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adenovirus (AdV)
Introduction of Recombinant adenovirus (AdV)
Recombinant adenovirus (rAdV) is a replication-defective adenoviral vector, which is widely used for a variety of
purposes including gene transfer and engineering, vaccination and gene therapy [1,2]. There are several advantages
of using adenovirus as a gene transfer mediator. Firstly, it can deliver as large as 8 kilo-base (kb) gene sequences
into cells and tissues without insertion of exogenous fragment in the genome. Secondly, almost all the dividing and
non-dividing cells, primary cells and organ tissues can be transduced by recombinant adenovirus. Moreover,
recombinant adenovirus is easy to operate and expand into large-scale, and the efficiency can reach up to 100%.
Thus, recombinant adenovirus plays an important role in gene engineering research and potential therapeutic
treatment of diseases.
The most commonly used adenovirus is serotype 5 (Ad5) of Homo Sapiens consisting of a double-stranded linear
DNA molecule at about 36 kb in size1. The cytoplasmic membrane receptors and fibers facilitate endocytosis of
adenovirus into cell cytoplasm, where adenovirus particles further migrate into cell nucleus for self-replication using
replication machinery of the host [3]. Once replicated, the adenovirus genome is assembled into its protein shell and
released from cells, causing cell lysis [3].
Nowadays, several packaging systems of recombinant adenovirus are developed, in which AdEasy1 and AdMAX2
are the two most popular ones, sharing a common strategy that target gene sequence is cloned into an adenovirus
expression vector (adenovirus shuttle vector), then recombined into a viral backbone vector. Early viral transcription
units, E1 and E3, are defected in both of these two systems, while E3 gene is not necessary for adenovirus
replication1. Thus, packaging of recombinant adenovirus is usually conducted in cell lines expressing E1 gene, such
as HEK-293, HEK-293A, etc. [2].
In comparison with AdEasy, AdMAX system is relatively easy to handle and can achieve higher adenovirus titer
during adenovirus production. This recombinant adenovirus protocol is developed according to AdMAX system,
using a two-vector system composed of adenovirus expression plasmids (adenovirus shuttle vectors) with different
promoters and tags, and an adenovirus genome backbone plasmid with E1 region deletion.
Protocol Overview
A schematic overview of recombinant adenovirus (AdV) production is shown in Figure 1. The first step is to clone
the gene of interest (GOI) into an appropriate plasmid vector. For most applications, the cDNA of interest is cloned
into one of the recombinant adenovirus expression vectors. The inverted terminal repeat (ITR) sequences present in
these vectors provide all of the cis-acting elements necessary for recombinant adenovirus replication and packaging.
The recombinant expression plasmid is co-transfected into the 293A cells (an E1-complementing cell line) with
adenovirus genome backbone plasmid, which together supply all of the trans-acting factors required for adenovirus
replication and packaging.
GeneMedi

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Small plaques can be visualized under microscope 10 to 21 days post-transfection. Pick three to six individual
plaques and compare their adenovirus titer, then select the one with highest titer to proceeded subsequent
amplification, concentration and purification experiments.
Figure 1. Adenovirus packaging experiment flow chart.
Experimental Materials
GeneMedi's adenovirus Vector System
GeneMedi's adenovirus Vector System, also named the adenovirus expression system or adenovirus packaging
plasmid system, is a powerful tool for in-vitro & in-vivo gene delivery, shRNA mediated RNA interference (RNAi)
and gene editing. You can easily recombine produce a recombinant adenovirus (r-AdV) particle in HEK293 or
HEK293A cell line in high titer using GeneMedi's adenovirus Vector System.
The Genemedi adenovirus vector system including 2 types of adenovirus packaging plasmids: the adenovirus
expression plasmids (adenovirus shuttle vectors) with different promoters and tags, and an adenovirus genome
backbone plasmid with E1 region deletion.
GeneMedi

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GeneMedi has developed a variety of adenovirus expression vectors with different expression cassettes, containing
kinds of verified promoters and reporters including GFP, zsgreen, RFP, mcherry and luciferase. The GeneMedi's
adenovirus expression vectors have been proved very suitable for unique gene overexpression or shRNA-mediated
knock-down (also called RNAi (RNA interference ). You can also achieve gene knock-out(KO) or gene editing
using our Crispr-cas9-gRNA adenovirus expression vector.
Visit https://www.genemedi.net/i/adenovirus-vector-system for more information about GeneMedi’s adenovirus
vector system and multiple adenovirus expression vectors (adenovirus shuttle vectors).
Bacterium Strain
E. coli strain DH5ɑ is used for amplification of adenovirus expression plasmids (adenovirus shuttle vectors) and
adenovirus backbone vector.
Packaging Cell Line
293A is the adenovirus packaging cell line that can facilitate initial production, amplification and titer determination
of recombinant adenovirus. It is an adherent, epithelial-like cell line expressing E1 proteins required for adenovirus
replication, and grows into a monolayer when confluent. Originated from the 293 cell line and established for plaque
assays, this cell line was identified to be an easy-to-handle transfection host.
The complete growth medium of 293A is Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10%
Fetal Bovine Serum (FBS) and 1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep). For a continuous culture, cells should not
exceed 70% confluence to maintain proper characteristics. Usually, starting from cell passage number one, optimal
results can be obtained within 30 passages. Once reached, it is best to start a new culture from another frozen stock
in case of any unexpected mutations and unhealthy growth. Therefore, banking your own 293A frozen stocks is very
important to ensure experimental integrity and continuity. Freezing cells at the logarithmic phase will improve post-
thaw viability.
Notices:
If the cell line is contaminated by mycoplasma, to reach a better-cultured cell state, we recommend the use of
Genemedi anti-mycoplasma reagent CurePlasmaTM
.
Packaging Cell Line
Gene of interest
LB broth
Agar and Agarose
Kanamycin
Ampicillin
70 and 100% ethanol
Sterile PBS
Cesium chloride (CsCl)
Chlorine bleach
GeneMedi

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DNA gel apparatus and power supplies
Class II Biosafety Cabinet
37℃ orbital shaker
37℃ bacteria incubator
37℃, 5% CO2 incubator
15- and 50-ml conical tubes
25- and 75-cm2
tissue culture flasks
Cell scrapers
Dry-ice/methanol bath
Liquid nitrogen tank
Ultracentrifuge (Beckman) or equivalent with SW28 rotor
Low-speed swinging-bucket centrifuge
Microcentrifuge
Centrifuge tube (thick-wall polycarbonate tube with cap)
Ring stand and clamp, 3-ml syringes and 18-G needles
Packaging and Concentration of Adenovirus
Vector Construction of Adenovirus
Before recombinant adenovirus packaging, the gene of interest should be constructed into recombinant adenovirus
expression vector. Genemedi also provides various Adenovirus vectors with alternative promoters and fluorescent
labels (Table 1). What’s more, Genemedi has plenty of premade Adenovirus vector goods carrying some genetic
tools in stock, such as adenovirus-LC3 autophagy flux detection biosensors, etc.
Visit https://www.genemedi.net/i/virus-plasmid to find more about Genemedi’s ORF/CDNA premade adenovirus
expression vectors
Note:
In order to construct vectors quickly and efficiently, it is strongly recommended to use Genemedi- ClonEasyTM
One
Step Cloning Kit（Cat. GM-GC-01/02/03）.
Visit https://www.genemedi.net/i/cloneasy-one-step-cloning-kit to find more about Genemedi - ClonEasyTM
One
Step Cloning Kit
Transfection of adenovirus Plasmids into 293A Packaging Cells
a. 293A cell culture should be prepared at least a day ahead to reach a confluence of 50%-70% monolayer
morphology prior to transfection.
b. On the day of transfection, DMEM needs to be pre-warmed at 37℃ water bath and LipoGeneTM
transfection
reagent should be equilibrated to room temperature and tapped to mix before use.
c. To prepare viral plasmids for each reaction using a 60-mm dish:
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Table 1. Adenovirus vector system plasmids and transfection reagent required for transfection.
Component Amount
pAd expression vector with GOI 2 μg
adenovirus genome backbone
plasmid
4 g
LipoGeneTM
30 l
d. Mix plasmids with transfection reagent in DMEM and add drop-wise to pre-seeded 293A cells. Incubate at 37℃,
5% CO2 and refresh with complete culture medium in 6 hours.
Note:
1. A detailed protocol of the transfection reagent can be referred to Genemedi LipoGeneTM
Transfection Reagent
User Manual.
Click here to find more about Genemedi - LipoGeneTM
Transfection Reagent
2. Cells should be in a healthy growth state for use prior to transfection.
Plaque Formation and Cell Collection
Plaque is an area of monolayer cells that display a cytopathic effect when infected by adenoviruses, usually observed
as round, darker cells or white spots with microscope or naked eyes (Figure 1). It is important to observe viral
plaques before collecting the transfected cells.
a. To minimize the spreading of adenovirus for a better condition of adenovirus plaque formation, low-melting-
point agarose is suggested to be added in regular medium with a final concentration of 1.25%.
b. Small plaques can be visualized under microscope 10 to 21 days post-transfection. If the engineering sequence
in the adenovirus expression plasmid carries fluorescent tags (GFP or RFP), the transfection efficiency can be
estimated with fluorescence microscopy before production of plaques.
c. Pick an isolated viral plaque together with surrounding agarose, and transfer into 1 ml fresh medium and
incubate overnight. In general, three to six plaques should be picked to compare their adenovirus titer, then the
one with highest titer will be proceeded into subsequent experiments.
Figure 1. Identification of a plaque.
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Note:
A stock solution of high-purity low-melting-point agarose can be prepared in sterile PBS to a final concentration of
5%. Before use, melt the stock completely in boiling water bath, and gradually cool down to 45 ℃ at room
temperature. Dilute the agarose stock solution using pre-warmed 37 ℃ complete growth media to a final
concentration of 1.25%. Immediately and gently add the well-mixed solution to cells with culturing medium removed
ahead, and rotate to evenly covering the plaque cells. For a 6-well plate, add 3 ml agarose/medium per well.
It is important to observe viral plaques before collecting the transfected cells. To minimize the spreading of
adenovirus for a better condition of adenovirus plaque formation, low-melting-point agarose is suggested to be
added in regular medium, and small plaques can be visualized under microscope 10 to 21 days post-transfection. If
the engineering sequence in the adenovirus expression plasmids (adenovirus shuttle vectors) carries fluorescent
tags (GFP or RFP), the transfection efficiency can be estimated with fluorescence microscopy before production of
plaques.
adenovirus Amplification
a. On the next day, add adenovirus-containing supernatant into fresh, pre-seeded 293A cells to amplify adenovirus.
b. Collect cells and supernatant when observing formation of plaques, and proceed into a freeze-thaw cycle 3 times
before collecting all adenoviruses.
c. The collected adenovirus is recognized as passage 1 (P1 adenovirus). Then, infect fresh 293A cells with P1
adenovirus.
d. Perform infection-collection cycle for three times till P4 adenovirus is obtained, and expand adenovirus
production into large-scale through P4 adenovirus infection. When formation of plaques is observed,
adenoviruses are collected for purification and concentration.
Note:
1. Use a cell scraper instead of trypsinization to detach cells. Collected cells should be centrifuged at 500 g, 4℃
for 10 min. Discard the most supernatant and leave 2ml to resuspend the cell pellet, transfer to a container at
lower than -80℃ (using dry ice or liquid nitrogen) for freezing and thawing.
2. Immediately remove from the 37 ℃ bath when the adenovirus suspension melts completely in case of any
decrease of the adenovirus titer. Shake the completely melted suspension heavily for 30 seconds. Usually, two to
four rounds of freeze-thaw cycle can improve the yield of adenoviruses with high titer.
3. After freeze-thaw cycles, adenovirus lysate can be centrifuged at 500 g, 4℃ for 10 min to remove cell debris,
and stored at -80℃ for later use.
adenovirus Purification
The purification process of recombinant adenovirus is composed of three steps: PEG8000 condensation, CsCl
density gradient centrifugation and dialysis. The detailed operation process is as following:
GeneMedi

