸로마이신으로 선택한다. 세포 혼합물을 연속 세 단계로 동결시킨다.

9
이질성을 고려하여, 우리는 단일 클론 세포를 선택하여 확인된 표형을 선택할 것을 권장한다.
b. 단일클론세포 선택
감염과 푸로마이신을 선택한 후 적어도 5 개의 단일클론세포를 선택하여 푸로마이신을 함유한 배양기에서
번식한다. 웨스턴 블로트 또는 qpcr 를 사용하여 표적 유전자의 발현을 검사한다. 표적 유전자의 발현 수
준이 적절한 안정된 세포계를 선택하여 3 세대를 전승하고 안정된 세포계를 동결한다.
특수 세포주 감염에 관한 주석:
1. 현상 세포
우리는 부유세포나 반부유세포를 감염시키기 위해 평면 필레 원심분리를 사용하는 것을 권장한다. 세포
배양 접시에 바이러스 현탁액을 첨가하여 밀봉하고 200g 의 저속 원심분리기에서 1 시간 동안 원심분리
한다. 원심으로 전염된 후 세포를 세포 배양 인큐베이터에 넣는다. 평평한 필레 원심분리기가 접근할 수
없다면, 당신은 세포를 중단하고 원심분리기 튜브로 전송할 수 있으며, 그 다음에 저속 원심분리기와 상청
액의 대부분을 버릴 수 있습니다. 튜브에 바이러스 부유액을 넣고 세포를 다시 부유시키고, 상온에서 15
분(30 분을 초과하지 않음) 두고, 세포와 바이러스 부유액을 판에 옮겨 배양한다. 다음날 신선한 배양식으
로 교체하세요.
2. 감염되기 어려운 세포
DC 세포와 같은 감염이 어려운 세포의 경우 반복적인 감염을 권장합니다. 첫 번째 감염 후 24 시간 후에 신
선한 바이러스 현액으로 교체하세요. 반복적인 감염은 감염의 효율성을 현저히 높일 수 있다.
3. 분할되지 않은 1 차 세포
우리는 bmsc 와 같은 세포에 감염시키기 위해 높은 적정 아데노바이러스를 권장한다.
참조
1. 살가도 CD 와 jm kilby. (2009). 레트로바이러스와 다른 잠재적 바이러스: 가장 치명적인 병원체는 반드시 바이오 테러리즘의 가장 좋은 후보
는 아니다. J S C Med Assoc 105:104-6.
2. Piguet V, O Schwartz, s le gall, d trono. (1999). 영장류 렌티바이러스에 의한 cd4 와 mhc-i 의 하방 조절: 세포 표면 수용체를 조절하는 패
러다임. 면역 168:51-63.
3. 코크렐과 트카프리. (2007). 렌티바이러스 매개체에 의한 유전자 전달. 몰바이오테크놀로지 36:184-204.

