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· Avoid diluting AAV into low salt solution. Some AAV serotypes, such as AAV2, aggregates in low salt solution,
which will be non-infectious.
Introduction of AAV
In Genemedi Biosciences, recombinant adeno-associated Virus (rAAV) Expression Systems are utilized in
delivering and expressing shRNA, human ORF, CRISPR in vitro and in vivo.
Adeno-associated virus (AAV) is a small single strand DNA virus infecting human and some other primate species.
Currently, AAV has not known to cause disease and only induces very mild immune responses. As a member of the
family Parvoviridae, wild type AAV requires the assistance of adenovirus or herpesvirus to complete the duplication,
which is the reason why it’s called adeno-associated virus [1,2]. The wild-type AAV2 genome consists of the viral
rep and cap genes (encoding replication and capsid genes, respectively), flanked by inverted terminal repeats (ITRs)
that contain all the cis-acting elements necessary for replication and packaging. The genome of typical AAV2 is
about 4800bp, consisting of two upstream and downstream open read frames (ORFs) which are between two
inverted terminal repeats (ITR) comprising Rep and Cap (Figure 1). ITR is required for synthesis of complementary
DNA strand, while Rep and Cap can be translated into various proteins, including AAV virus cycle essential protein
Rep78, Rep68, Rep52, Rep40 and enveloped protein VP1, VP2, VP3, etc. [3].
The present recombinant AAV (rAAV) vectors are generated by replacing all of the viral genome between the ITRs
with a transcriptional cassette of less than 5 kilobases in length. The resulting construct is then co-expressed with
two other plasmids: 1) an AAV-RC plasmid that provides the Rep and Cap genes in trans (separate from the
ITR/Transgene cassette) and 2) an AAV helper plasmid that harbors the adenoviral helper genes. AAV-293 cells are
used as the packaging cell line since they provide the E1a protein in trans as well. By modifying the Rep and Cap
genes, scientists can control the serotypes to guide the recombinant AAV infection towards certain tissues. This 3-
plasmid co-transfection system liberates the need for adenovirus during AAV production, which greatly simplifies
the purification process.
To date, a total of 12 serotypes of AAV have been described with their own unique traits and tropisms [4].
Concerning high safety, low immunogenicity, long-term expression of exogenous genes, AAV is thought to be the
best gene delivery tool for gene function research in vivo.
Figure 1. Schematic diagram of AAV2 genome structure.
Advantages of AAV for Gene Delivery and Expression
1. Superior biosafety rating
AAV is a naturally defective virus, requiring provision of several factors in trans for productive infection and has not
been associated with any human disease. In our AAV production system, the AAV2 ITR sequences and rep/cap
genes are present on separate plasmids that lack homology, preventing production of recombinant wild-type virus.
These features give AAV a superior biosafety rating among gene delivery and expression vectors of viral origin.](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-4-320.jpg)
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2. Broad range of infectivity
AAV viruses infect a broad range of mammalian cells and have been used successfully to express human and non-
human proteins. In contrast with other vectors of viral origin, AAV vectors have proven to be competent for gene
expression in immunocompetent hosts.
3. High titer
Recombinant AAV can be produced at high titers of ≥107
viral particles/ml with this protocol. Titers up to 1013
viral
particles/ml after concentration have been published.
4. Infection does not require an actively dividing host cell
AAV can infect both dividing and non-dividing cells.
5. Long-term gene transfer potential
Recombinant AAV (rAAV) can be maintained in human cells, creating the potential for long-term gene transfer. In
most cell populations, the viral genome typically remains epichromosomal, often forming concatemers, which are
stable in slowly dividing or non-dividing cells, leading to long-term gene transfer and expression. Whereas in rapidly
dividing cell populations, the AAV viruses can integrate into the host genome but not form concatemers, resulting in
long-term gene expression in dividing cells, but this is a rare event. The integration occurs more frequently if an
extremely high multiplicity of infection (MOI) of AAV is used or if infection occurs in the presence of adenoviral
replicase, potentially supplied by the use of wild-type adenovirus. However, it will reduce the biosafety of the AAV
system to increase integration events by using wild-type adenovirus.
AAV Serotypes and Native Tropism- AAV Selection Guide
Over the past decades, numerous AAV serotypes have been identified with variable tropism. To date, 12 AAV
serotypes and over 100 AAV variants have been isolated from adenovirus stocks or from human/nonhuman primate
tissues. Different AAV serotypes exhibit different tropisms, infecting different cell types and tissue types. So,
selecting the suitable AAV serotype is critical for gene delivery to target cells or tissues.