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a. Thaw: Take the adenovirus out from -80 centigrade one day in advance, and melt in water bath at room
temperature. Centrifuge at 7000 g, 4℃ for 10 min and collect supernatant.
b. PEG8000 condensation: Add 50 ml PEG8000 solution (20% PEG8000 in ultra-pure water with 2.5 M NaCl) per
100ml supernatant, placing on ice for 1 hour to pull-down adenoviruses (Time for incubation on ice can be
relatively extended). Centrifuge the mixture for 20 min at 7000 g, 4℃, discard the supernatant and resuspend
adenovirus pellet in 10 ml CsCl solution at density of 1.10g/ml (solvent of CsCl is 20mM Tris-HCl, pH8.0,
please see the following CsCl solution preparation method in table 2). The adenovirus-containing CsCl solution
should be pink (Figure 2).
Table 2. CsCl solution preparation.
Density at 20℃ (g/ml) Concentration (ml/ml) Amount of CsCl (g) Final Volume (ml)
1.40 548.3 5.483 10
1.30 402.4 4.024 10
1.20 143.8 1.438 10
c. CsCl density gradient centrifugation: Place 2 ml of 1.40 g/ml CsCl solution on the bottom of a centrifuge tube,
next add 3 ml of 1.30 g/ml CsCl solution slowly on top of the first layer, then add 5 ml adenovirus suspension.
Centrifuge with Beckman SW28 rotor at 26,000 rpm, 4℃ for 2 hours.
Figure 2. CsCl density gradient centrifugation process.
Left panel: CsCl gradient before ultracentrifugation.
Right panel: CsCl gradient after ultracentrifugation.
d. adenovirus collection: Collect adenovirus band between 1.30g/ml and 1.40g/ml layers with a syringe, transfer
into dialysis bag.
Note:
The dialysis bag should be boiled in 10 mM EDTA-Na2 for 10 min, cool down to room temperature before use.
e. Dialysis: Put the dialysis bag containing adenovirus in dialysis buffer (50 g sucrose, 10 ml 1 M Tris-HCl, PH 8.0,
2 ml 1 M MgCl2, top up to 1 L by distilled water), and stir at 4℃ overnight. Replace with fresh buffer once
during dialysis.
f. Formulation: Collect adenovirus from the bag, adjust volume to 500 µl with PBS, and determine the titer.
Purified recombinant adenovirus should be kept in 4℃ for no more than a week or in -80℃ for long time storage.
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Titration of Purified recombinant adenovirus
The titer determination method of recombinant adenovirus is plaque assay. Plaque-forming unit (PFU) is the number
of plaques induced by certain volume of adenoviruses, representing the concentration of active viral particles.
Plaque assay of recombinant adenovirus:
a. Plate 293A cells in 60-mm dishes at least one day in advance.
b. When cell confluence reaches approx. 100%, add diluted adenovirus at different concentrations and incubated at
37℃.
c. 4 to 8 hours post infection, cover cells with 8 ml low-melting-point agarose solution (10% FBS, 1.25% agarose).
d. Calculate the titer of recombinant adenovirus by counting number of plaques in 9-11 days of culturing.
Note:
Titer of recombinant adenovirus can also be determined by observing fluorescence when applicable, or through the
method of Western blotting (WB), immunofluorescence (IF) and immunohistochemistry (IHC) detection on
expression level of target genes.
Transduction of Target Cells
For the reason that MOI varies in different cell lines, preliminary experiment is necessary to ensure a proper MOI of
target cells before conducting formal experiments.
Note:
MOI: multiplicity of infection, is the number of viral particles to infect one cell. An optimization test of MOI is
strongly recommended as the real MOI to certain cells may be affected by the operations and methods of dealing
with adenoviruses in different labs.
Cell Preparation
Plate robust target cells into 24-well plates at a density of 1 x 105
/ml.
Note:
The number of planted cells depends on the growth rate of the relevant cell line. 50% to 70% confluence should be
reached on the following day.
MOI Test of recombinant adenovirus
Prepare the adenovirus in 10-fold dilution gradient, and ensure the MOI is within a range of 3 to 1000.
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Day 0: Plate target cells in good condition at a density of 1 x 105
/ml into 96-well plates, 100 µl per well. Incubate at
37℃ overnight.
Day 1: Prepare adenovirus in a six-MOI gradient, and dilute proper amount of adenovirus suspension in complete
culture medium of target cell to a final volume of 100 µl (setting MOI=3, 10, 30, 100, 300, 1000). Add diluted
adenoviruses to pre-seeded cells and incubate for 4 to 8 hours at 37 ℃ , then refresh the medium to remove
adenoviruses.
Day 3: Detect fluorescence with a microscope. Calculate MOI based on the ratio of fluorescent cells.
Note:
If the adenovirus is not fluorescence-labeled, MOI can be determined by qPCR, WB, IF, IHC, etc.
Transduction
Prepare the adenovirus in 10-fold dilution gradient, and ensure the MOI is within a range of 3 to 1000.
a. For adherent cells:
Recombinant adenovirus containing target gene and the same amount of control adenovirus should be added
separately into two groups of cells and mixed well. The amounts of adenoviruses to be used are based on size of
container described in the following table. For MOI test in most cell types, a gradient of 3, 10, 30, 100, 300 to1000
at three replicates would be sufficient enough. Refresh medium in 4 to 8 hours. Protein of interests can be detected
within 48-72 hours with fluorescence microscopy, WB, etc.
Table 3. adenoviruses amounts in different container size.
Size of Container Surface Area (cm2
) Volume of Medium Volume of
adenoviruses
96-well 0.3 100 µl 0.1-0.5 µl
24-well 2 500 µl 1-3 µl
12-well 4 1 ml 2-5 µl
6-well 10 2 ml 5-20 µl
For example: If the tier of recombinant adenovirus is 5 × 1011
PFU/ml, dilute to 5 × 1010
PFU/ml (10-fold) with
complete growth medium of target cells. When there are 1 × 105
cells in one well, and the MOI is 1,000, required
volume of diluted adenovirus (5 × 1010
PFU/ml) should be (cell number) × (MOI) ÷ (PFU/ml of recombinant
adenovirus) = 1 × 105
× 1,000 / 5 × 1010
(ml) = 2 µl. Thus, 2 ul of diluted adenovirus should be added into this well.
Note:
The waste should be disposed following procedures described in Biosafety Requirements Section.
b. For suspension cells:
Spin infection is a sufficient way to transduce suspension or semi-suspension cells. In brief, seal the cell culture plate
by parafilm after adding adenoviruses, spin in a low-speed swinging-bucket centrifuge at 200g for 1 hour at 37℃,
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and culture cells at 37℃ overnight. Medium should be refreshed the next day.
If the condition is not allowed for spin infection, a centrifuge tube can be used instead by transferring cells into a
tube and centrifuge at low-speed. Discard most of the supernatant after centrifugation, add adenoviruses, and
incubate at room temperature for 15-30 min. Then transfer the cell-adenovirus mixture into a proper container, and
culture at 37℃ overnight. Medium should be replaced the next day.
Determine Transduction Efficiency
48 to 72 hours post-transduction, fluorescent proteins can be observed when applicable, and the alteration of target
gene can be analyzed at mRNA-level by qPCR or at protein-level by Western blot (WB).
Safe Use of adenovirus (AdV)
1. Adenovirus related experiments should be conducted in biosafety level 2 facilities (BL-2 level).
2. Please equip with lab coat, mask, gloves completely, and try your best to avoid exposing hand and arm.
3. Be careful of splashing adenovirus suspension. If biosafety cabinet is contaminated with adenovirus during
operation, scrub the table-board with solution comprising 70% alcohol and 1% SDS immediately. All tips, tubes,
culture plates, medium contacting adenovirus must be soaked in chlorine-containing disinfectant before disposal.
4. If centrifuging is required, a centrifuge tube should be tightly sealed. Seal the tube with parafilm before
centrifuging if condition allowed.
5. Adenovirus related animal experiments should also be conducted in BL-2 level.
6. Adenovirus associated waste materials need to be specially collected and autoclaved before disposal.
7. Wash hands with sanitizer after experiment.
Storage and Dilution of Adenovirus
Storage of Adenovirus
Adenovirus can be stored at 4°C for a short time (less than a week) before using after reception. Since adenoviruses
are sensitive to freeze-thawing and the titer drops with repeated freeze-thawing, aliquot viral stock should be stored
at -80 ° C freezer immediately upon arrival for long-term usage. While adenovirus titer redetection is suggested
before using if the adenoviruses have been stored for more than 12 months.
Note: 1. Repeated freeze-thaw cycles must be avoided in case of a downside effect on adenovirus titer (for each
freeze-thaw cycle, there would be a 10%-50% decrease). Genemedi will provide recombinant adenovirus products in
small aliquots (200 µl/tube) that can be directly stored in -80 centigrade for multiple usage.
2. For adenoviruses stored for more than 6 months, it is suggestive to re-analyze adenovirus titer before use.
GeneMedi

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Dilution of Adenovirus
To properly thaw recombinant adenovirus frozen aliquots, transfer adenoviruses from -80℃ freezer to an ice-water
bath till completely melted. When melted, add proper amount of sterile PBS or serum-free culture medium, and keep
in 4℃ for no more than a week.
Precautions
· Avoid Adenovirus exposure to environmental extremes (pH, chelating agents like EDTA, temperature, organic
solvents, protein denaturants, strong detergents, etc.)
· Avoid introducing air into the Adenovirus samples during vortexing, blowing bubbles or similar operations,
which may result in protein denaturation.
· Avoid repeated freezing and thawing.
· Avoid exposing to “regular” plastics (especially polystyrene or hydrophobic plastics) for prolonged periods in
liquid phase. Most adenoviruses are very sticky and loss can occur if exposed to regular plastics, including tubes,
cell culture plates, pipette tips, if not frozen. It is best to store Adenovirus in siliconized or low protein binding tubes.
Pluronic F-68 used at 0.01%-0.1% in the formulation buffer will minimize sticking if regular plastics are used.
· Avoid diluting Adenovirus into low salt solution. Some adenoviruses aggregate in low salt solution, which will
be non-infectious.
References
1. Luo J. et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using AdEasy system. Nat. Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).
2. He T. C. et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. PNAS. 95, 2509-2514 (1998).
3. Meier O. & Greber U. F. adenovirus endocytosis. J. Gene Med. 6 (Suppl 1), S152-S163 (2004).
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1. AAV packaging system
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Sequence-verified CDNA clones in Adenovirus and mammalian expression vectors.
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3. Adenovirus custom production
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About GeneMedi
GeneMedi specializes in creating superior antibody, protein, and vector-based
bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions.
At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field
of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of
unparalleled expertise in the following areas:
Innovative Antigen Design and Robust Assay Development
Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens
and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical
and research settings.
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antibody discovery and LIBRATM for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize
molecules with optimal stability and functionality.
Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXTTM platform is our answer to the industry's
need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking
gene therapy approaches.
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AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification
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comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic
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Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic
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アデノウイルス産生プロトコル
包装濃縮・精製
ゲネメディ
遺伝子治療の革新

2
アデノウイルス(AdV)
組換えアデノウイルス(AdV)の導入
組換えアデノウイルス(rAdV)は複製欠陥のあるアデノウイルスベクターであり、遺伝子移転やエンジニアリング、ワクチン接
種、遺伝子治療など、さまざまな目的で広く使用されています[1,2]。遺伝子転写メディエーターとしてアデノウイルスを使用
することにはいくつかの利点があります。第一に、ゲノムに外因性フラグメントを挿入することなく、 8 キロ塩基（kb）の大
きさの遺伝子配列を細胞や組織に伝達することができます。第二に、分裂していない細胞、一次細胞、臓器組織のほぼ全てが
組換えアデノウイルスによって伝達されることができる。さらに、組換えアデノウイルスは操作が容易で大規模に拡大し、効
率は最大 100%に達することができます。したがって、組換えアデノウイルスは遺伝子工学研究や疾患の潜在的な治療におい
て重要な役割を果たしています。
最も一般的に使用されるアデノウイルスは、サイズ約 36 kb の二本鎖線形 DNA 分子からなるホモサピエンスの血清型 5(Ad5)
です 1。細胞質膜受容体および繊維は、アデノウイルスの細胞質への内細胞増殖を促進し、そこでアデノウイルス粒子はさら
に細胞核に移動し、宿主の複製機械を使用して自己複製する[3]。複製すると、アデノウイルスゲノムはタンパク質シェルに組
み込まれ、細胞から放出され、細胞の溶解を引き起こします[3]。
現在では、組換えアデノウイルスのパッケージングシステムがいくつか開発されており、その中で最も人気のあるものは
AdEasy1 と AdMAX2 であり、標的遺伝子配列をアデノウイルス発現ベクター(アデノウイルスシャトルベクター)にクローン
し、その後ウイルスバックボーンベクターに再結合するという共通の戦略を共有しています。初期のウイルス転写ユニットで
ある E1 と E3 は、これら 2 つのシステムの両方で欠損していますが、E3 遺伝子はアデノウイルスの複製に必要ではありませ
ん 1。したがって、組換えアデノウイルスのパッケージは通常、HEK-293、HEK-293A などの E1 遺伝子を発現する細胞株で
行われます[2]。
AdEasy と比較して、AdMAX システムは比較的扱いやすく、アデノウイルス産生中に高いアデノウイルス価を達成することが
できます。この組換えアデノウイルスプロトコルは、異なるプロモーターとタグを持つアデノウイルス発現プラスミド（アデ
ノウイルスシャトルベクター）と、E1 領域が欠落したアデノウイルスゲノムバックボーンプラスミドからなる 2 ベクターシ
ステムを使用して、AdMAX システムに従って開発されています。
プロトコルの概要
組換えアデノウイルス(AdV)産生の概略的な概要を図 1 に示します。最初のステップは、関心遺伝子（GOI）を適切なプラスミ
ドベクターにクローンすることです。ほとんどのアプリケーションでは、興味のある cDNA は組換えアデノウイルス発現ベク
ターの 1 つにクローンされます。これらのベクターに存在する反転末端繰り返し(ITR)配列は、組換えアデノウイルスの複製と
パッケージ化に必要なすべてのシス作用元素を提供します。
組換え発現プラスミドは、アデノウイルスゲノムバックボーンプラスミドと 293A 細胞（E1 補完細胞株）に共感染され、アデ
ノウイルスの複製とパッケージ化に必要なすべてのトランス作用因子を一緒に供給します。

3
トランスフェクション後 10~21 日後に顕微鏡下で小さなプラークを視覚化することができます。3~6
個の個々のプラークを選び、それらのアデノウイルス価を比較し、最高価のプラークを選択して、その
後の増幅、濃縮、精製実験を進めます。
図 1。アデノウイルスパッケージ実験フローチャート。
実験材料
ゲネメディのアデノウイルスベクターシステム
GeneMedi のアデノウイルスベクターシステムは、アデノウイルス発現システムまたはアデノウイル
スパッケージングプラスミドシステムとも呼ばれ、in vitro&in vivo 遺伝子送達、shRNA 媒介 RNA 干
渉（RNAi）、遺伝子編集のための強力なツールです。ゲネメディのアデノウイルスベクターシステム
を使用して、HEK293 または HEK293A 細胞株に高価の組換えアデノウイルス(r-AdV)粒子を簡単に再
結合して生成できます。
プロモーターとタグが異なるアデノウイルス発現プラスミド（アデノウイルスシャトルベクター）
と、E1 領域が欠落したアデノウイルスゲノムバックボーンプラスミドの 2 種類のアデノウイルスパッ
ケージングプラスミドを含むゲネメディアデノウイルスベクターシステム。