10
9
연락처 정보
제네메디 바이오테크놀로지 Inc.
렌티바이러스에 대한 자세한 내용은 www.genemedi.net/i/lentivirus-packaging 를 참조하십시오.
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1
лентивирус
безопасное использование лентивируса (Lv)
1. Эксперименты, связанные с лентивирусом (Lv), должны проводиться на объектах уровня биобезопасности 2
(уровень bl-2).
2. пожалуйста, полностью оснастите лабораторное пальто, маску, перчатки и старайтесь избежать обнажения рук и
рук.
3. Будьте осторожны, чтобы брызгать вирусную суспензию. Если шкаф биобезопасности заражен вирусом во
время эксплуатации, немедленно вытерьте стол раствором, содержащим 70% спирта и 1% SDS. Перед
утилизацией все наконечники, трубки, культуральные пластины, контактные среды вируса должны быть
замочены хлорсодержащим дезинфицирующим раствором.
4. Если необходимо центрифугировать, трубка центрифуги должна быть плотно герметизирована. Если позволяют
условия, закройте трубку парапленкой перед центрифугом.
5. Эксперименты на животных, связанные с лентивирусом, также должны проводиться на уровне bl-2.
6. Отходы, связанные с лентивирусом, должны быть специально собраны и автоклавированы перед утилизацией.
7. После эксперимента мыть руки дезинфицирующим средством.
хранение и разбавление лентивируса
хранение лентивируса
Вирус может храниться при температуре 4 ° C в течение короткого времени (менее недели), прежде чем его
использовать после приема. Поскольку лентивирусы чувствительны к замораживанию-оттаиванию, а титр
снижается при повторном замораживании-оттаивании, аликот вирусный запас следует хранить при морозильной
камере -80 °C сразу по прибытии для длительного использования. в то время как перед использованием
рекомендуется повторное обнаружение титра вируса, если лентивирусы хранятся более 12 месяцев.
разбавление лентивируса
растворите вирус в ледяной воде, если необходимо разбавление вируса. После растворения смешайте вирус с
средой, стерильным PBS или физиологическим раствором при температуре 4 ° C (используйте в течение недели).
меры предосторожности
· избегайте воздействия лентивируса на экстремальные условия окружающей среды (pH, хелатирующие агенты,
такие как edta, температура, органические растворители, белковые денатуранты, сильные моющие средства и т. д.)
· избегайте ввода воздуха в образцы лентивируса во время вихревых, пузырьковых пузырьков или аналогичных
операций, что может привести к денатурации белка.

2
· Избегайте повторного замораживания и оттаивания.
· избегайте воздействия «обычных» пластиков (особенно полистирола или гидрофобных пластиков) в течение
длительного периода времени в жидкой фазе. большинство вирусов лентивируса очень липкие и могут возникнуть
потери при воздействии обычного пластика, включая трубки, пластины для культивирования клеток, кончики пипетки,
если они не заморожены. Лентивирус лучше хранить в кремнизированных или низкобелковых связывающих трубках.
Плюроник f-68, используемый при 0,01%-0,1% в буфере для формулы, минимизирует приклеивание при использовании
обычного пластика.
· избегайте разбавления лентивируса в раствор с низким содержанием соли. некоторые лентивирусы собираются в
низкосолевом растворе, который будет неинфекционным.
введение лентивируса
Лентивирус (ленте-, латинский означает «медленный») — род ретровирусов, вызывающих хронические и смертельные
заболевания из-за длительных инкубационных периодов у человека или других видов млекопитающих [1]. на
сегодняшний день 5 серогрупп были распознаты по хозяевам позвоночных животных, с которыми они связаны
(приматы, овцы и козы, лошади, домашние кошки и крупный рогатый скот). среди них приматные лентивирусы
отличаются использованием поверхностного белка cd4 в качестве рецептора и отсутствием дутпазы [2]. Лентивирусы,
полученные от ВИЧ-1, могут интегрировать значительное количество вирусной КДНК в геном хозяина, опосредовать
стабильную и долгосрочную трансгенную экспрессию и эффективно заражать делящиеся и неделящиеся клетки, что
делает лентивирус привлекательным средством доставки генов в большинстве клеток. типы [3].
учитывая ключевые проблемы безопасности при использовании векторов лентивируса, полученных от ВИЧ,
рекомбинантный лентивирус был разработан и широко используется для доставки генов в большинстве типов клеток. В
качестве исследовательского инструмента, используемого для внедрения генного продукта в системы in vitro или
модели на животных, лентивирусный вектор был вложен в крупномасштабные усилия по снижению или повышению
регулирования экспрессии генов в высокопропускных форматах, позволяя исследователям изучить необходимость и
влияние трансгенов в системах моделей заболеваний, что является незаменимым элементом для открытия новых
трансгенных лекарств.
В настоящее время разрабатывается несколько поколений систем упаковки лентивируса, среди которых вектор
лентивируса второго поколения и вектор лентивируса третьего поколения являются двумя наиболее популярными.
Текущий метод производства рекомбинантного лентивируса в генемеди основан на системе ко-трансфекции трех
плазмид, включающей ко-трансфекцию трех плазмид (плазмида серии лентивирусов, содержащей интересованный ген
(GOI) pLv-GOI, экспрессирующую плазмиду конверта pmd2g и упаковочную плазмиду pspax2) в клетки 293 т для
генерации лентивирусных векторов.
обзор протокола
схематический обзор производства рекомбинантного лентивируса показан на рисунке 1. первым шагом является
клонирование интересующего гена (GOI) в соответствующий ltr/mcs, содержащий векторы.
рекомбинантная экспрессионная плазмида котрансфицируется в клетки 293 т с экспрессионной плазмидой pmd2g и
упаковочной плазмидой pspax2, которые вместе обеспечивают все факторы транс-действия, необходимые для
репликации и упаковки лентивируса в клетках 293 т. Частицы рекомбинантного лентивируса готовятся из зараженных
293т клеток, а затем могут быть использованы для заражения различных клеток млекопитающих.
После заражения клеточ-хозяина ssrna генома вируса следует преобразовать в двухцепочечную ДНК, чтобы