Due to the exhibition of natural tropism towards certain cell or tissue types, rAAV has garnered considerable
attention. Highly prevalent in humans and other primates, several AAV serotypes have been isolated. AAV2, AAV3,
AAV5, AAV6 were discovered in human cells, while AAV1, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11,
AAV12 in nonhuman primate samples [5,6]. Genome divergence among different serotypes is most concentrated on
hypervariable regions (HVRs) of virus capsid, which might determine their tissue tropisms. In addition to virus
capsid, tissue tropisms of AAV vectors are also influenced by cell surface receptors, cellular uptake, intracellular
processing, nuclear delivery of the vector genome, uncoating, and second strand DNA conversion [7].
In order to better improve the infection efficiency and specificity of AAV to target tissues, scientists have genetically
modified the viral capsid, and generated mosaic vectors to create chimeric AAV by swapping domain’s or amino-
acids between serotypes [8,9], which may allow researchers to specifically target cells with certain serotypes to
effectively transduce and express genes in a localized area [10].
Meanwhile, the ability of AAV to penetrate the blood-brain barrier in animals is greatly limited or improved.
Traditionally, AAV could only be injected into the brain tissue by surgery for scientific research in the central
nervous system, which greatly increased the difficulty of the experiment and affected the experimental results. Now
the modified AAV serotype of PHP.B and PHP.eB can infect the whole brain through the blood-brain barrier by](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-5-320.jpg)
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peripheral blood injection [11]. Most popular rAAV serotypes and their tropisms are listed in the following table1.
Table 1. rAAV serotypes and their tropisms.
AAV Serotype
Tissue tropism
CNS Retina Lung Liver Pancreas Kidney Heart Muscle
AAV1 √ √ √ √ √
AAV2 √ √ √
AAV3 √ √ √ √
AAV4 √ √ √
AAV5 √ √ √ √
AAV6 √ √ √ √ √
AAV7 √ √
AAV8 √ √ √ √
AAV9 √ √ √ √ √
AAV-DJ √ √ √ √
AAV-DJ/8 √ √ √
AAV-Rh10 √ √ √ √ √
AAV-retro √ √ √
AAV-PHP.B √ √ √
AAV-PHP.eB √ √
AAV-PHP.S √ √ √](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-6-320.jpg)
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・AAV を低塩溶液に希釈しないようにしてください。AAV2 などのいくつかの AAV 血清型は、低塩溶液に凝
集し、非感染性になります。
AAV の導入
ゲネメディバイオサイエンスでは、組換えアデノ関連ウイルス（rAAV）発現システムが、in vitro および in
vivo でシュラ、ヒトオルフ、クリスプルを送達および発現するのに利用されています。
アデノ関連ウイルス（AAV）は、ヒトおよび他の霊長類種に感染する小さな単鎖 DNA ウイルスです。現