4
GeneMedi は、GFP、zsgreen、RFP、mcherry、ルシフェラーゼを含む種類の検証されたプロモーターとレポーターを含
む、さまざまな発現カセットを備えたさまざまなアデノウイルス発現ベクターを開発しました。ゲネメディのアデノウイルス
発現ベクターは、ユニークな遺伝子過剰発現またはシュルナ媒介ノックダウン (RNAi(RNA 干渉)とも呼ばれる)に非常に適して
いることが証明されています。また、当社の Crispr-cas9-gRNA アデノウイルス発現ベクターを使用して遺伝子ノックアウト
(KO)または遺伝子編集を実現することもできます。
ゲネメディのアデノウイルスベクターシステムと複数のアデノウイルス発現ベクター(アデノウイルスシャトルベクター)の詳
細については、https://www.genemedi.net/i/adenovirus-vector-system をご覧ください。
細菌株
大腸菌株 dh 5 ɑs は、アデノウイルス発現プラスミド（アデノウイルスシャトルベクター）およびアデノウイルスバックボーン
ベクターの増幅に使用されます。
包装細胞株
293A は、組換えアデノウイルスの初期産生、増幅及び価測定を容易にすることができるアデノウイルス包装細胞株である。
これは、アデノウイルス複製に必要な E1 タンパク質を発現する付着性のある上皮様細胞株であり、合流すると単分子層に成長
します。293 細胞株に由来し、プラークアッセイのために確立されたこの細胞株は、扱いやすいトランスフェクション宿主で
あることが同定されました。
293A の完全な成長培地は、10%胎児ウシ血清(FBS)と 1%ペニシリンストレプトマイシン(Pen-Strep)を補充した Dulbecco
の修飾イーグル培地(DMEM)です。連続培養の場合、細胞は適切な特性を維持するために 70%の合流を超えてはいけません。
通常、セル通路番号 1 から始めて、30 通路内で最適な結果を得ることができます。到達したら、予期せぬ突然変異や不健康な
成長の場合に備えて、別の冷凍株から新しい文化を開始するのが最善です。したがって、実験の完全性と継続性を確保するた
めには、独自の 293A 凍結株を銀行化することが非常に重要です。対数相で細胞を凍結することで、解凍後の生存性が向上し
ます。
通知：
細胞株がマイコプラズマによって汚染されている場合、より良い培養細胞状態に達するために、ゲネメディ抗マイコプラズマ
試薬キュレプラズマの使用をお勧めします。
包装細胞株
関心のある遺伝子ポ
ンドスープ
寒天及びアガロー
スカナマイシンア
ンピシリン
70、100%エタノール滅菌
PBS
塩化セシウム（CsCl）塩素
漂白剤

5
DNA ゲル装置および電源クラス II バ
イオセーフティキャビネット
37℃軌道シェーカー
37℃細菌インキュベー
ター
37℃、5%CO2 インキュベーター
15、50ml 円錐チューブ
25 cm2 および 75 cm2 の組織培養フ
ラスコセルスクレーパー
ドライアイス/メタ
ノール浴液窒素タン
ク
超遠心分離器(Beckman)または SW28 ローター低速ス
イングバケット遠心分離器と同等
微小遠心分離機
遠心分離機チューブ（キャップ付き厚壁ポリカーボネー
トチューブ）リングスタンドとクランプ、3ml 注射
器、18g 針
アデノウイルスの包装と濃度
アデノウイルスのベクター構築
組換えアデノウイルスパッケージ化の前に、関心のある遺伝子を組換えアデノウイルス発現ベクターに構築する必
要があります。Genemedi はまた、代替プロモーターと蛍光ラベルを備えたさまざまなアデノウイルスベクター
を提供します(表 1)。さらに、ジェネメディには、アデノウイルス-LC3 オートファジーフラックス検出バイオセ
ンサーなどの遺伝子ツールを備えた事前に作られたアデノウイルスベクターグッズがたくさん在庫されていま
す。
ゲネメディの ORF/CDNA プリメイドアデノウイルス発現ベクターの詳細については、 https://
www.genemedi.net/i/virus-plasmid をご覧ください。
注意：
ベクターを迅速かつ効率的に構築するためには、genemedi-cloneasytm ワンステップクローニングキット
(cat.gm-gc-01/02/03)を使用することを強くお勧めします。
Visi thttps：//www.genemedi.net/i/cloneasy-one-step-cloning-kit genemedi-cloneasytm ワンステップク
ローニングキットの詳細をご覧ください
293A 包装細胞へのアデノウイルスプラスミドのトランスフェクション
a. 293A 細胞培養は、トランスフェクション前に 50%〜70%の単層形態の合流に達するために、少なくとも 1
日前に準備する必要があります。
b. トランスフェクション当日は、DMEM を 37℃の水浴で事前に温める必要があり、リポゲネットトランスフェ
クション試薬を室温に均衡させ、使用前にタップして混合する必要があります。
c. 60 mm の皿を使用して各反応のためのウイルスプラスミドを調製する。

6
表 1。トランスフェクションに必要なアデノウイルスベクターシステムプラスミドおよびトランスフェクション試薬。
成分額
GOI 付きパッド表現ベクトル 2 μ g
アデノウイルスゲノムバックボーン 4 μ g
脂肪遺伝子 30 μ l
d.プラスミドとトランスフェクション試薬を DMEM で混合し、事前播種された 293A 細胞に滴下します。37℃、5%CO2 でイ
ンキュベートし、6 時間で完全な培地でリフレッシュします。
注意：
1. 前記トランスフェクション試薬の詳細なプロトコルは、ゲネメディリポゲネットトランスフェクション試薬使用マニュア
ルを参照することができる。
ゲネメディリポゲネットトランスフェクション試薬の詳細については、ここをクリックしてください
2. 細胞は、トランスフェクション前に使用するために健康な成長状態である必要があります。
プラーク形成と細胞採取
プラークは、アデノウイルスに感染すると細胞障害効果を示す単層細胞の領域であり、通常は顕微鏡または肉眼で丸く暗い細
胞または白い斑点として観察されます(図 1)。感染した細胞を収集する前にウイルスプラークを観察することが重要です。
a. アデノウイルスの拡散を最小限に抑え、アデノウイルスプラーク形成の状態を良好にするために、最終濃度 1.25%の通常
培地に低融点アガロースを添加することが示唆されています。
b. トランスフェクション後 10~21 日後に顕微鏡下で小さなプラークを視覚化することができます。アデノウイルス発現プ
ラスミドの工学配列に蛍光タグ(GFP または RFP)がある場合、プラークが生成される前に蛍光顕微鏡でトランスフェク
ション効率を推定することができます。
c. 孤立したウイルスプラークを周囲のアガロースとともに選び、1ml の新鮮な培地に移し、一晩インキュベートします。一
般的に、アデノウイルス価を比較するために 3~6 個のプラークを選ぶ必要があり、その後、価が最も高いプラークをその
後の実験に進めます。
図 1。プラークの同定。

7
注意：
高純度の低融点アガロースの原液を、滅菌 PBS 中で最終濃度 5%まで調製することができる。使用前に、沸騰した
水浴でストックを完全に溶かし、室温で 45℃まで徐々に冷却します。あらかじめ加熱した 37℃の完全成長媒体
を使用して、アガロース原液を最終濃度 1.25%に希釈します。培養液を前に除去した細胞によく混合した溶液を
直ちに穏やかに加え、プラーク細胞を均一に覆うように回転させる。6 井戸プレートには、井戸ごとにアガロー
ス/媒体 3ml を加えます。
感染した細胞を収集する前にウイルスプラークを観察することが重要です。アデノウイルスの拡散を最小限に抑
え、アデノウイルスプラーク形成の状態を良好にするために、低融点アガロースを通常の培地に添加することが推
奨され、トランスフェクション後 10~21 日後に顕微鏡下で小さなプラークを視覚化することができます。アデノ
ウイルス発現プラスミド(アデノウイルスシャトルベクター)のエンジニアリング配列が蛍光タグ(GFP または RFP)
を持っている場合、プラークが生成する前に蛍光顕微鏡でトランスフェクション効率を推定することができます。
アデノウイルス増幅
a. 翌日、アデノウイルスを含む上清を新鮮な事前播種された 293A 細胞に加えて、アデノウイルスを増幅します。
b. プラークの形成を観察するときに細胞と上清を採取し、全アデノウイルスを採取する前に 3 回凍結解凍サイク
ルに進みます。
c. 回収されたアデノウイルスは通路 1（P1 アデノウイルス）として認識されます。次に、新鮮な 293A 細胞に
P1 アデノウイルスを感染させます。
d. P4 アデノウイルスが得られるまで 3 回の感染収集サイクルを行い、P4 アデノウイルス感染によりアデノウイ
ルス産生を大規模に拡大します。プラークの形成が観察されると、精製および濃縮のためにアデノウイルスが
採取されます。
注意：
1. トリプシン化の代わりに細胞スクレーパーを使用して細胞を剥離します。採取した細胞は、500 g、4℃で 10
分間遠心分離する必要があります。最も多くの上清を廃棄し、 2ml を残して細胞ペレットを再懸濁させ、-
80℃未満の容器に移します(ドライアイスまたは液体窒素を使用して)凍結および解凍します。
2. アデノウイルス懸濁液が完全に溶融したときに、アデノウイルス価が低下した場合に直ちに 37℃浴から除去
します。完全に溶けたサスペンションを 30 秒間大きく振ります。通常、2~4 ラウンドの凍結解凍サイクル
は、価数の高いアデノウイルスの収率を向上させることができます。
3. 凍結解凍サイクルの後、アデノウイルス溶解液を 500 g、4℃で 10 分間遠心分離して細胞破片を除去し、後で
使用するために-80℃で保存することができます。
アデノウイルス精製
組換えアデノウイルスの精製プロセスは、PEG8000 凝縮、CsCl 密度勾配遠心分離、透析の 3 つのステップで構成
されています。前記詳細な動作処理は以下の通りである。

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a. 解凍：1 日前に-80℃からアデノウイルスを取り出し、室温の水浴で溶かします。7000g、4℃で
10 分間遠心分離し、上清を採取します。
b. PEG8000 凝縮：上清 100ml あたり 50ml peg8000 溶液（2.5m nacl の超純水に 20%PEG8000）
を加え、氷の上に 1 時間置き、アデノウイルスをプルダウンします（氷の上でインキュベーション
する時間は比較的延長できます）。混合物を 7000g、4℃で 20 分間遠心分離し、上清を廃棄し、密
度 1.10g/ml で 10ml の CsCl 溶液にアデノウイルスペレットを再懸濁させます（CsCl の溶媒は
20mM Tris-HCl、pH8.0 です。表 2 の以下の CsCl 溶液調製方法を参照してください）。アデノウ
イルスを含む CsCl 溶液はピンクのものでなければなりません(図 2)。
表 2。CsCl 溶液調製。
20℃（g/ml）での密
度
濃度（ml/ml） CsCl 量（g）最終容積(ml)
1.40 548.3 5.483 10
1.30 402.4 4.024 10
1.20 143.8 1.438 10
c. CsCl 密度勾配遠心分離：遠心管の底に 1.40g/ml の CsCl 溶液 2ml を置き、次に 1.30g/ml の CsCl
溶液 3ml を最初の層の上にゆっくりと加え、次に 5ml のアデノウイルス懸濁液を加えます。ベック
マン SW28 ローターを 26,000 rpm、4℃で 2 時間備えた遠心分離機。
図 2。CsCl 密度勾配遠心分離プロセス。左パネル：超
遠心前の CsCl 勾配。右パネル：超遠心後の CsCl 勾
配。
d. アデノウイルス収集：注射器で 1.30g/ml と 1.40g/ml 層の間のアデノウイルスバンドを収集し、透
析袋に移します。
注意：
透析バッグを 10 mM EDTA-Na2 で 10 分間沸騰させ、使用前に室温まで冷却する必要があります。
e. 透析：アデノウイルスを含む透析バッグを透析緩衝液（ショ糖 50g、10ml 1 m tris-hcl、PH
8.0、2ml 1 m mgcl2、蒸留水で最大 1l 補充）に入れ、4℃で一晩かき混ぜます。透析中に一度新鮮
な緩衝液と交換してください。
f. 製剤：袋からアデノウイルスを採取し、PBS で体積を 500 μ l に調整し、価を決定します。精製され
た組換えアデノウイルスは、4℃で 1 週間以下、または-80℃で長時間保存する必要があります。