3
экспрессия генов и репликация вируса. вместе с другими вирусными белками недавно синтезированная ДНК
образует компетентный для интеграции нуклеопротеиновый комплекс, мигрирующий в ядро клеток-хозяина
и опосредующий интеграцию вирусной ДНК в хроматин хозяина. интегрированная вирусная ДНК, названная
провирусом, становится частью генома хозяина и служит транскрипционным шаблоном для синтеза
вирусной мРНК и геномной РНК. После синтеза вирусных геномов и белков вирусные компоненты
собираются вместе для получения новых вирусов, затем частицы вируса зародываются из клетки-хозяина и
проходят этап созревания для генерации инфекционного лентивируса.
рисунок 1. блок-схема эксперимента по упаковке лентивируса.
экспериментальные материалы
система упаковки вирусов
В этом руководстве используется система с тремя плазмидами для упаковки рекомбинантного лентивируса
(rLv), которая включает в себя вектор серии лентивирусов (pLv), который можно клонировать в инженерные
последовательности для сверхэкспрессии генов, интерференции РНК и нокаутов генов crispr/cas9,
конвертную экспрессионную плазмиду pmd2g и упаковочную плазмиду pspax2. Для получения
дополнительной информации о том, как выбрать правильный вектор лентивируса для различных
экспериментальных целей, пожалуйста, обратитесь в нашу техническую поддержку.
бактериальный штамм
Штамм e.coli dh5ɑиспользуется для амплификации векторов.

4
линия упаковочных ячеек
293t-это клеточная линия упаковки вируса, которая может облегчить первоначальное производство и
обнаружение титра лентивируса. это эпителиально-подобная клеточная линия, необходимая для репликации
лентивируса, и при слиянии вырастает в монослой.
Полной средой для роста 293 т представляет собой модифицированную орлиную среду Дулбекко (дмем),
добавленную 10% плодной бычьей сывороткой крови (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином (пен-
стрептомицин). для непрерывной культуры клетки не должны превышать 70% слияния для поддержания
надлежащих характеристик. обычно, начиная с клеточного прохода номер один, оптимальные результаты можно
получить в течение 30 проходов. после достижения лучше начать новую культуру из другого замороженного
запаса на случай каких-либо неожиданных мутаций и нездорового роста. поэтому банкирование собственных 293
тонн замороженных акций очень важно для обеспечения экспериментальной целостности и преемственности.
замерзшие клетки на логарифмической фазе повысят жизнеспособность после оттаивания.
Примечание. Для поддержания клеток в более здоровом состоянии и повышения эффективности производства
лентивируса рекомендуется использовать наш антимикоплазменный реагент генемеди cureplasmatm.
другие материалы и реагенты
Интересный ген
фунт бульон
агар и агароза
канамицин
ампициллин
70 и 100% этаноловый
стерильный pbs
хлорный отбеливатель
Гелевые аппараты и источники питания
ДНК шкафы биобезопасности II класса
37 орбитальный
℃
шейкер 37℃
инкубатор бактерий
37 , 5% инкубатор CO2
℃
Конические трубки 15 и 50 мл
Колбы для культивирования тканей 25 и 75 см2
ультрацентрифуга (бекман) или эквивалент с
низкоскоростной центрифугой с качанием с ротором
sw28
микроцентрифуга
центрифужная труба (толстостенная поликарбонатная труба с крышкой)
упаковка и концентрация лентивируса
векторная конструкция лентивируса
перед упаковкой лентивируса гены, представляющие интерес, должны быть построены в лентивирусный вектор.
У genemedi есть множество предварительно готовых товаров для переносчиков лентивируса с некоторыми
генетическими инструментами, такими как биосенсоры для обнаружения аутофагического потока лентивирус-lc3
и т. Д.