在、AAV は病気を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫反応しか誘発しません。野生型 AAV
はパルボウイルス科の一員として、複製を完了するにはアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの支援が必
要であり、これがアデノ関連ウイルスと呼ばれる理由です[1,2]。野生型 AAV2 ゲノムは、ウイルスの rep 遺
伝子と cap 遺伝子（複製遺伝子とカプシド遺伝子をそれぞれコードする）で構成され、複製とパッケージ化
に必要なすべてのシス作用元素を含む反転末端繰り返し（ITRs）で囲まれています。典型的な AAV2 のゲノ
ムは約 4800bp で、Rep と Cap を含む 2 つの反転終端繰り返し(ITR)の間にある 2 つの上流と下流のオープ
ンリードフレーム(orf)で構成されます(図 1)。補完的な DNA 鎖の合成には ITR が必要ですが、Rep と Cap
は AAV ウイルスサイクル必須タンパク質 Rep78、Rep68、Rep52、Rep40、および包囲タンパク質
VP1、VP2、VP3 などを含むさまざまなタンパク質に翻訳することができます[3]。
本組換え AAV（rAAV）ベクターは、ITR 間のすべてのウイルスゲノムを長さ 5 キロベース未満の転写カセッ
トに置き換えることによって生成されます。次に、得られた構築物は、他の 2 つのプラスミドと共同発現さ
れます。1)トランスで Rep および Cap 遺伝子を提供する AAV-RC プラスミド(ITR/Transgene カセットと
は別の)、および 2)アデノウイルスを保持する AAV ヘルパープラスミド。ヘルパー遺伝子。AAV-293 細胞
は、トランスにおいても E1a タンパク質を提供するため、包装細胞株として使用されています。Rep 遺伝子
と Cap 遺伝子を修正することで、科学者は血清型を制御して組換え AAV 感染を特定の組織に誘導することが
できます。この 3 プラスミド共トランスフェクションシステムは、AAV 生産中のアデノウイルスの必要性を
解放し、精製プロセスを大幅に簡素化します。
これまでに、合計 12 の AAV 血清型が、独自の特徴と熱帯性を備えて記述されています[4]。高安全性、低免
疫原性、外因性遺伝子の長期発現に関して、AAV は in vivo 遺伝子機能研究のための最良の遺伝子送達ツール
であると考えられています。
図 1。AAV2 ゲノム構造の模式図。
遺伝子の送達と発現における AAV の利点
1.優れたバイオセーフティ評価
AAV は自然に欠陥のあるウイルスであり、生産的な感染のためにトランスのいくつかの因子の提供を必要と
し、ヒトの疾患と関連していません。当社の AAV 生産システムでは、AAV2 ITR 配列と rep/cap 遺伝子は、
相同性の欠如した別のプラスミド上に存在し、組換え野生型ウイルスの産生を防ぎます。これらの特徴
は、AAV にウイルス由来の遺伝子送達および発現ベクターの中で優れた生物安全性評価を与えます。](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-32-320.jpg)
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2. 広範囲の感染性
AAV ウイルスは幅広い哺乳類細胞に感染し、ヒトおよび非ヒトタンパク質を発現するために成功しています。ウ
イルス由来の他のベクターとは対照的に、AAV ベクターは免疫能力のある宿主における遺伝子発現に有能である
ことが証明されています。
3. 高価
このプロトコルでは、107 以上のウイルス粒子/ml の高価で組換え AAV を製造することができます。濃度が公開
された後、最大 1013 個のウイルス粒子/ml の価数が得られます。
4. 感染は積極的に分裂する宿主細胞を必要としません
AAV は分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染する可能性があります。
5. 長期遺伝子移動可能性
組換え AAV（rAAV）はヒト細胞内で維持され、長期的な遺伝子移行の可能性を生み出します。ほとんどの細胞集
団では、ウイルスゲノムは通常、表染色体のままであり、しばしばコンテマーを形成し、ゆっくり分裂している
細胞または分裂していない細胞で安定しており、長期的な遺伝子移動と発現につながります。一方、細胞集団が急
速に分割される場合、AAV ウイルスは宿主ゲノムに統合することができますが、コンテマーを形成することはで
きません。これにより、分割された細胞において長期的な遺伝子発現が生じますが、これはまれな出来事で
す。AAV の非常に高い多数感染(MOI)が使用されている場合、または野生型アデノウイルスの使用によって供給さ
れる可能性のあるアデノウイルスレプリカーゼの存在下で感染が発生した場合、統合はより頻繁に発生します。た
だし、野生型アデノウイルスを使用することで統合イベントを増加させるために、AAV システムの生物安全性が
低下します。
AAV 血清型とネイティブトロピズム-AAV 選択ガイド
過去数十年にわたって、多数の AAV 血清型が可変熱帯性で同定されてきました。これまでに、アデノウイルス株
またはヒト/非ヒト霊長類組織から 12 の AAV 血清型と 100 以上の AAV 変異体が分離されています。さまざまな
AAV 血清型は異なる熱帯性を示し、さまざまな細胞タイプや組織タイプに感染します。したがって、適切な AAV
血清型を選択することは、標的細胞または組織への遺伝子送達に不可欠です。
特定の細胞または組織タイプに対する自然な熱帯性が示されたため、rAAV はかなりの注目を集めています。ヒト
や他の霊長類に非常に蔓延しており、いくつかの AAV 血清型が分離されています。AAV2、AAV3、AAV5、AAV6