9
精製組換えアデノウイルスの滴定
組換えアデノウイルスの価測定方法はプラークアッセイである。プラーク形成単位（PFU）は、一定の体積
のアデノウイルスによって誘導されるプラークの数であり、活性ウイルス粒子の濃度を表します。
組換えアデノウイルスのプラークアッセイ：
a. 少なくとも 1 日前に 60mm 皿にセル 293A をプレートすることを特徴とする。
b. 細胞の合流が約に達すると。100%、異なる濃度で希釈されたアデノウイルスを添加し、37℃でイン
キュベートします。
c. 感染後 4~8 時間、8ml の低融点アガロース溶液（10%FBS、1.25%アガロース）で細胞を覆います。
d. 培養の 9〜11 日間のプラーク数をカウントすることにより、組換えアデノウイルスの価を計算します。
注意：
組換えアデノウイルスの価は、適用可能な場合に蛍光を観察することによって、または標的遺伝子の発現レ
ベルでウェスタンブロッティング（WB）、免疫蛍光（IF）および免疫組織化学（IHC）検出の方法によって
決定することもできます。
標的細胞の伝達
細胞株ごとにモイが異なるため、正式な実験を行う前に標的細胞の適切なモイを確保するための予備実験が
必要である。
注意：
MOI：感染の多数は、1 つの細胞に感染するウイルス粒子の数です。特定の細胞への本物のモイは、さまざ
まなラボでのアデノウイルスへの対処の操作と方法の影響を受ける可能性があるため、モイの最適化テスト
を強くお勧めします。
細胞調製
堅牢なターゲット細胞を 1 x 105/ml の密度で 24 ウェルプレートにプレートします。
注意：
植えられた細胞数は、当該細胞株の成長速度に依存することを特徴とする。次の日に 50%から 70%の合流に
達する必要があります。
組換えアデノウイルスのモイ検査
アデノウイルスを 10 倍の希釈勾配で調製し、モイが 3~1000 の範囲内であることを確認します。

10
日 0：1 x 105/ml の密度で良好な状態のプレートターゲット細胞を 96 ウェルプレートに、1 ウェルあたり
100 μ l にします。一晩 37℃でインキュベートします。
1 日目：6 モイ勾配でアデノウイルスを調製し、標的細胞の完全培地中で適量のアデノウイルス懸濁液を
100 μ l の最終体積に希釈します(MOI=3、10、30、100、300、1000 を設定します)。希釈したアデノウ
イルスを播種前細胞に加え、37℃で 4~8 時間インキュベートし、培地をリフレッシュしてアデノウイルス
を除去します。
3 日目：顕微鏡で蛍光を検出します。蛍光セルの比率に基づいて MOI を算出することを特徴とする。
注意：
アデノウイルスが蛍光標識されていない場合、qPCR、WB、If、IHC 等により MOI を求めることができる。
伝導；伝導
アデノウイルスを 10 倍の希釈勾配で調製し、モイが 3~1000 の範囲内であることを確認します。
a. 付着細胞の場合：
標的遺伝子と同量の対照アデノウイルスを含む組換えアデノウイルスを 2 群の細胞に別々に添加し、よく混
合する。使用するアデノウイルスの量は、下記表に記載の容器の大きさに基づいている。ほとんどの細胞タ
イプのモイテストの場合、3 回の複製で 3、10、30、100、300~1000 の勾配で十分です。4~8 時間で媒
体をリフレッシュします。興味のあるタンパク質は、蛍光顕微鏡、WB などで 48~72 時間以内に検出できま
す。
表 3。アデノウイルスの量はさまざまな容器サイズに含まれています。
たとえば、組換えアデノウイルスの層が 5 × 1011 PFU/ml の場合、標的細胞の完全な成長培地で 5 × 1010
PFU/ml(10 倍)に希釈します。1 つの井戸に 1 × 105 細胞があり、MOI が 1000 の場合、希釈アデノウイル
ス(5 × 1010 PFU/ml)の必要な体積は(細胞数)×(MOI)÷(組換えアデノウイルスの PFU/ml)=1 × 105 ×
1,000/5 × 1010(ml)=2µl でなければなりません。したがって、この井戸に 2ul の希釈されたアデノウイル
スを添加する必要があります。
注意：
廃棄物は、生物安全要件セクションに記載されている手順に従って処分する必要があります。
b. 懸濁細胞の場合：
スピン感染は、懸濁細胞または半懸濁細胞を転換するのに十分な方法です。要するに、アデノウイルスを添加
した後、細胞培養プレートをパラフィルムで封止し、低速スイングバケット遠心分離機で 200g で 37℃で 1
時間回
容器のサイズ表面積（cm2）媒体の容積
96-
音量
ウェル 0.3 100 μ l
24-
0.1~0.5 μ l
ウェル 2 500 μ l
12-
1~3 μ l
ウェル 4 1 ml
6-
2~5 μ l
ウェル 10 2 ml 5~20 μ l
転させます。

11
そして一晩 37℃で細胞を培養します。次の日に媒体を更新する必要があります。
スピン感染の状態が許されない場合は、細胞をチューブに移し、遠心分離器を低速で使用することができる。遠心
分離後に上清の大部分を廃棄し、アデノウイルスを加え、室温で 15〜30 分間インキュベートします。その後、細
胞とアデノウイルスの混合物を適切な容器に移し、一晩 37℃で培養します。媒体は翌日交換する必要がありま
す。
伝導効率を決定する
伝達後 48~72 時間では、適用される場合に蛍光タンパク質を観察し、標的遺伝子の変化を qPCR によって mRNA
レベルまたは WB によってタンパク質レベルで分析することができる。
アデノウイルス(AdV)の安全な使用
1. アデノウイルス関連実験は、バイオセーフティレベル 2 施設（BL-2 レベル）で実施する必要があります。
2. ラボコート、マスク、手袋を完全に装備し、手と腕を露出させないよう最善を尽くしてください。
3. アデノウイルス懸濁液を飛ばすのに注意してください。操作中にバイオセーフティキャビネットがアデノウイ
ルスに汚染された場合は、すぐに 70%アルコールと 1%SDS を含む溶液でテーブルボードをこすります。すべて
のチップ、チューブ、培養プレート、アデノウイルスに接触する培地は、廃棄する前に塩素含有消毒液に浸す必要
があります。
4. 遠心分離が必要な場合は、遠心チューブを密閉する必要があります。条件が許容されている場合は、遠心分離前
にパラフィルムでチューブをシールします。
5. アデノウイルス関連の動物実験も BL-2 レベルで実施する必要があります。
6. アデノウイルス関連廃棄物は、処分前に特別に収集しオートクレーブする必要があります。
7. 実験後は消毒剤で手を洗います。
アデノウイルスの貯蔵と希釈
アデノウイルスの貯蔵
アデノウイルスは、受容後に使用する前に、4°C で短時間（1 週間未満）保存できます。アデノウイルスは凍結解
凍に敏感であり、凍結解凍を繰り返すと価数が低下するため、アリコットウイルス在庫は到着直後に -80°C 冷凍庫
で保管して長期使用する必要があります。一方、アデノウイルスが 12 か月以上保存されている場合は、使用前に
アデノウイルス価の再検出が推奨されます。
注：1.アデノウイルス価に悪影響を及ぼす場合には、繰り返しの凍結解凍サイクルを避ける必要があります（凍結
解凍サイクルごとに 10%~50%減少します）。Genemedi は、小型アリコット(200 μ l/チューブ)に組み換えら
れたアデノウイルス製品を提供し、複数の使用用に-80℃で直接保存できます。
2.6 ヶ月以上保存されたアデノウイルスについては、使用前にアデノウイルス価を再分析することが示唆されま
す。

12
アデノウイルスの希釈
組換えアデノウイルス冷凍アリコットを適切に解凍するには、アデノウイルスを -80℃の冷凍庫から完全に溶ける
まで氷水浴に移します。溶解したときは、適量の無菌 PBS または無血清培地を加え、4℃で 1 週間以内に保存しま
す。
注意事項
· 極端な環境へのアデノウイルス曝露を避ける(pH、エッタなどのキレート剤、温度、有機溶剤、タンパク質変
性剤、強力な洗剤など)
· 渦の発生、泡の吹き付け、または同様の操作中にアデノウイルスサンプルに空気を導入することを避け、タン
パク質の変性を引き起こす可能性があります。
· 繰り返しの凍結と解凍を避けてください。
· 「通常の」プラスチック(特にポリスチレンまたは疎水性プラスチック)に液相で長期間曝露しないようにして
ください。ほとんどのアデノウイルスは非常に粘着性があり、凍結しないとチューブ、細胞培養プレート、ピ
ペット先端などの通常のプラスチックにさらされると損失が発生する可能性があります。アデノウイルスをシリ
コン化または低タンパク質結合チューブに保存するのが最善です。プラロニック F-68 を配合緩衝液で
0.01%~0.1%で使用すると、通常のプラスチックを使用すると、付着が最小限に抑えられます。
· アデノウイルスを低塩溶液に希釈しないようにしてください。いくつかのアデノウイルスは低塩溶液に集ま
り、それは感染性ではありません。
参照
1. ルオ J.ら。アデージーシステムを用いた組換えアデノウイルスの迅速な生成プロトコル。ナット。プロトコル。2(5),1236-1247(2007).
2. 彼。C.他。組換えアデノウイルスを生成するための簡略化されたシステムと、PNAS.95,2509-2514(1998).
3. マイヤー O.J.遺伝子メド。6(補足 1)、S152~S163(2004)。
関連製品
1.aav 包装システム
詳細は、https://www.genemedi.net/i/aav-vector-system をご覧ください。

13
12
2. アデノウイルスの約束-ORFTM：
アデノウイルスおよび哺乳類の発現ベクターにおける配列検証された CDNA
クローン。詳細は、https://www.genemedi.net/i/virus-plasmid をご覧くだ
さい。
3. アデノウイルスのカスタム製造
詳細は、https://www.genemedi.net/i/adenovirus-customized-production-service をご覧くださ
い。
連絡先情報
ジェネメディバイオテクノロジー。株式会社。
アデノウイルスの詳細については、www.genemedi.net/i/adenovirus-packaging をご覧ください。
genemedi 製品の詳細および PDF 形式のマニュアルをダウンロードするには、当社の web サイト：
www.genemedi.net をご覧ください。
追加情報または技術支援については、お電話またはメールでお問い合わせください。
世界中で：86-21-
50478399 ファックス：
86-21-50478399
電子メール：support@genemedi.net
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아데노바이러스 생산 프로토콜
포장 농축 및 정화
게네메디
유전자 치료의 혁신

2
아데노바이러스(AdV)
재조합 아데노바이러스(AdV) 도입
재조합 아데노바이러스(rAdV)는 유전자 이전과 공학, 백신 접종, 유전자 치료를 포함한 다양한 목적에 널리 사용되는 복제 결함
의 아데노바이러스 매개체이다 [1,2]. 아데노바이러스를 유전자 전달 매개체로 사용하는 것은 몇 가지 장점이 있다. 첫째, 게놈에
외원성 조각을 삽입하지 않고도 세포와 조직으로 8 킬로염기(kb) 유전자 서열을 전달할 수 있다. 둘째, 거의 모든 분할과 비분할
된 세포, 원차 세포 및 기관 조직은 재조합 아데노바이러스에 의해 전환될 수 있다. 또한 재조합 아데노바이러스는 조작이 쉽고 대
규모로 확장되며 효율이 최대 100%에 달할 수 있다. 따라서 재조합 아데노바이러스는 유전자 공학 연구와 질병의 잠재적 치료에
서 중요한 역할을 한다.
가장 흔히 사용되는 아데노바이러스는 약 36kb 의 크기의 이중 사슬 선형 dna 분자로 구성된 호모 사피엔스의 혈청형 5(Ad5)이
다. 세포질막 수용체와 섬유는 아데노바이러스가 세포 세포질로 내세포를 유도하고, 아데노바이러스 입자는 숙주의 복제 기계를
이용하여 세포 핵으로 더 이동하여 자기 복제를 진행한다. 일단 복제되면 아데노바이러스 게놈은 단백질 껍데기에 집결되어 세포
에서 방출되어 세포의 분해를 일으킨다.
오늘날, 여러 개의 재조합 아데노바이러스 포장 시스템이 개발되었는데, 그 중 Adeasy1 과 Admax2 는 가장 인기있는 두 개이
며, 표적 유전자 서열을 아데노바이러스 발현 벡터(아데노바이러스 셔틀 벡터)로 복제한 후 바이러스 핵심 벡터로 재조합하는 공
통적인 전략을 공유한다. 초기 바이러스 전사 단위인 e1 과 e3 는 두 시스템에서 변화되지만 e3 유전자는 아데노바이러스의 복제
에 필요하지 않다 1. 따라서 재조합 아데노바이러스의 포장은 보통 hek-293, HEK-293A 등과 같은 e1 유전자를 발현하는 세포
계에서 이루어진다 [2].
Adeasy 에 비해 admax 시스템은 처리하기 쉽고 아데노바이러스 생산 과정에서 더 높은 아데노바이러스 적사를 달성할 수 있다.
이 재조합 아데노바이러스 프로토콜은 admax 시스템에 따라 개발되었으며, 서로 다른 프로모터와 태그를 가진 아데노바이러스
발현 플라스미드(아데노바이러스 셔틀 벡터)와 e1 영역이 삭제된 아데노바이러스 게놈 핵심 플라스미드로 구성된 이중 벡터 시스
템을 이용하였다.
프로토콜 개요
재조합 아데노바이러스(AdV) 생산에 대한 도표적 개요는 그림 1 과 같다. 첫 번째 단계는 관심 유전자(GOI)를 적절한 질체 매개
체로 복제하는 것이다. 대부분의 응용 프로그램에서 관심이 있는 cdna 는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터 중 하나로 복제됩니
다. 이러한 벡터에 존재하는 반전 단말기 반복(ITR) 서열은 재조합 아데노바이러스의 복제와 포장에 필요한 모든 cis 작용 원소를
제공한다.
재조합 발현 질립은 아데노바이러스 게놈 핵심 질립과 293a 세포(e1 보완 세포계)에 공동으로 전염되어 아데노바이러스 복제와
포장에 필요한 모든 트랜스작용 인자를 공급한다.