5
Примечание:
Для быстрого и эффективного построения векторов настоятельно рекомендуется использовать комплект
одноступенчатого клонирования genemedi-cloneasytm (Cat. GM-GC-01/02/03).
трансфекция вирусных плазмид в упаковочные клетки 293 т
a. размножаются 293 т клеток в dmem с 10% fbs и 1% пен/стреп. за день до трансфекции разложите клетки в
тарелку диаметром 10 см таким образом, чтобы на следующий день клетки достигли 70–80% слияния. в
день трансфекции установите 3-плазмидную ко-трансфекцию в качестве таблицы 1.
b. Дмем необходимо предварительно нагреть до 37 с водяной ванной. Реагент для трансфекции
℃
липогенетма нуждается в разогреве
Перед использованием до комнатной температуры и аккуратно перемешивать перед использованием.
заменить среду для трансфекции тарелки 10 см свежей средой через 6 часов после трансфекции.
c. приготовить вирусные плазмиды для каждой реакции с использованием 60 мм тарелки:
таблица 1. Плазмиды и трансфекционные реагенты, необходимые для трансфекции.
компонент, компонент сумма суммы
вектор plv-goi 10 мкг
ПМД 2 г 5 мкг
ПСПАК 2 10 мкг
липогенетм 100 мкл
d. смешайте плазмиды с трансфекционным реагентом в dmem и добавьте капли в предварительно
посеянные клетки 293 т. Инкубируйте при 37 , 5% CO2 и освежите полной средой в течение 6 часов.
℃
1. Подробный протокол трансфекционного реагента можно ссылаться на руководство пользователя
трансфекционного реагента genemedi lipogenetm.
2. клетки должны находиться в здоровом состоянии роста для использования до трансфекции.
вирус сбора урожая
собрать супернатант, содержащий частицы лентивируса, через 48 и 72 часа после трансфекции
соответственно. Замените свежую среду dmem после сбора супернатанта через 48 часов.
очистка вируса
a. после дважды сбора вируса выбросите трансфекцированные клетки 293 т и фильтруйте собранный
супернатант фильтрующей мембраной 0,45 мкм в ультрацентрифужную трубку.
b. Центрифуга при 7 ~ 2000 г при 4 в течение 2 часов.
℃
c. затем выбросите супернатанты и повторно приостановите отложение лентивируса 500 мкл свежей среды
и храните при -80 или в жидком азоте в течение длительного времени.
℃