はヒト細胞で発見され、AAV1、AAV4、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12 は非ヒト霊長類サン
プルで発見されました[5,6]。さまざまな血清型間のゲノムの発散は、ウイルスカプシドの超可変領域（HVRs）に
最も集中しており、それが組織の熱帯性を決定する可能性があります。ウイルスカプシドに加えて、 AAV ベク
ターの組織トロピズムは、細胞表面受容体、細胞の取り込み、細胞内処理、ベクターゲノムの核送達、コーティン
グ解除、および第 2 鎖 DNA 変換の影響も受けます[7]。
標的組織に対する AAV の感染効率と特異性をよりよく向上させるために、科学者たちはウイルスカプシドを遺伝
子組み換え、血清型間でドメインまたはアミノ酸を交換することによってキメラ AAV を作成するモザイクベク
ターを生成しました[8,9]。これにより、研究者が特定の血清型を持つ細胞を特異的に標的にして、局在領域で遺
伝子を効果的に伝達および発現することができる可能性があります[10]。
一方、動物の血液脳関門を貫通する AAV の能力は大幅に制限されているか、または改善されています。従
来、AAV は中枢神経系の科学研究のための手術によってのみ脳組織に注入することができ、実験の難易度が大幅
に高まり、実験結果に影響を与えました。現在、PHP.B と PHP.eB の修正された AAV 血清型は、血液脳関門を介
して脳全体に感染する可能性があります。](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-33-320.jpg)
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末梢血注射[11]。最も人気のある rAAV 血清型とその熱帯性を次の表 1 に示します。
表 1。rAAV 血清型とその熱帯性。
AAV 血清型
組織トロピズム
CNS の 網膜 肺 肝臓 膵臓；膵臓 腎臓 心臓 筋
AAV1 √ √ √ √ √
AAV2 √ √ √
AAV3 √ √ √ √
AAV4 √ √ √
AAV5 √ √ √ √
AAV6 √ √ √ √ √
AAV7 √ √
AAV8 √ √ √ √
AAV9 √ √ √ √ √
AAV-DJ √ √ √ √
AAV-DJ/8 √ √ √
AAV-Rh10 √ √ √ √ √
AAV レトロ √ √ √
AAV-PHP.B √ √ √
AAV-PHP.eB √ √
AAV-PHP.S √ √ √](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-34-320.jpg)
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· aav 를 저염용액으로 희석시키는 것을 피한다. Aav2 와 같은 일부 aav 혈청형은 저염용액에 집결되어 전염
성이 없다.
aav 도입
Genemedi 생물 과학에서 재조합 선과 관련된 바이러스(rAAV) 발현 시스템은 체외 및 체내에서 shrna, 인간
orf, crispr 를 전달하고 발현하는 데 사용된다.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 인간과 다른 영장류 종에 감염되는 작은 단일 스란드 dna 바이러스이다. 현재
aav 는 질병을 유발할 수 있다는 것을 알지 못하고 매우 가벼운 면역 반응만 유발한다. 파르보바이러스의 일원
으로서 야생형 aav 는 복제를 완료하기 위해 아데노바이러스나 헤르페스바이러스의 도움을 필요로 하는데, 이
것이 바로 아데노 관련 바이러스라고 불리는 이유[1,2]이다. 야생형 aav2 게놈은 바이러스 rep 유전자와 cap
유전자(각각 복제 유전자와 capside 유전자를 코딩)로 구성되어 있으며, 그 옆에는 복제 및 포장에 필요한 모
든 cis 작용 원소를 포함하는 역말 반복(ITRs)이 있다. 전형적인 aav2 의 게놈은 약 4800bp 이며, 두 개의 상
류 및 하류 개방 읽기 프레임(ORFs)으로 구성되어 있으며, 두 개의 반전 단말기 반복(ITR) 사이에 rep 와 cap
사이로 구성된다(그림 1). 상호 보완 dna 스란드의 합성은 itr 가 필요하며, rep 와 cap 는 aav 바이러스 주기
의 필수 단백질 rep78, Rep68, Rep52, rep40 및 포위된 단백질 vp1, VP2, VP3 등을 포함한 다양한 단백질
로 번역될 수 있다. [3]
현재의 재조합 aav(rAAV) 벡터는 itrs 사이의 모든 바이러스 게놈을 길이가 5 킬로베이스 미만의 전사 카세트
로 대체함으로써 생성된다. 그 후 결과된 구조물은 다른 두 개의 플라즈미드와 공동으로 발현된다: 1) 트랜스에
서 rep 유전자와 cap 유전자를 제공하는 aav-rc 플라즈미드, 2) 아데노바이러스 유전자를 보관하는 aav 유전
자 플라즈미드. aav-293 세포는 트랜스에서도 e1a 단백질을 제공하기 때문에 포장 세포라인으로 사용됩니다.
rep 유전자와 cap 유전자를 수정함으로써 과학자들은 재조합 aav 감염을 특정 조직으로 유도하기 위해 혈청
유형을 제어할 수 있다. 이 3 플라즈드 공동 전염 시스템은 aav 생산 과정에서 아데노바이러스의 필요성을 해
방시켜 정화 과정을 크게 단순화한다.
지금까지 12 개의 aav 의 혈청 유형이 그것들의 독특한 특징과 열대성을 가지고 묘사되었다[4]. 높은 안전성,
낮은 면역 원성, 장기적인 외생 유전자의 발현에 관하여 aav 는 체내 유전자 기능 연구에 가장 좋은 유전자 전
달 도구로 여겨진다.