3
작은 플라크는 전염 후 10~21 일 현미경 아래에서 시각화될 수 있다. 3~6 개의 개별 플라크를 선택하여
그들의 아데노바이러스 적사를 비교한 다음 최고 적사를 가진 플라크를 선택하여 이후의 증폭, 농축 및 정
화 실험을 진행한다.
그림 1. 아데노바이러스 포장 실험 흐름도.
실험 재료
GeneMedi 의 아데노바이러스 운반체 시스템
GeneMedi 의 아데노바이러스 매개체 시스템은 아데노바이러스 발현 시스템이나 아데노바이러스 포장
플라즈드 시스템이라고도 불리며, 체외 유전자 전달, shrna 를 매개하는 rna 간섭(RNAi) 및 유전자 편집
을 위한 강력한 도구이다. genemedi 의 아데노바이러스 벡터 시스템을 사용하여 hek293 또는
hek293a 세포계에서 고효율의 재조합 아데노바이러스(r-AdV) 입자를 쉽게 재조합할 수 있다.
게네메디 아데노바이러스 매개체 시스템은 두 가지 유형의 아데노바이러스 포장 플라즈미드를 포함한다:
서로 다른 프로모터와 태그가 있는 아데노바이러스 발현 플라즈미드(아데노바이러스 셔틀 매개체)와 e1
영역이 삭제된 아데노바이러스 게놈 핵심 플라즈미드.

4
genemedi 는 다양한 발현 카세트를 가진 다양한 아데노바이러스 발현 매개체를 개발하였는데, gfp, zsgreen, RFP, mcherry,
루시페라아제를 포함한 검증된 촉진자 및 기자의 종류를 포함하였다. genemedi 의 아데노바이러스 발현 매개체는 독특한 유전
자 과발현이나 shrna 를 매개하는 노크다운(rna(rna 간섭)이라고도 한다. 당신은 또한 우리의 crispr-cas9-grna 아데노바이러스
발현 매개체를 사용하여 유전자 노크아웃(KO)이나 유전자 편집을 실현할 수 있다.
https://www.genemedi.net/i/adenovirus-vector-system 을 방문하여 genemedi 의 아데노바이러스 매개체 시스템과 여러
아데노바이러스 발현 매개체(아데노바이러스 셔틀 매개체)에 대한 자세한 내용을 보십시오.
박테리아 주
E. 대장주 dh5 는 아데노바이러스 발현 플라스미드(아데노바이러스 셔틀 매개체)와 아데노바이러스 핵심 매개체의 증폭에 사용된
다.
포장 세포 라인
293a 는 재조합 아데노바이러스의 초기 생성, 증폭 및 적사 측정을 용이하게 할 수 있는 아데노바이러스 포장 세포계이다. 이것은
아데노바이러스의 복제에 필요한 e1 단백질을 발현하는 붙박이 있는 상피 모양의 세포계이며, 합류할 때 단층으로 자란다. 이 세
포계는 293 세포계에서 유래하여 플라크 측정을 위해 설립되었으며, 이 세포계는 쉽게 처리할 수 있는 전염 숙주로 확인되었다.
293a 의 완전한 성장 배양기는 돌베코 개식 독수리 배양기(DMEM)로, 10% 태아소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트레프토마이
신(펜-스트레프)을 보충한다. 지속적인 배양의 경우, 세포는 적절한 특성을 유지하기 위해 70%의 합류를 초과해서는 안 된다. 일
반적으로 세포 통행 번호부터 시작하면 30 개 통행 이내에 최적의 결과를 얻을 수 있다. 일단 도달하면 예상치 못한 돌연변이와 불
건강한 성장이 발생할 경우 다른 냉동 주식에서 새로운 문화를 시작하는 것이 가장 좋다. 따라서 자신의 293a 동결 주식을 은행
하는 것은 실험의 무결성과 연속성을 보장하는 데 매우 중요하다. 대수 단계의 세포를 얼어붙이면 해동 후의 생존력이 향상된다.
알림:
만약 세포계가 바이코플라즈마에 오염된다면, 더 잘 배양되는 세포 상태에 도달하기 위해 genemedi 항바이코플라즈마 시약인
cureplasmatm 의 사용을 권장한다.
포장 세포 라인
관심 유전자 파운드
수프
석가와 석가로스 카
나마이신 암피실린
70 및 100% 에탄올 무균
pbs
염화세슘(CsCl) 염소표백제

5
dna 젤기구 및 전원 공급 장치 II 등급 생물
안전장
37℃ 궤도 흔들기 37℃
박테리아 부화기
37℃, 5% CO2 인큐베이터
15ml 및 50ml 원추관
25cm2 및 75cm2 조직 배양 병리 세포 스
크래퍼
건아이스/메탄올 목욕 액
질소 탱크
초원심분리기(Beckman) 또는 sw28 로터 저속 스윙-버킷 원심
분리기와 동등한
마이크로 원심기
원심기 튜브(뚜껑이 있는 두벽 폴리카보네이트 튜브) 링 스탠드
및 클램프, 3ml 주사기 및 18g 바늘
아데노바이러스의 포장 및 농도
아데노바이러스의 매개체 구축
재조합 아데노바이러스를 포장하기 전에 관심 유전자를 재조합 아데노바이러스 발현 매개체로 구축해야 한다. genemedi 는 또
한 다양한 아데노바이러스 매개체에 대체 촉진제와 형광 라벨을 제공한다(표 1). 게다가, genemedi 는 아데노바이러스-lc3 자가
식용량 검사 생물센서 등과 같은 유전자 도구를 가지고 있는 사전 제작된 아데노바이러스 매개체 상품을 많이 보유하고 있다.
https://www.genemedi.net/i/virus-plasmid 를 방문하여 genemedi 의 orf/cdna 의 사전 제작 아데노바이러스 발현 매개체에
대한 자세한 내용을 확인하십시오.
참고:
벡터를 빠르고 효율적으로 구축하기 위해 genemedi-cloneasytm 1 단계 복제 키트(cat.gm-gc-01/02/03)를 사용하는 것이 강
력하다.
visi thttp://www.genemedi.net/i/cloneasy-one-step-cloning-kitgenemedi-cloneasytm 1 단계 복제 키트에 대한 자세한
내용을 확인하십시오.
아데노바이러스 플라스미드를 293a 포장세포로 전염시키다
a. 293a 세포 배양은 전염되기 전에 50%-70%의 단층 형태의 합류점에 도달하기 위해 적어도 하루 전에 준비되어야 한다.
b. 전염된 당일, dmem 은 37℃의 물욕에서 사전 따뜻해야하며, lipogenetm 전염된 시약은 실온에 균형을 맞추고 사용하기
전에 섞어야 한다.
c. 60mm 접시를 사용하여 각 반응에 대해 바이러스 플라스미드를 준비합니다.

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표 1. 전염에 필요한 아데노바이러스 매개체 시스템 플라스미드 및 전염시약
구성 요소 금액
goi 와 함께 pad 표현식 벡터 2μg
아데노바이러스 게놈 핵심 4μg
지방 제품 30 개의 리터
d. 플라즈미드와 전염제 시약을 dmem 에서 혼합하고, 사전 파종된 293a 세포에 방울을 첨가한다. 37℃,
5% CO2 에서 부화하고 6 시간 안에 완전한 배양체로 새롭게 한다.
주의:
1. 상기 전염 시약의 상세한 프로토콜은 genemedi lipogenetm 전염 시약 사용자 설명서를 참조할 수
있다.
genemedi-lipogenetm 전염 시약에 대한 자세한 내용은 여기를 클릭하십시오.
2. 세포는 전염되기 전에 사용하기 위해 건강한 성장 상태에 있어야 한다.
플라크 형성 및 세포 채집
플라크는 아데노바이러스에 감염되면 세포병적 효과를 나타내는 단층 세포의 영역이며, 일반적으로 현미
경이나 육안으로 둥글고 짙은 세포나 흰색 반점으로 관찰된다(그림 1). 전염된 세포를 채취하기 전에 바이
러스 플라크를 관찰하는 것이 중요하다.
a. 아데노바이러스의 확산을 최소화하기 위해 아데노바이러스의 플라크 형성이 더 나은 상황을 얻기 위
해, 최종 농도가 1.25%인 정규 매질에 낮은 녹점의 아가로스를 첨가하는 것이 좋다.
b. 작은 플라크는 전염 후 10~21 일 현미경 아래에서 시각화될 수 있다. 만약 아데노바이러스 발현 질립
의 공학 서열이 형광 태그(gfp 또는 rfp)를 가지고 있다면, 플라크가 생성되기 전에 형광 현미경으로
전염 효율을 추정할 수 있다.
c. 분리된 바이러스 플라크를 주위의 아가로스와 함께 뽑아 1ml 의 신선한 매질에 옮겨 밤새 부화시킨다.
일반적으로 3~6 개의 플라크를 선택하여 그들의 아데노바이러스 적사를 비교해야 하며, 그 후 가장
높은 적사를 가진 플라크는 후속 실험으로 진행될 것이다.
그림 1. 플라크의 식별.

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참고:
고순도 저융점 아가로스의 원액은 무균 pbs 에서 최종 농도가 5%에 달할 수 있다. 사용하기 전에, 끓는 물욕에
서 주식을 완전히 녹이고, 상온에서 점차 45℃까지 식히십시오. 미리 가열된 37℃의 완전한 성장매질을 사용
하여 마지막 농도를 1.25%로 희석시킨다. 바로 잘 섞은 용액을 세포에 가볍게 넣고 앞에 배양체를 제거한 후
플라크 세포를 고르게 덮도록 회전한다. 6 정 접시의 경우, 정당 3 밀리리터의 아가로스/미디어를 첨가합니다.
전염된 세포를 채취하기 전에 바이러스 플라크를 관찰하는 것이 중요하다. 아데노바이러스의 전파를 최소화하
여 아데노바이러스의 플라크 형성을 더 나은 상태로 만들기 위해, 일반적인 매질에 낮은 녹점의 아가로스를 첨
가하는 것이 좋으며, 전염 후 10 일에서 21 일까지의 현미경 아래에서 작은 플라크를 시각화할 수 있다. 만약
아데노바이러스 발현 플라스미드(아데노바이러스 셔틀 벡터)의 공학 서열이 형광 태그(gfp 또는 rfp)를 가지고
있다면, 플라크가 생성되기 전에 형광 현미경으로 전염 효율을 추정할 수 있다.
아데노바이러스 증폭
a. 다음날, 신선한 293a 세포에 아데노바이러스를 함유한 상청액을 첨가하여 아데노바이러스를 증폭시킨다.
b. 플라크 형성을 관찰할 때 세포와 상청액을 수집하고, 모든 아데노바이러스를 수집하기 전에 3 번 동해주기
로 진행한다.
c. 채집된 아데노바이러스는 1 번째 통로(p1 아데노바이러스)로 인정된다. 그런 다음 신선한 293a 세포에 p1
아데노바이러스를 감염시킨다.
d. p4 아데노바이러스를 얻을 때까지 세 번의 감염-수집 주기를 수행하고 p4 아데노바이러스 감염을 통해 아
데노바이러스 생산을 대규모로 확대한다. 플라크의 형성을 관찰할 때, 아데노바이러스는 정화와 농축을 위
해 수집된다.
참고:
1. 세포를 분리하기 위해 트립신화 대신 세포 스크래퍼를 사용하십시오. 수집된 세포는 500g, 4℃에서 10 분
동안 원심분리되어야 한다. 가장 많은 상청액을 버리고 2ml 을 남겨 세포 펠릿을 다시 부상시키고, 냉동 및
해동을 위해 -80 ℃ 이하의 용기로 이동하십시오 (드라이 아이스 또는 액체 질소를 사용하십시오.
2. 아데노바이러스 중단이 완전히 녹을 때 아데노바이러스 적사가 감소하는 경우 37 ℃ 욕조에서 즉시 제거하
십시오. 완전히 녹은 서스펜션을 30 초 동안 크게 흔들어라. 일반적으로 2~4 차례의 동해주기는 높은 적사
량의 아데노바이러스의 생산량을 향상시킬 수 있다.
3. 동결-해동 주기 후에, 아데노바이러스 분해액은 세포 잔해를 제거하기 위해 500g, 4℃에서 10 분 동안 원
심분리되고 나중에 사용하기 위해 -80℃에서 저장될 수 있습니다.
아데노바이러스 정화
재조합 아데노바이러스의 정화 과정은 peg8000 응축, cscl 밀도 그라데이션 원심분리와 투석 등 세 단계로 구
성된다. 상세한 작업 과정은 다음과 같습니다.