6
титрение очищенного лентивируса
определить титр лентивируса с помощью флуоресцентной микроскопии.
a. семя 293 т 1 × 10^4 клетки/скважины в 96-скважинной пластине за день до.
b. выполнить градиентное разбавление лентивирусных частиц до 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10^4, 1:10^5, 1:10^6
в конечном объеме 100 мкл в среде культуры.
c. Всего 100 мкл смеси вирусных частиц следует добавлять в каждую скважину по меньшей мере 3
репликации на вирус.
d. через два дня после заражения подсчитайте флуоресцентно-положительные клетки с помощью
флуоресцентной микроскопии и выберите коэффициент разбавления с соответствующим флуоресцентно-
положительным соотношением (10%–30% положительных клетки/колодца). подсчитайте тройники и
усредните количество положительных клеток.
e. оцените титр лентивируса, используя следующую формулу: вирусный титр (ту/мл) = количество
флуоресцентно-положительных клеток × 10 × разбавление.
трансдукция целевых клеток
этот протокол предназначен для стабильного построения клеточной линии на основе выбора пуромицина.
MOI: множество инфекций — это количество вирусных частиц, заражающих одну клетку. Настоятельно
рекомендуется оптимизировать тест мои, поскольку на настоящий мои определенных клеток могут
влиять операции и методы борьбы с вирусами в разных лабораториях.
клеточная подготовка
пластины прочные клетки-мишени в 24-скважинные пластины с плотностью 1 x 105/мл за день до этого.
количество посаженных клеток зависит от скорости роста соответствующей клеточной линии. Слияние
от 50% до 70% должно быть достигнуто на следующий день.
мой тест на лентивирус
a. приготовьте вирус в 10-кратном градиенте разбавления и убедитесь, что мои находится в диапазоне от 3
до 1000.
b. день 0: клетки-мишени пластины в хорошем состоянии с плотностью 1 × 105/мл в пластины с 96
скважинами, 100 мкл на скважину. Инкубируйте при 37 за ночь.
℃

7
c. день 1: приготовьте вирус в градиенте шести мой и разбавьте соответствующее количество суспензии вируса в полной среде
культуры клетки-мишени до конечного объема 100 мкл (установление мой = 3, 10, 30, 100, 300, 1000). Добавьте разбавленный
вирус в предсеянные клетки и инкубируйте в течение 4-8 часов при 37 , затем освежите среду для удаления вируса.
℃
d. день 3: обнаружить флуоресценцию с помощью микроскопа. Рассчитайте мои на основе соотношения флуоресцентных ячеек.
если вирус не помечен флуоресценцией, moi можно определять с помощью qpcr, WB, IF, IHC и т. д.
таблица 2. лентивирусный моис обычно используемых клеточных линий.
клеточная линия диапазон мои вспомогательный инфекционный реагент
полибрен
K 562 20～40 Потребность в
Жур Катт 50～80 Нет.
Касуми 10～30 Нет.
Nb 4 50～80 Нет.
U 937 20～40 Потребность в
ТП-1 50～80 Потребность в
GBC-SD 30～50 Нет.
H 929 100～150 Нет.
H 1299 1～3 Потребность в
95 d 2～4 Потребность в
A 549 20～40 Потребность в
SPC-A-1 100～150 Потребность в
7402 10～15 Потребность в
Геп 3b 10～30 Потребность в
Геп g2 10～30 Потребность в
СММК-7721 10～30 Потребность в
Х-7 10～30 Потребность в
Хера. 10～30 Потребность в
Хосс 20～40 Потребность в
печень 2 10～30 Потребность в
HL-60 >100 Потребность в
Хт-29 10～30 Потребность в
ПК Ко 2～4 Потребность в
SW 480 10～30 Потребность в
ДЛД-1 10～30 Потребность в
СК-ОВ-3 2～4 Потребность в
ШГ-44 10～30 Потребность в
293 т 1～3 Потребность в
HUVEC-2C 10～30 Потребность в
шт. 3 20～40 Потребность в
МДА-МБ- 10～30 Потребность в
МКФ-7 20～40 Нет.
TCA 8113 10～30 Потребность в