그림 1. aav2 게놈 구조의 구조도
유전자 전달 및 발현에 대한 aav 의 장점
1. 우수한 생물안전등급
aav 는 자연적으로 결함이 있는 바이러스로, 생산적인 감염을 위해 트랜스에서 몇 가지 요인을 제공해야 하며,
어떤 인간의 질병과도 관련이 없다. 우리의 aav 생산 시스템에서 aav2 itr 서열과 rep/cap 유전자는 동성이 부
족한 별도의 플라스미드에 존재하여 재조합 야생형 바이러스의 생성을 막는다. 이러한 특징들은 aav 에게 유전
자 전달과 바이러스 기원의 발현 매개체에서 우수한 생물 안전 등급을 제공한다.](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-60-320.jpg)
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2. 광범위한 전염성
aav 바이러스는 광범위한 포유류 세포에 감염되어 인간과 비인간의 단백질을 발현하는 데 성공적으로 사용되었다.
다른 바이러스 기원의 매개체와 대조적으로, aav 매개체는 면역 능력 숙주에서 유전자 발현에 능력이 있다는 것이
증명되었다.
3. 높은 적사
재조합 aav 는 이 프로토콜을 가진 ≥ 107 바이러스 입자/ml 의 높은 적사에서 생성될 수 있습니다. 농도가 발표된
후 최대 1013 개의 바이러스 입자/ml 에 달한다.
4. 감염은 숙주 세포를 적극적으로 분할할 필요가 없다
aav 는 분할된 세포와 분할되지 않은 세포를 모두 감염시킬 수 있다.
5. 장기 유전자 전달 잠재력
재조합 aav(rAAV)는 인체 세포에서 유지될 수 있어 장기적인 유전자 이전의 잠재력을 만들 수 있다. 대부분의 세포
집단에서 바이러스 게놈은 일반적으로 표염색체를 유지하며, 종종 느리게 분할되거나 분할되지 않는 세포에서 안정
적이며, 유전자의 장기적 이전과 발현을 이끌어낸다. 반면 세포 집단이 빠르게 분할되는 경우 aav 바이러스는 숙주
게놈에 통합될 수 있지만 concatemers 를 형성하지 않아 분할된 세포에서 유전자의 장기적 발현을 초래하지만 이
것은 드문 사건이다. Aav 의 극도로 높은 다수성 감염(MOI)을 사용하거나 야생형 아데노바이러스의 사용으로 공급
될 수 있는 아데노바이러스 복제효소의 존재에서 감염이 발생하는 경우, 통합은 더 자주 발생한다. 그러나 야생형 아
데노바이러스를 사용하여 통합 사건을 증가시키는 aav 시스템의 생물적 안전성을 감소시킬 것이다.
aav 혈청형과 본토 열대주의-aav 선택 가이드
지난 수십 년 동안 많은 aav 혈청형이 변동적인 열대성을 가지고 있다는 것을 확인했다. 지금까지 12 개의 aav 혈청
형과 100 개가 넘는 aav 변종이 아데노바이러스 주식이나 인간/비인간 영장류 조직에서 분리되었다. 서로 다른 aav
혈청형은 서로 다른 열대성을 나타내며 서로 다른 세포 유형과 조직 유형에 감염된다. 따라서 적절한 aav 혈청형을
선택하는 것은 표적 세포나 조직에 유전자를 전달하는 데 매우 중요하다.
raav 는 특정 세포나 조직 유형에 대한 자연 열대성의 전시로 인해 상당한 관심을 받았다. 인간과 다른 영장류에서
매우 유행하며, 몇 가지 aav 혈청형이 분리되었다. AAV2, AAV3, AAV5, aav6 은 인간 세포에서 발견되었고, aav1,
AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, aav12 는 비인간 영장류 샘플에서 발견되었다 [5,6]. 서로 다른 혈청
형 간의 게놈 분산은 바이러스 캡시드의 초변수 영역(HVRs)에 가장 집중되어 있으며, 이는 그 조직의 열대성을 결정
할 수 있다. 바이러스 카피드 외에도 aav 매개체의 조직 열대성은 세포 표면 수용체, 세포 흡수, 세포 내 가공, 매개
체 게놈의 핵 전달, 코팅 해제, 두 번째 사슬 DNA 전환에 의해 영향을 받는다.
표적 조직에 대한 aav 의 감염 효율성과 특이성을 더 잘 향상시키기 위해, 과학자들은 바이러스 캡시드를 유전자적
으로 개조하고, 혈청형 사이에 도메인이나 아미노산을 교환함으로써 모자이크 매개체를 생성하여 접합성 aav 를 만
들 수 있으며, 이는 연구자들이 특정 혈청형 세포를 특별히 표적하여 유전자를 효과적으로 전환하고 발현할 수 있게
할 수 있을 것이다.