8
a. 해동: 아데노바이러스를 -80 센티그레드에서 하루 앞당겨 꺼내고 실온에서 물욕에서 녹으십시오. 10 분 동안 7000 g, 4℃에
서 원심분리하고 상청액을 수집합니다.
b. peg8000 응축: 100ml 의 상청액당 50ml 의 peg8000 용액(2.5mnacl 의 초순수한 물에 peg8000)을 첨가하고, 아데노바
이러스를 끌어내기 위해 1 시간 동안 얼음에 놓으십시오 (얼음에 부화하는 시간은 상대적으로 연장될 수 있다). 혼합물을
7000g, 4℃에서 20 분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고 아데노바이러스 알갱이를 10ml 의 cscl 용액에 1.10g/ml 의 밀
도로 다시 부유시킨다(cscl 의 용매는 20mm tris-hcl, pH8.0, 표 2 의 아래 cscl 용액 제조 방법을 참조하십시오). 아데노바
이러스를 함유한 cscl 용액은 분홍색이어야 한다(그림 2).
표 2. cscl 솔루션 준비.
20℃(g/ml) 밀도 농도 ml/ml cscl 양(g) 최종 부피(ml)
1.40 548.3 5.483 10
1.30 402.4 4.024 10
1.20 143.8 1.438 10
c. cscl 밀도 그라데이션 원심분리: 원심분리관 바닥에 1.40g/ml cscl 용액의 2ml 을 놓고, 다음에 1.30g/ml cscl 용액의 3ml
을 천천히 첫 번째 층에 추가한 다음 5ml 의 아데노바이러스 현탁액을 추가합니다. 2 시간 동안 26,000rpm 에서 beckman
sw28 로터를 가진 원심기, 4℃에.
그림 2. cscl 밀도 그라데이션 원심분리 공정. 왼쪽 패널: 초원심분
리하기 전에 cscl 그라데이션. 오른쪽 패널: 초원심 후 cscl 그라데
이션.
d. 아데노바이러스 수집: 주사기로 1.30g/ml 과 1.40g/ml 의 층들 사이에 아데노바이러스 밴드를 수집하고 투석 봉지로 전송합
니다.
참고:
투석 봉지를 10mm 의 edta-na2 에 10 분 동안 끓여 실온까지 냉각시켜 사용하십시오.
e. 투석: 투석 완충기에 아데노바이러스가 포함된 투석 봉지를 넣으십시오 (자당 50g, 10ml 1m tris-hcl, PH 8.0, 2ml 1m
mgcl2, 증류수로 최대 1l), 밤새 4℃에서 섞으십시오. 투석 중에 신선한 완충기로 한 번 교체하세요.
f. 배합: 봉지에서 아데노바이러스를 수집하고, pbs 로 500μl 로 부피를 조정하고, 적사를 결정한다. 정화된 재조합 아데노바이
러스는 장시간 저장을 위해 일주일 이상 또는 -80℃에서 4 ℃에 유지되어야 합니다.

9
정제 재조합 아데노바이러스의 적정
재조합 아데노바이러스의 적사 측정 방법은 플라크 측정이다. 플라크 형성 단위(PFU)는 일정 부피의 아데
노바이러스에 의해 유도된 플라크 수로 활성 바이러스 입자의 농도를 나타낸다.
재조합 아데노바이러스 플라크 측정:
a. 적어도 하루 전에 60mm 접시의 293a 세포를 판다.
b. 세포 합류가 약 도달할 때 100%, 서로 다른 농도의 희석된 아데노바이러스를 추가하여 37℃에서 부
화한다.
c. 감염 후 4~8 시간, 8ml 의 저융점 아가로스 용액(10% FBS, 1.25% 아가로스)으로 세포를 덮어라.
d. 배양된 9-11 일의 플라크 수를 계산함으로써 재조합 아데노바이러스의 적사를 계산한다.
참고:
재조합 아데노바이러스의 효율은 적용할 때 형광을 관찰하거나, 표적 유전자의 발현 수준에서 웨스턴 블
로팅(WB), 면역 형광(IF) 및 면역 조직 화학(IHC) 검사를 통해 측정할 수 있다.
표적 세포의 전도
모이가 세포계에 따라 다르기 때문에, 공식적인 실험을 하기 전에 표적 세포의 적절한 모이를 보장하기 위
해 초보적인 실험이 필요하다.
참고:
MOI: 감염의 다중성은 하나의 세포에 감염되는 바이러스 입자의 수이다. 특정 세포에 대한 실제 moi 는
다른 실험실에서 아데노바이러스를 다루는 조작과 방법에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 moi 의 최적
화 테스트를 강력히 권장한다.
세포 준비
견고한 표적 세포를 1x105/ml 의 밀도로 24 정의 플레이트로 만듭니다.
참고:
심은 세포의 수는 관련 세포계의 성장속도에 따라 달라진다. 다음날 50~70%의 합류에 도달해야 한다.
재조합 아데노바이러스 moi 테스트
아데노바이러스를 10 배의 희석 그라데이션으로 준비하고, moi 가 3~1000 범위 내에 있도록 보장한다.

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제 0 일: 1x105/ml 의 밀도로 양호한 상태의 플레이트 표적 세포가 96 개의 플레이트로 구성되어 있으며, 1 개의 플레이트당
100μl 이다. 하룻밤 사이에 37℃에서 부화한다.
1 일: 6moi 그라데이션으로 아데노바이러스를 준비하고, 표적 세포의 완전한 배양기에서 적당량의 아데노바이러스 현탁액을 최
종 부피로 100μl 로 희석시킨다(moi=3, 10, 30, 100, 300, 1000 을 설정한다). 희석된 아데노바이러스를 사전 파종된 세포에
넣고 37℃에서 4~8 시간 동안 부화한 다음 매질을 새로 고치고 아데노바이러스를 제거한다.
3 일: 현미경으로 형광을 검사합니다. 형광 세포의 비율에 따라 moi 를 계산합니다.
참고:
만약 아데노바이러스가 형광 표지가 없다면, moi 는 qpcr, WB, IF, IHC 등으로 측정할 수 있다.
전도
아데노바이러스를 10 배의 희석 그라데이션으로 준비하고, moi 가 3~1000 범위 내에 있도록 보장한다.
a. 부착된 세포의 경우:
표적 유전자와 같은 양의 대조 아데노바이러스를 함유한 재조합 아데노바이러스를 두 세포에 별도로 첨가하고 잘 섞어야 한다. 사
용할 아데노바이러스의 양은 아래 표에 설명된 용기의 크기에 따라 결정됩니다. 대부분의 세포 유형의 moi 테스트의 경우, 세 번
의 복제에서 3, 10, 30, 100, 300 에서 1000 의 경도가 충분하다. 4~8 시간 안에 미디어를 새로 고침. 관심의 단백질은 형광 현
미경, WB 등으로 48-72 시간 이내에 검출할 수 있다.
표 3. 아데노바이러스는 다른 용기 크기에 있는 양입니다.
컨테이너 크기 표면 면적(cm2)
96 -
볼륨
매질 부피 의
정 0.3
24 -
100μl 0.1-0.5μl
응 2
12 -
500μl 1-3μl
응 4
6 -
1ml 2-5μl
응 10 2ml 5-20μl
예를 들어, 재조합 아데노바이러스의 층이 5×1011pfu/ml 인 경우, 표적 세포의 완전한 성장 매질로 5×1010pfu/ml(10 배)로
희석시킨다. 1 개의 우물에 1×105 세포가 있고 MOI 가 1000 일 경우 희석된 아데노바이러스의 필요한 부피(5×1010pfu/ml)는
세포수 × MOI÷ 재조합 아데노바이러스의 PFU/ml=1×105×1000/5×1010(ml)=2µl 이어야 한다. 따라서 2ul 의 희석된 아데
노바이러스를 이 우물에 넣어야 한다.
참고:
폐기물은 생물 안전 요구 사항 섹션에 설명된 절차에 따라 처리되어야 한다.
b. 현상 세포의 경우:
스핀 감염은 현상 또는 반현상 세포를 전환하는 충분한 방법이다. 간단히 말해서, 아데노바이러스를 첨가한 후, 세포 배양판을 파막
으로 밀봉하고, 저속 흔들리는 원심분리기에서 200g 에서 37℃에서 1 시간 동안 회전한다.

11
하룻밤 사이에 37℃에서 세포를 배양합니다. 미디어는 다음날 새로 고쳐야 합니다.
만약 스핀 감염이 허용되지 않는다면, 세포를 튜브로 옮기고 저속으로 원심분리기로 대신 원심분리기 튜브를 사용할
수 있다. 원심분리한 후 상청액의 대부분을 버리고 아데노바이러스를 첨가한 후 실온에서 15-30 분 동안 부화한다.
그런 다음 세포-아데노바이러스 혼합물을 적절한 용기에 옮겨 하룻밤 사이에 37℃에서 배양한다. 미디어는 다음날
교체해야 한다.
전도 효율을 결정하다
전달 후 48 시간에서 72 시간, 적용할 때 형광 단백질을 관찰할 수 있으며, qpcr 를 이용하여 mrna 수준에서 또는
WB 를 이용하여 단백질 수준에서 표적 유전자의 변화를 분석할 수 있다.
아데노바이러스의 안전한 사용
1. 아데노바이러스 관련 실험은 생물 안전 2 급 시설(bl-2 급) 내에서 진행되어야 한다.
2. 실험실 코트, 마스크, 장갑을 완전히 갖추고 손과 팔을 노출하지 않도록 최선을 다해 주십시오.
3. 아데노바이러스 현액을 뿌리지 않도록 조심하세요. 만약 생물 안전 캐비닛이 작동 중에 아데노바이러스에 오염되
면, 즉시 70% 알코올과 1% sds 를 포함한 용액으로 탁자 보드를 닦아라. 모든 첨단, 튜브, 배양판, 아데노바이러스
와 접촉하는 매질은 폐기하기 전에 염소를 함유한 소독액에 담그어야 한다.
4. 원심분리가 필요하다면 원심분리기 튜브를 단단히 밀봉해야 한다. 조건이 허용되면 원심분리하기 전에 파라필름
으로 튜브를 밀봉합니다.
5. 아데노바이러스 관련 동물 실험도 bl-2 수준에서 진행되어야 한다.
6. 아데노바이러스와 관련된 폐기물은 처리하기 전에 특별히 수집하고 자제해야 한다.
7. 실험 후 세정제로 손을 씻어라.
아데노바이러스의 저장 및 희석
아데노바이러스 저장
아데노바이러스는 수신 후에 사용하기 전에 짧은 시간 (일주일 미만)에 4 ° c 에 저장될 수 있습니다. 아데노바이러
스는 얼음-해동에 민감하며, 얼음-해동이 반복되면 적량이 떨어지기 때문에, 알리코트 바이러스 재고는 도착하면 즉
시 -80°C 냉동고에서 장기간 사용해야 한다. 아데노바이러스가 12 개월 이상 보관되어 있다면 사용하기 전에 아데
노바이러스의 적정을 재검사하는 것이 좋습니다.
주: 1. 아데노바이러스의 적사량에 악영향을 미치는 경우 반복적인 동해주기는 피해야 한다(동해주기마다 10%-
50%의 감소가 있을 것이다). genemedi 는 다중 사용을 위해 -80℃에서 직접 저장할 수 있는 작은 aliquot(200
µl/tube)에 재조합 아데노바이러스 제품을 제공합니다.
2. 6 개월 이상 저장된 아데노바이러스의 경우, 사용 전에 아데노바이러스의 적사를 재분석하는 것이 시사적이다.

12
아데노바이러스 희석
재조합 아데노바이러스가 얼어붙은 aliquot 를 적절히 해동시키기 위해 -80℃ 냉동고에서 아데노바이러스를 완전히 녹일 때까지
얼음수욕장으로 옮긴다. 녹으면 적당량의 무균 pbs 나 무혈청 배양체를 추가하고 4℃에서 일주일 이상 유지하십시오.
주의사항
· 아데노바이러스가 환경적으로 극단적인 환경(pH, edta 와 같은 킬레이트제, 온도, 유기용매, 단백질 변성제, 강한 세제 등)에
노출되는 것을 피합니다.
· 소용돌이, 거품 불기 또는 유사한 작업 중에 아데노바이러스 샘플에 공기를 유입하는 것을 피하십시오. 이는 단백질 변성을
초래할 수 있다.
· 반복적인 얼음과 해동을 피하세요.
· 액상에서 장기간 '일반적' 플라스틱(특히 폴리스티렌이나 소수성 플라스틱)에 노출되지 않도록 하십시오. 대부분의 아데노바
이러스는 매우 끈적끈적하며, 파이프, 세포 배양 판, 피펫 끝을 포함한 일반적인 플라스틱에 노출되면 손실이 발생할 수 있다. 아
데노바이러스를 실리콘화 또는 낮은 단백질 결합관에 저장하는 것이 가장 좋다. Pluronic f-68 은 0.01%-0.1%의 배합 완충기에
서 사용되는 일반적인 플라스틱을 사용하는 경우 점착을 최소화합니다.
· 아데노바이러스를 저염용액으로 희석시키는 것을 피하십시오. 일부 아데노바이러스는 저염용액에 모여 전염성이 없다.
참조
1. 루오 J. 등이 있다. Adeasy 시스템을 사용하여 재조합 아데노바이러스를 빠르게 생성하는 프로토콜 나트. 프로토콜. 2 (5), 1236-1247 (2007).
2. 그는. c. 등. 재조합 아데노바이러스를 생성하는 간소화된 시스템 PNAS. 95, 2509-2514 (1998).
3. 마이어 O. & 그레버 U. F. 아데노바이러스 내세포 증발. J. 유전 메드. 6(Suppl 1), S152-S163(2004).
관련 제품
1. aav 포장 시스템
자세한 내용은 https://www.genemedi.net/i/aav-vector-system 을 참조하십시오.