8
РПЕ 10～30 Потребность в
Агс. 100～150 Потребность в
BGC-823 100～150 Потребность в
SGC-7901 10～30 Потребность в
МКН-28 20～40 Потребность в
МКН-45 20～40 Потребность в
BxPc-3 20～40 Потребность в
CFPAC-1 50～80 Потребность в
Панк-1 2～4 Потребность в
Гек-1-Б 2～4 Потребность в
НИХ-3T3 20～40 Потребность в
сырой 264,7 10～30 Нет.
Чо Чо 20～40 Потребность в
HSC-T6 10～30 Нет.
C 6 >100 Потребность в
NRK 10～30 Потребность в
преобразовательная передача
a. перед заражением вирус следует аккуратно растопить на льду и повторно суспендировать в культурной среде.
b. приготовьте вирус в 10-кратном градиенте разбавления и убедитесь, что мои находится в диапазоне от 3 до 1000.
c. удалите предыдущую среду и добавьте лентивирусодержащую среду с 1/2 объемом нормального объема культуры.
d. Культивируйте в течение 4 часов при 37 и добавьте свежую среду до нормального объема. рекомендуемый
℃
средний объем лентивирусной инфекции отображен в следующей таблице 3.
e. освежите культуральную среду через 24 часа после заражения.
таблица 3. рекомендуемый средний объем во время лентивирусной инфекции.
культура,
культура
поверхность,
поверхность
нормальный объем ячейки 1/2 тома для лентивируса
96-скважин 0,3 см2 100 мкл 50 мкл
24-
квадратный
2 см2 500 мкл 250 мкл
12-скважин 4 см2 1 мл 500 мкл
6-квадратный 10 см2 2 мл 1 мл
построение стабильных трансгенных клеточных линий
Через 48 часов после заражения перемените на свежую среду с пуромицином. рекомендуемая концентрация
пуромицина варьируется от 1 до 10 мкг/мл в зависимости от клеточных линий. установите незараженные клетки дикого
типа в качестве контрольной группы и добавьте равный объем и концентрацию пуромицина. заменяйте свежей
пуромицинсодержащей средой каждые 2 или 3 дня, пока клетки контрольной группы не вымирают. затем выберите
один из следующих шагов в соответствии с экспериментальными требованиями.
a. неселективные моноклональные клетки
пропускать зараженные клетки и постоянно выбирать пуромицином. заморозить клеточную смесь в непрерывных трех
проходах.

9
учитывая неоднородность, мы рекомендуем выбрать моноклональную клетку для подтвержденного фенотипа.
б. выбор моноклональных клеток
Выберите не менее пяти моноклональных клеток после инфекции и отбора пуромицина и размножайтесь в
пуромицинсодержащей среде. обнаружение экспрессии генов-мишеней с использованием вестерн-блота или
qpcr. Выберите стабильную клеточную линию с соответствующим уровнем экспрессии генов-мишеней для
прохождения трех поколений и заморозите стабильную клеточную линию.
Примечания к инфекции специальных клеточных линий:
1. суспензионные клетки
мы рекомендуем использовать центрифугированную трансфекцию с плоским филем для заражения
суспензионных или полусуспензионных клеток. Добавьте суспензию вируса в тарелку для культивирования
клеток, плотно запечатайте и центрифужите на низкой скорости 200 г в центрифуге с плоским филем в
течение 1 часа. поместите клетки в инкубатор клеточной культуры после центрифуги и трансфекции. если
центрифуга с плоским углом недоступна, вы можете подвесить ячейки и перенести ячейки в центрифужные
трубки, за которыми следует низкоскоростная центрифуга и выбросить большую часть супернатанта.
добавьте вирусную суспензию в трубки, повторно суспендируйте клетки, поместите ее при комнатной
температуре в течение 15 минут (не более 30 минут) и перенесите клетки и вирусную суспензию в пластину
для культивирования. на следующий день замените свежей культуральной средой.
2. клетки, которые трудно заразить
для клеток, которые трудно заразить, таких как клетки постоянного тока, мы рекомендуем повторные
инфекции. заменить свежей вирусной суспензией через 24 часа после первого заражения. повторные
инфекции могут значительно повысить эффективность инфекции.
3. неделящиеся первичные клетки
мы рекомендуем аденовирус с высоким титром для заражения этих клеток, таких как bmsc.
Ссылка на
1. Салгадо CD и JM Kilby. (2009). ретровирусы и другие скрытые вирусы: самые смертоносные патогены не обязательно являются лучшими
кандидатами на биотерроризм. J S C Med Assoc 105:104-6.
2. Пигет в, о шварц, с ле галл и д троно. (1999). понижающая регуляция cd4 и mhc-i приматными лентивирусами: парадигма модуляции рецепторов
поверхности клеток. иммунол откр. 168:51-63.
3. кокрелл как и т кафри. (2007). доставка генов лентивирусными векторами. мол биотехнол 36:184–204.

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