동시에 aav 가 동물의 혈뇌 장벽을 관통하는 능력은 크게 제한되거나 향상된다. 전통적으로 aav 는 수술을 통해 뇌
조직에 주입할 수 있어야 중추신경계의 과학적 연구를 진행할 수 있어 실험의 난이도를 크게 높이고 실험 결과에 영
향을 미친다. 이제 php.b 와 php.eb 의 개선된 aav 혈청형은 혈액 뇌장벽을 통해 전 뇌를 감염시킬 수 있습니다.](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-61-320.jpg)
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외주 혈액 주사 [11]. 가장 인기있는 raav 혈청형과 그 열대성은 아래 표 1 에 나열되어 있다.
표 1. raav 혈청형과 그 열대성.
aav 혈청형
조직 열대성
CNS 망막 폐 간 췌장 신장 심장 근육
AAV1 √ √ √ √ √
AAV2 √ √ √
AAV3 √ √ √ √
AAV4 √ √ √
AAV5 √ √ √ √
AAV6 √ √ √ √ √
AAV7 √ √
AAV8 √ √ √ √
AAV9 √ √ √ √ √
AAV-DJ √ √ √ √
AAV-DJ/8 √ √ √
AAV-Rh10 √ √ √ √ √
aav-빈티지 √ √ √
AAV-PHP.B √ √ √
AAV-PHP.eB √ √
AAV-PHP.S √ √ √](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-62-320.jpg)
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· Избегайте разбавления aav в раствор с низким содержанием соли. некоторые серотипы AAV, такие как AAV2,
агрегируются в растворе с низким содержанием соли, который будет неинфекционным.
введение aav
в биологических науках genemedi системы экспрессии рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV)
используются для доставки и экспрессии шрны, человеческого орфа, криспра in vitro и in vivo.
Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой одноцепочечный вирус ДНК, заражающий
человека и некоторые другие виды приматов. В настоящее время aav не знает, что вызывает заболевание и
вызывает только очень легкие иммунные ответы. как член семейства parvoviridae, aav дикого типа нуждается в
помощи аденовируса или герпесвируса для завершения дублирования, поэтому его называют
аденоассоциированным вирусом [1,2]. геном aav2 дикого типа состоит из генов вирусного репликации и капа
(кодирующих гены репликации и капсида соответственно), окруженных перевернутыми терминальными
повторениями (ITRs), которые содержат все элементы цис-действия, необходимые для репликации и упаковки.
геном типичного aav2 составляет около 4800 б.п., состоящего из двух открытых кадров чтения (orf) вверх и вниз
по течению, которые находятся между двумя перевернутыми терминальными повторениями (ITR), состоящими из
rep и cap (рисунок 1). Itr необходим для синтеза дополнительной цепочки ДНК, в то время как rep и cap могут
трансформироваться в различные белки, включая незаменимый белок цикла вируса aav rep78, Rep68, Rep52, rep40
и оболоченный белок vp1, VP2, VP3 и т. д. [3].
Нынешние рекомбинантные векторы aav (rAAV) генерируются путем замены всего вирусного генома между itrs
транскрипционной кассетой длиной менее 5 килобазов. полученная конструкция затем экспрессируется совместно
с двумя другими плазмидами: 1) плазмидой aav-rc, которая обеспечивает гены rep и cap в трансе (отдельно от
кассеты itr/трансгена), и 2) плазмидой aav-вспомогательной, которая удерживает аденовирусные вспомогательные
гены. Клетки aav-293 используются в качестве линии упаковочных клеток, поскольку они также обеспечивают
белок e1a в трансе. модифицируя гены rep и cap, ученые могут контролировать серотипы, направляя
рекомбинантную AAV-инфекцию к определенным тканям. эта система ко-трансфекции 3-плазмиды освобождает
потребность в аденовирусе во время производства AAV, что значительно упрощает процесс очистки.
на сегодняшний день описано в общей сложности 12 серотипов aav со своими уникальными чертами и
тропизмами [4]. Что касается высокой безопасности, низкой иммуногенности, долгосрочной экспрессии
экзогенных генов, aav считается лучшим инструментом доставки генов для исследования функции генов in vivo.
рисунок 1. схематическая схема структуры генома aav2.