13
12
2. 아데노바이러스 약속-orftm:
아데노바이러스와 포유동물 발현 매개체에서 서열 검증된 cdna 복제 자세한 내
용은 https://www.genemedi.net/i/virus-plasmid 를 참조하십시오.
3. 아데노바이러스 맞춤형 생산
자세한 내용은 https://www.genemedi.net/i/adenovirus-customized-production-service 를 참조
하십시오.
연락처 정보
제네메디 바이오테크놀로지 Inc.
아데노바이러스에 대한 자세한 내용은 www.genemedi.net/i/adenovirus-packaging 를 참조하십시오.
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протокол производства
аденовируса
концентрация и очистка упаковки
Джин Меди
инновации в генной терапии

2
аденовирус (AdV)
внедрение рекомбинантного аденовируса (AdV)
Рекомбинантный аденовирус (rAdV) — это аденовирусный вектор с дефектом репликации, который широко
используется для различных целей, включая перенос генов и инженерия, вакцинацию и генную терапию [1,2]. есть
несколько преимуществ использования аденовируса в качестве медиатора переноса генов. во-первых, он может
доставлять в клетки и ткани последовательности генов размером до 8 килоосновых (кб) без вставки экзогенного
фрагмента в геном. во-вторых, почти все делящиеся и неделящиеся клетки, первичные клетки и ткани органов могут
трансдуцироваться рекомбинантным аденовирусом. Кроме того, рекомбинантный аденовирус прост в эксплуатации и
расширяется в больших масштабах, а эффективность может достигать 100%. Таким образом, рекомбинантный
аденовирус играет важную роль в исследованиях генной инженерии и потенциальном терапевтическом лечении
заболеваний.
Наиболее часто используемым аденовирусом является серотип 5 (Ad5) homo sapiens, состоящий из двухцепочечной
линейной молекулы ДНК размером около 36 кб 1. рецепторы и волокна цитоплазматической мембраны облегчают
эндоцитоз аденовируса в цитоплазму клеток, где частицы аденовируса дальше мигрируют в ядро клеток для
саморепликации с помощью механизма репликации хозяина [3]. После репликации геном аденовируса собирается в его
белковую оболочку и высвобождается из клеток, вызывая лизис клеток [3].
В настоящее время разрабатывается несколько систем упаковки рекомбинантных аденовирусов, в которых adeasy1 и
admax2 являются двумя наиболее популярными, разделяя общую стратегию, согласно которой целевая
последовательность генов клонируется в вектор экспрессии аденовируса (аденовирусный челночный вектор), а затем
рекомбинируется в вирусный магистральный вектор. ранние единицы транскрипции вируса e1 и e3 дефектируют в
обеих этих системах, в то время как ген e3 не необходим для репликации аденовируса1. Таким образом, упаковка
рекомбинантного аденовируса обычно проводится в клеточных линиях, экспрессирующих ген e1, таких как hek-293,
HEK-293A и т. д. [2].
по сравнению с adeasy, система admax относительно проста в обращении и может достичь более высокого титра
аденовируса во время производства аденовируса. этот рекомбинантный аденовирусный протокол разработан в
соответствии с системой admax с использованием двухвекторной системы, состоящей из плазмид экспрессии
аденовируса (аденовирусные челночные векторы) с различными промоторами и тегами, и магистральной плазмиды
генома аденовируса с удалением области e1.
обзор протокола
Схематический обзор производства рекомбинантного аденовируса (AdV) показан на рисунке 1. первым шагом является
клонирование интересующего гена (GOI) в соответствующий плазмидный вектор. для большинства приложений
интересующая КДНК клонируется в один из векторов экспрессии рекомбинантных аденовирусов. последовательности
перевернутого терминального повторения (итр), присутствующие в этих векторах, обеспечивают все элементы цис-
действия, необходимые для репликации и упаковки рекомбинантного аденовируса.
рекомбинантная экспрессионная плазмида ко-трансфицируется в клетки 293a (e1-комплементирующая клеточная
линия) с хребточной плазмидой генома аденовируса, которая вместе обеспечивает все факторы транс-действия,
необходимые для репликации и упаковки аденовируса.

3
мелкие бляшки можно визуализировать под микроскопом через 10-21 день после трансфекции. выберите от
трех до шести отдельных бляшек и сравните их титр аденовируса, затем выберите ту с самым высоким
титром, чтобы провести последующие эксперименты по амплификации, концентрации и очистке.
рисунок 1. Блок-схема эксперимента по упаковке аденовируса.
экспериментальные материалы
аденовирусная векторная система генемеди
Система аденовирусных векторов GeneMedi, также называемая системой экспрессии аденовируса или
системой плазмидной упаковки аденовируса, является мощным инструментом для доставки генов in vitro и
in vivo, интерференции РНК (RNAi), опосредованной Shrna, и редактирования генов. вы можете легко
рекомбинировать и получить частицу рекомбинантного аденовируса (r-AdV) в клеточной линии hek293 или
hek293a с высоким титром, используя систему аденовирусных векторов генемеди.
система аденовирусных векторов генемеди, включающая в себя два типа аденовирусных упаковочных
плазмид: экспрессионные плазмиды аденовируса (аденовирусные челночные векторы) с различными
промоторами и тегами, и магистральную плазмиду генома аденовируса с делецией области e1.

4
Genemedi разработал различные векторы экспрессии аденовирусов с различными кассетами экспрессии,
содержащие виды проверенных промоторов и репортеров, включая gfp, zsgreen, RFP, mcherry и люциферазу.
Векторы экспрессии аденовирусов genemedi оказались очень подходящими для уникальной сверхэкспрессии
генов или нокдауна, опосредованного сжимом (также называемого rnai (РНК-интерференция)). Вы также можете
добиться нокдаута генов (ко) или редактирования генов с помощью нашего вектора экспрессии аденовируса
crispr-cas9-grna.
Посетите https://www.genemedi.net/i/adenovirus-vector-system для получения дополнительной информации о
аденовирусной векторной системе генемеди и нескольких векторах экспрессии аденовирусов (аденовирусные
челночные векторы).
бактериальный штамм
Штамм E. coli dh5ɑиспользуется для амплификации аденовирусных экспрессионных плазмид (аденовирусных
челночных векторов) и аденовирусных магистральных векторов.
линия упаковочных ячеек
293a-это линия упаковочных клеток аденовируса, которая может облегчить первоначальное производство,
амплификацию и определение титра рекомбинантного аденовируса. это адгезивная эпителиально-подобная
клеточная линия, экспрессирующая белки e1, необходимые для репликации аденовируса, и при слиянии вырастает
в монослой. Эта клеточная линия, возникшая из клеточной линии 293 и созданной для анализа бляшек, была
идентифицирована как простой в обращении хозяин трансфекции.
Полная среда для роста 293a представляет собой модифицированную орлиную среду Дулбекко (дмем),
дополненную 10% плодной бычьей сывороткой крови (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином (пен-
стрептомицином). для непрерывной культуры клетки не должны превышать 70% слияния для поддержания
надлежащих характеристик. обычно, начиная с клеточного прохода номер один, оптимальные результаты можно
получить в течение 30 проходов. после достижения лучше начать новую культуру из другого замороженного
запаса на случай каких-либо неожиданных мутаций и нездорового роста. поэтому банкирование собственных
замороженных акций 293a очень важно для обеспечения экспериментальной целостности и преемственности.
замерзшие клетки на логарифмической фазе повысят жизнеспособность после оттаивания.
уведомления:
если клеточная линия загрязнена микоплазмой, чтобы достичь лучшего состояния культивирования клеток, мы
рекомендуем использовать антимикоплазменный реагент генемеди куреплазматм.
линия упаковочных ячеек
Интересный ген
фунт бульон
агар и агароза
канамицин
ампициллин
70 и 100% этаноловый
стерильный pbs
хлорид цезия (CsCl)
хлорный отбеливатель

5
Гелевые аппараты и источники питания
ДНК шкафы биобезопасности II класса
37 орбитальный
℃
шейкер 37 инкубатор
℃
бактерий
37 , 5% инкубатор CO2
℃
Конические трубки 15 и 50 мл
Колбы для культивирования тканей
размером 25 и 75 см2 для скребок
клеток
резервуар для жидкого
азота для сухого
льда/метаноловой
ванны
ультрацентрифуга (бекман) или эквивалент с
низкоскоростной центрифугой с качанием с ротором sw28
микроцентрифуга
центрифугационная трубка (толстостенная
поликарбонатная трубка с крышкой) кольцевая подставка и
зажим, шприцы объемом 3 мл и иголки объемом 18 г
упаковка и концентрация аденовируса
векторная конструкция аденовируса
перед упаковкой рекомбинантного аденовируса интересующий ген должен быть построен в вектор экспрессии
рекомбинантного аденовируса. Genemedi также предоставляет различные аденовирусные векторы с альтернативными
промоторами и флуоресцентными маркировками (таблица 1). Более того, у genemedi есть множество предварительно
сделанных аденовирусных векторов с некоторыми генетическими инструментами, такими как биосенсоры для
обнаружения аутофагического потока аденовирус-lc3 и т. д.
Посетите https://www.genemedi.net/i/virus-plasmid, чтобы узнать больше о предварительно сделанных векторах
экспрессии аденовирусов orf/cdna генемеди.
Примечание:
Для быстрого и эффективного построения векторов настоятельно рекомендуется использовать комплект
одноступенчатого клонирования genemedi-cloneasytm (Cat. GM-GC-01/02/03).
Visit https://www.genemedi.net/i/cloneasy-one-step-cloning-kit, чтобы узнать больше о комплекте одношагового
клонирования genemedi-cloneasytm
трансфекция аденовирусных плазмид в упаковочные клетки 293a
a. Культура клеток 293a должна быть приготовлена как минимум за день до того, как до трансфекции она достигает
слияния монослойной морфологии 50%-70%.
b. В день трансфекции DMEM необходимо предварительно нагреть при водяной ванне 37 ° C, а реагент для
трансфекции липогенетма должен быть сбалансирован до комнатной температуры и перемешит его перед
использованием.
c. приготовить вирусные плазмиды для каждой реакции с использованием 60 мм тарелки:

6
таблица 1. Плазмиды аденовирусной векторной системы и трансфекционные реагенты, необходимые для
трансфекции.
компонент, компонент сумма суммы
вектор выражения pad с goi 2 мкг
геномный костяк аденовируса 4 µg
липогенетм 30 мкл
г. смешайте плазмиды с трансфекционным реагентом в dmem и добавьте капли в предварительно посеянные клетки 293a.
Инкубируйте при 37 , 5% CO2 и освежьте полной средой в течение 6 часов.
℃
1. Подробный протокол трансфекционного реагента можно ссылаться на руководство пользователя
трансфекционного реагента genemedi lipogenetm.
Нажмите здесь, чтобы узнать больше о реагенте для трансфекции генемеди-липогенетма.
2. клетки должны находиться в здоровом состоянии роста для использования до трансфекции.
образование бляшек и сбор клеток
Бляшка представляет собой область монослойных клеток, которые демонстрируют цитопатический эффект при
заражении аденовирусами, обычно наблюдается как круглые, более темные клетки или белые пятна с помощью
микроскопа или невооруженного глаза (рис. 1). важно наблюдать за вирусными бляшками перед сбором
трансфекцированных клеток.
a. для минимизации распространения аденовируса для лучшего состояния образования аденовирусных бляшек
рекомендуется добавлять агарозу с низкой температурой плавления в обычную среду с конечной концентрацией
1,25%.
b. мелкие бляшки можно визуализировать под микроскопом через 10-21 день после трансфекции. если инженерная
последовательность в плазмиде экспрессии аденовируса несет флуоресцентные метки (gfp или rfp), эффективность
трансфекции можно оценить с помощью флуоресцентной микроскопии перед образованием бляшек.
c. выберите изолированную вирусную бляшку вместе с окружающей агарозой, перенесите в 1 мл свежей среды и
инкубируйте за ночь. как правило, для сравнения их аденовирусного титра следует выбрать от трех до шести
бляшек, затем бляшка с самым высоким титром будет передана в последующие эксперименты.
рисунок 1. идентификация таблички.

7
первичный раствор агарозы высокой чистоты с низкой температурой плавления может быть приготовлен в
стерильных ПБС до конечной концентрации 5%. Перед использованием полностью растопите бульон в кипяченой
ванне и постепенно охладите до 45 при комнатной температуре. Разбавьте первичный раствор агарозы с
℃
использованием предварительно разогретой полной среды роста 37 до конечной концентрации 1,25%.
℃
немедленно и аккуратно добавьте хорошо смешанный раствор в клетки с удаленной культуральной средой
впереди и поверните, чтобы равномерно покрыть клетки бляшек. Для тарелки из 6 скважин добавьте 3 мл
агароза/среды на скважин.
важно наблюдать за вирусными бляшками перед сбором трансфекцированных клеток. для минимизации
распространения аденовируса для улучшения состояния образования аденовирусных бляшек рекомендуется
добавлять агарозу с низкой температурой плавления в обычную среду, а небольшие бляшки можно
визуализировать под микроскопом через 10-21 день после трансфекции. если инженерная последовательность в
плазмидах экспрессии аденовируса (аденовирусные челночные векторы) несет флуоресцентные метки (gfp или
rfp), эффективность трансфекции можно оценить с помощью флуоресцентной микроскопии перед образованием
бляшек.
аденовирусная амплификация
a. на следующий день добавьте супернатант, содержащий аденовирус, в свежие, предварительно посеянные
клетки 293a для амплификации аденовируса.
b. собирать клетки и супернатант при наблюдении за образованием бляшек и переходить в цикл замораживания-
оттаивания 3 раза, прежде чем собирать все аденовирусы.
c. собранный аденовирус признается пассажиром 1 (аденовирус p1). затем заразите свежие клетки 293а
аденовирусом p1.
d. выполнять цикл сбора инфекции в течение трех раз до получения аденовируса р4 и расширять производство
аденовируса в крупномасштабном масштабе посредством аденовируса р4. при наблюдении образования
бляшек собираются аденовирусы для очистки и концентрации.
1. используйте клеточный скребок вместо трипсинизации для отделения клеток. собранные клетки должны
центрифугироваться при 500 г, 4 в течение 10 минут. Выбросьте наибольшее количество супернатанта и
℃
оставьте 2 мл для повторной суспензии клеточных гранул и перенесите в контейнер при температуре ниже -
80 ° C (с использованием сухого льда или жидкого азота) для заморозки и оттаивания.
2. Когда суспензия аденовируса полностью растает, немедленно удалите из ванны 37 на случай какого-либо
℃
снижения титра аденовируса. сильно встряхните полностью расплавленную подвеску в течение 30 секунд.
обычно двух-четыре раунда цикла замораживания-оттаивания могут улучшить выход аденовирусов с
высоким титром.
3. после циклов замораживания-оттаивания аденовирусный лизит можно центрифугировать при 500 г, 4 в
℃
течение 10 минут для удаления клеточных обломков и хранить при -80 для последующего использования.
℃
очистка аденовируса
Процесс очистки рекомбинантного аденовируса состоит из трех этапов: конденсации peg8000, центрифугирования с
градиентом плотности cscl и диализа. Подробный процесс работы следующий:

8
a. оттаивание: удалите аденовирус от -80 градусов за день и расплавьте в водяной ванне при комнатной
температуре. Центрифуги при 7000 г, 4 в течение 10 минут и соберите супернатант.
℃
b. Конденсация peg8000: добавьте 50 мл раствора peg8000 (20% peg8000 в сверхчистой воде с 2,5 м nacl) на 100
мл супернатанта, поместите на льд в течение 1 часа, чтобы вытянуть аденовирусы (время инкубации на льду
может быть относительно продлено). Центрифугируйте смесь в течение 20 минут при 7000 г, 4 , отбросьте
℃
супернатант и повторно суспендируйте аденовирусные гранулы в 10 мл раствора cscl с плотностью 1,10 г/мл
(растворитель cscl составляет 20 мм три-гкл, ph8,0, пожалуйста, см. следующий способ приготовления
раствора cscl в таблице 2). раствор cscl, содержащий аденовирус, должен быть розовым (рисунок 2).
таблица 2. Приготовление раствора cscl.
плотность при 20 ℃
(г/мл)
концентрация (мл/мл) Количество cscl (g) конечный объем (мл)
1.40 548.3 5.483 10
1.30 402.4 4.024 10
1.20 143.8 1.438 10
c. Центрофугация с градиентом плотности cscl: поместите 2 мл раствора cscl 1,40 г/мл на дно центрифужной
трубки, затем медленно добавьте 3 мл раствора cscl 1,30 г/мл на первый слой, затем добавьте 5 мл
аденовирусной суспензии. центрифуга с ротором Beckman sw28 при 26 000 об/мин, 4 в течение 2 часов.
℃
рисунок 2. Процесс центрифугирования с градиентом
плотности cscl. Левая панель: градиент cscl перед
ультрацентрифугированием. Правая панель: градиент
cscl после ультрацентрифугирования.
d. Сбор аденовируса: соберите полосу аденовируса между слоями от 1,30 г/мл до 1,40 г/мл шприцом и
перенесите в мешок для диализа.
Диализный мешок следует варить в 10 мм edta-na2 в течение 10 минут и охладить до комнатной температуры перед использованием.
e. Диализ: поместите диализный мешок с аденовирусом в диализный буфер (50 г сахарозы, 10 мл 1 м трис-гкл, ph
8,0, 2 мл 1 м mgcl2, до 1 л дистиллированной водой) и перемешивайте при 4 ° C за ночь. Во время диализа
замените свежий буфер один раз.
f. формула: соберите аденовирус из мешка, регулируйте объем до 500 мкл с помощью pbs и определите титр.
Очищенный рекомбинантный аденовирус должен храниться в температуре 4 ° C в течение не более недели
или в -80 ° C в течение длительного времени.

9
титрение очищенного рекомбинантного аденовируса
Методом определения титра рекомбинантного аденовируса является анализ бляшек. Единица формирования
бляшек (PFU) представляет собой количество бляшек, индуцированных определенным объемом аденовируса, и
представляет собой концентрацию активных вирусных частиц.
Анализ бляшек рекомбинантного аденовируса:
a. пластинка 293а ячеек в 60-мм тарелках не менее чем за день.
b. когда слияние клеток достигает примерно. 100%, добавьте разбавленный аденовирус в различных
концентрациях и инкубируйте при 37 .
℃
c. Через 4-8 часов после заражения покрывайте клетки 8 мл раствора агарозы с низкой температурой плавления
(10% FBS, 1,25% агарозы).
d. рассчитать титр рекомбинантного аденовируса путем подсчета количества бляшек за 9-11 дней
культивирования.
титр рекомбинантного аденовируса также можно определить путем наблюдения флуоресценции, когда это
применимо, или с помощью метода вестерн-боттинга (WB), иммунофлуоресценции (IF) и
иммуногистохимического обнаружения (IHC) на уровне экспрессии генов-мишеней.
трансдукция целевых клеток
поскольку мои варьируются в разных линиях клеток, предварительный эксперимент необходим для обеспечения
правильного мои клеток-мишеней перед проведением формальных экспериментов.
MOI: множество инфекций — это количество вирусных частиц, заражающих одну клетку. Настоятельно
рекомендуется оптимизировать тест мои, поскольку на реальный мои определенных клеток могут влиять
операции и методы борьбы с аденовирусами в разных лабораториях.
клеточная подготовка
пластины прочные клетки-мишени в пластины с 24 скважинами с плотностью 1 x 105/мл.
количество посаженных клеток зависит от скорости роста соответствующей клеточной линии. Слияние от
50% до 70% должно быть достигнуто на следующий день.
мой тест рекомбинантного аденовируса
приготовьте аденовирус в 10-кратном градиенте разбавления и убедитесь, что мои находится в диапазоне от 3 до
1000.

10
день 0: клетки-мишени пластины в хорошем состоянии с плотностью 1 x 105/мл в пластины с 96 скважинами, 100 мкл
на скважину. Инкубируйте при 37 за ночь.
℃
день 1: приготовьте аденовирус в градиенте шести мой и разбавьте соответствующее количество суспензии
аденовируса в полной культуральной среде клетки-мишени до конечного объема 100 мкл (установление мой = 3, 10, 30,
100, 300, 1000). Добавьте разбавленные аденовирусы в предсеянные клетки и инкубируйте в течение 4-8 часов при 37
, затем освежите среду для удаления аденовирусов.
℃
день 3: обнаружить флуоресценцию с помощью микроскопа. Рассчитайте мои на основе соотношения флуоресцентных
ячеек.
если аденовирус не помечен флуоресценцией, moi можно определять с помощью qpcr, WB, IF, IHC и т. д.
преобразовательная передача
приготовьте аденовирус в 10-кратном градиенте разбавления и убедитесь, что мои находится в диапазоне от 3 до 1000.
a. Для адгезивных клеток:
Рекомбинантный аденовирус, содержащий ген-мишень и одинаковое количество контрольного аденовируса, должен
быть добавлен отдельно в две группы клеток и хорошо смешан. Количество использованных аденовирусов зависит от
размера контейнера, описанного в следующей таблице. для теста мои в большинстве типов клеток достаточно градиента
от 3, 10, 30, 100, 300 до 1000 при трех повторениях. обновление среды за 4-8 часов. Интересный белок можно
обнаружить в течение 48–72 часов с помощью флуоресцентной микроскопии, WB и т. д.
таблица 3. количество аденовирусов в разных размерах контейнеров.
размер контейнера
Площадь
поверхности (см2)
объемный объем
объем среды
Из
этого
96-скважин 0.3 100 мкл 0,1-0,5 мкл
24-квадратный 2 500 мкл 1-3 мкл
12-скважин 4 1 мл 2-5 мкл
6-квадратный 10 2 мл
например: если уровень рекомбинантного аденовируса составляет 5 × 1011 рфу/мл, разбавьте до 5 × 1010 рфу/мл (в 10
раз) с полной средой роста клеток-мишеней. когда в одном скважине 1 × 105 клеток и мои составляет 1000,
необходимый объем разбавленного аденовируса (5 × 1010 рфу/мл) должен быть (количество клеток) × (мои) ÷ (рфу/мл
рекомбинантного аденовируса) = 1 × 105 × 1000/5 × 1010 (мл) = 2 мкл. Таким образом, в эту скважину следует
5-20 мкл
добавить 2 мкл разбавленного аденовируса.
Отходы должны быть утилизированы в соответствии с процедурами, описанными в разделе требований
биобезопасности.
b. Для суспензионных клеток:
спиновая инфекция является достаточным способом трансдукции суспензионных или полусуспензионных клеток.
Короче говоря, после добавления аденовируса запечатайте пластину культивирования клеток парапленкой и вращайтесь
в центрифуге с низкоскоростным качанием при 200 г при 37 в течение 1 часа.
℃

11
и культивировать клетки при температуре 37 за ночь. Средство должно быть обновлено на следующий день.
℃
если условие не допускается для спиновой инфекции, вместо этого можно использовать центрифужную трубку путем
переноса клеток в трубку и центрифуги на низкой скорости. выбросить большую часть супернатанта после
центрифугирования, добавить аденовирусы и инкубировать при комнатной температуре в течение 15–30 минут. затем
перенесите клеточно-аденовирусную смесь в соответствующий контейнер и культивируйте при 37 за ночь. Средства
℃
должны быть заменены на следующий день.
определить эффективность передачи
Через 48 до 72 часов после трансдукции флуоресцентные белки можно наблюдать, когда это применимо, и изменения в
гене-мишени могут анализироваться на уровне mrna с помощью qpcr или на уровне белка с помощью вестерн-блота
(WB).
безопасное использование аденовируса (AdV)
1. Эксперименты, связанные с аденовирусом, должны проводиться на объектах биобезопасности 2 уровня (уровень bl-2).
2. пожалуйста, полностью оснастите лабораторное пальто, маску, перчатки и старайтесь избежать обнажения рук и рук.
3. будьте осторожны, чтобы брызгать суспензию аденовируса. Если шкаф биобезопасности заражен аденовирусом во
время эксплуатации, немедленно вытерьте стол раствором, содержащим 70% спирта и 1% SDS. Перед утилизацией все
наконечники, трубки, культуральные пластины, среды, контактирующие с аденовирусом, должны быть замочены
хлорсодержащим дезинфицирующим раствором.
4. Если необходимо центрифугировать, трубка центрифуги должна быть плотно герметизирована. Если позволяют
условия, закройте трубку парапленкой перед центрифугом.
5. Эксперименты на животных, связанные с аденовирусом, также должны проводиться на уровне bl-2.
6. Отходы, связанные с аденовирусом, должны быть специально собраны и автоклавированы перед удалением.
7. После эксперимента мыть руки дезинфицирующим средством.
хранение и разведение аденовируса
хранение аденовируса
Аденовирус можно хранить при температуре 4°C в течение короткого времени (менее недели) перед использованием
после приема. Поскольку аденовирусы чувствительны к замораживанию-оттаиванию, а титр снижается при повторном
замораживании-оттаивании, аликовидный вирусный запас следует хранить при температуре -80°C в морозильной
камере сразу по прибытии для длительного использования. в то время как перед использованием рекомендуется
повторное обнаружение титра аденовируса, если аденовирусы хранятся более 12 месяцев.
примечание: 1. Необходимо избегать повторных циклов замораживания-оттаивания в случае возникновения побочного
эффекта на титр аденовируса (за каждый цикл замораживания-оттаивания произойдет снижение на 10–50%). Genemedi
предоставит рекомбинантные аденовирусные продукты в небольших аликвотах (200 мкл/трубка), которые можно
хранить непосредственно в температуре -80 градусов для многократного использования.
2. Для аденовирусов, хранящихся более 6 месяцев, рекомендуется повторный анализ титра аденовируса перед
использованием.

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разведение аденовируса
Чтобы правильно разморозить замороженные аликвоты рекомбинантного аденовируса, перенесите
аденовирусы из морозильной камеры -80 ° C в ванну с ледяной водой до полного растопления. При
расплавлении добавьте соответствующее количество стерильного PBS или среды без сыворотки и храните в
температуре 4 не более недели.
℃
меры предосторожности
· избегайте воздействия аденовируса на экстремальные условия окружающей среды (pH, хелатирующие
агенты, такие как edta, температура, органические растворители, белковые денатуранты, сильные моющие
средства и т. д.)
· избегайте ввода воздуха в образцы аденовируса во время вихревых, пузырьковых пузырей или
аналогичных операций, что может привести к денатурации белка.
· Избегайте повторного замораживания и оттаивания.
· избегайте воздействия «обычных» пластиков (особенно полистирола или гидрофобных пластиков) в
течение длительного периода времени в жидкой фазе. большинство аденовирусов очень липкие и могут
возникнуть потери при воздействии обычных пластиков, включая трубки, пластины для культивирования
клеток, кончики пипетки, если они не заморожены. Лучше хранить аденовирус в кремнизированных или
низкобелковых связывающих трубках. Плюроник f-68, используемый при 0,01%-0,1% в буфере для
формулы, минимизирует приклеивание при использовании обычного пластика.
· избегайте разбавления аденовируса в раствор с низким содержанием соли. некоторые аденовирусы
собираются в низкосолевом растворе, который будет неинфекционным.
Ссылка на
1. Луо Дж. и др. протокол для быстрой генерации рекомбинантных аденовирусов с использованием системы adeasy. Нат. протоколы. 2
(5), 1236-1247 (2007).
2. он. с. и др. упрощенная система генерации рекомбинантных аденовирусов. Пнас. 95, 2509-2514 (1998).
3. Майер О. Дж. Ген Мед. 6 (дополнение 1), s152–s163 (2004).
сопутствующие продукты
1. Система упаковки aav
Подробности посетите: https://www.genemedi.net/i/aav-vector-system.

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2. Обещание аденовируса-орфтм:
проверенные последовательностью клоны КДНК в векторах экспрессии
аденовирусов и млекопитающих. Более подробная информация посетите:
https://www.genemedi.net/i/virus-plasmid.
3. индивидуальное производство аденовируса
Подробности посетите: https://www.genemedi.net/i/adenovirus-customized-production-service.
контактная информация
генемеди биотехнология. Инк.
Для получения дополнительной информации об аденовирусе посетите: www.genemedi.net/i/adenovirus-
packaging
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