преимущества aav для доставки и экспрессии генов
1. превосходный рейтинг биобезопасности
Aav — это естественно дефектный вирус, требующий предоставления нескольких факторов транса для
продуктивной инфекции и не был связан с какими-либо заболеваниями человека. В нашей системе производства
aav последовательности aav2 itr и гены rep/cap присутствуют на отдельных плазмидах, которым не хватает
гомологии, что предотвращает выработку рекомбинантного вируса дикого типа. эти характеристики дают aav
превосходный рейтинг биобезопасности среди векторов доставки генов и экспрессии вирусного происхождения.](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-88-320.jpg)
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2. широкий диапазон инфекции
Вирусы aav заражают широкий спектр клеток млекопитающих и успешно используются для экспрессии белков
человека и нечеловека. в отличие от других векторов вирусного происхождения, векторы aav оказались компетентными
для экспрессии генов у иммунокомпетентных хозяев.
3. высокий титр
Рекомбинантный aav можно производить при высоких титрах ≥107 вирусных частиц/мл с помощью этого протокола.
титры до 1013 вирусных частиц/мл после публикации концентрации.
4. инфекция не требует активно делящейся клетки-хозяина
Aav может заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки.
5. долгосрочный потенциал переноса генов
Рекомбинантный aav (rAAV) может поддерживаться в клетках человека, создавая потенциал для долгосрочного
переноса генов. в большинстве клеточных популяций вирусный геном обычно остается эпихромосомой, часто образуя
конкатемеры, которые стабильны в медленно делящихся или не делящихся клетках, что приводит к длительному
переносу и экспрессии генов. тогда как при быстро делящихся клеточных популяциях вирусы aav могут
интегрироваться в геном хозяина, но не образуют конкатемеров, что приводит к длительной экспрессии генов в
делящихся клетках, но это редкое событие. Интеграция происходит чаще, если используется чрезвычайно высокое
множество инфекций (MOI) aav или если инфекция происходит в присутствии аденовирусной репликазы, потенциально
обеспечиваемой использованием аденовируса дикого типа. однако это снизит биобезопасность системы aav для
увеличения интеграционных событий путем использования аденовируса дикого типа.
Серотипы aav и местный тропизм-руководство по отбору aav
За последние десятилетия многочисленные серотипы AAV были идентифицированы с переменным тропизмом. на
сегодняшний день 12 серотипов AAV и более 100 вариантов AAV были выделены из запасов аденовирусов или из
тканей приматов человека/нечеловека. разные серотипы aav проявляют разные тропизмы, заражая разные типы клеток и
типов тканей. поэтому выбор подходящего серотипа AAV имеет решающее значение для доставки генов клеткам или
тканям-мишеням.
благодаря проявлению естественного тропизма в отношении определенных типов клеток или тканей, raav привлек
значительное внимание. очень распространенное у людей и других приматов, было выделено несколько серотипов aav.
AAV2, AAV3, AAV5, aav6 были обнаружены в клетках человека, а aav1, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11,
aav12 в образцах нечеловеческих приматов [5,6]. дивергенция генома между различными серотипами наиболее
сосредоточена на гиперпеременных областях (HVRs) капсида вируса, которые могут определять их тканевые тропизмы.
В дополнение к вирусному капсиду, на тропизмы тканей векторов aav также влияют рецепторы поверхности клеток,
поглощение клеток, внутриклеточная обработка, ядерная доставка генома вектора, разъем покрытия и конверсия ДНК
второй цепи [7].
Чтобы лучше повысить эффективность инфекции и специфичность aav к мишеням тканей, ученые генетически
модифицировали вирусный капсид и генерировали мозаичные векторы для создания химерных aav путем обмена
доменами или аминокислотами между серотипами [8,9], что может позволить исследователям специально нацелить
клетки с определенными серотипами на эффективную трансдукцию и экспрессию генов в локализованной области [10].
тем временем способность AAV проникнуть через гематоэнцефалический барьер у животных значительно ограничена
или улучшена. традиционно aav можно вводить в ткань головного мозга только с помощью хирургии для научных
исследований в центральной нервной системе, что значительно увеличивает сложность эксперимента и влияет на
результаты эксперимента. теперь модифицированный серотип aav php.b и php.eb может заразить весь мозг через
гематоэнцефалический барьер через](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-89-320.jpg)
![5
инъекция периферической крови [11]. самые популярные серотипы raav и их тропизмы перечислены в следующей
таблице1.
таблица 1. серотипы raav и их тропизмы.
серотип аав
тканевой тропизм
CNS. сетчатка,
сетчатка
легочное печень,
печень
поджелудо
чная
железа
почка сердце,
сердце
мышечная
мышца
AAV 1 √ √ √ √ √
AAV 2 √ √ √
AAV 3 √ √ √ √
AAV 4 √ √ √
AAV 5 √ √ √ √
AAV 6 √ √ √ √ √
AAV 7 √ √
AAV 8 √ √ √ √
AAV 9 √ √ √ √ √
AAV-DJ √ √ √ √
ААВ-ДЖ/8 √ √ √
AAV-Rh10 √ √ √ √ √
аав-ретро √ √ √
AAV-PHP.B √ √ √
AAV-PHP.eB √ √
AAV-PHP.S √ √ √](https://image.slidesharecdn.com/aav-250905122051-166c967f/85/AAV-pdf-90-320.jpg)
AAVユーザーマニュアル .pdf
- 1. Click for Englishprotocol 한국어 버전으로 이동 日本語版へ行く Нажмите, чтобы просмотреть
- 2. Protocols Library: Gene Therapy Biologics GENEMEDI nnovati ion forTherapeutics&Diagnostics Industry DiagnosticsTarMart Click to download. Table of Content UserManual Adeno-associated virus (AAV) s Storage and Diutionof AAV………………………………………………………………………2 Introductionof AAV……………………………………………………………………………… Table ofContents………………………………………………………………………………1 SafeUse of AAV…………………………………………………………………… …………… ……………2 3 Advantages of AAV forGeneDelveryand Expression………………………………………………3 AAVSerotypes andNative Tropism-AAV Seledion Guide…………………………………………………4 AAV Product, Service and Information ofVector,Listof Goods inStockofGenemedi……………………6 ProductandService tem ofGenemedi AAV………………………………………………………………6 ProductCharacterofGenemedi AAV… …………………… … …… …………………………… …… … …6 Listof MainGenemedi AAVVectorand Goods in Stock……………………………………………………7 Overall ExperimentProcedureofAAVProduction………………………………………………………10 Experimental Materials………………………………………………………………………………………11 Vector ConstructionofAAV…………………………………………………………………………………12 Packagingof AAV………………………………………………………………………………12 Collection and Purificationof AAV…………………………………………………………………………13 TiterDetectionof AAV………………………… ……………………………………………………13 Cell InfectionTestofAAV………………………… …………………………………………………14 AnimalExperimentwithAAV………………………………………………………………………………16 TailVein Injedion………………………… ………………………………………… ……………………17 Hepafic Portal Vein Injection (localdelveryof AAVinliver)……………………………………………17 Brain Stereotacic Posiioning…………………………………………………………………18 Inrathecal njection……………………………… …………………………………………………………19 Casesharing………………………………………………………………………………………………20 Case 1.AAVLiverTransduction……………………………………………………………………………20 Case2.AAVHeart Transducion………………………………………… …… ……………………………21 Case 3.AAV LungTransduction…………………………………………………………………………21 Case 4.AAV Brain Transduction……………………………………………………………………21 Case 5.AAV HippocampusTransduction………………………………………………………………22 Case6.AAV Retna Transducion………………………… ………………………………………………22 Case 7.AAVSkeletal Muscle Transdudtion………………………………………………………………23 Case 8.AAV Kidney Transduction………………………………………………………………………23 Case 9.AAV Breast Transducion………………………… ………………………………………………24 Case 10.AAVTumorTransduction………………………………………………………………………24 Case 11.AAVTransducion in vino……………………………………………………………25 References……………………………………………………………………………………………………25 1
- 3. 2 Safe Use ofAAV 1. AAV related experiments should be conducted in biosafety level 2 facilities (BL-2 level). 2. Please equip with lab coat, mask, gloves completely, and try your best to avoid exposing hand and arm. 3. Be careful of splashing virus suspension. If biosafety cabinet is contaminated with virus during operation, scrub the table-board with solution comprising 70% alcohol and 1% SDS immediately. All tips, tubes, culture plates, medium contacting virus must be soaked in chlorine-containing disinfectant before disposal. 4. If centrifuging is required, a centrifuge tube should be tightly sealed. Seal the tube with parafilm before centrifuging if condition allowed. 5. AAV related animal experiments should also be conducted in BL-2 level. 6. AAV associated waste materials need to be specially collected and autoclaved before disposal. 7. Wash hands with sanitizer after experiment. Storage and Dilution of AAV Storage of AAV Virus can be stored at 4°C for a short time (less than a week) before using after reception. Since AAV viruses are sensitive to freeze-thawing and the titer drops with repeated freeze-thawing, aliquot viral stock should be stored at - 80°C freezer immediately upon arrival for long-term usage. While virus titer redetection is suggested before using if the AAV viruses have been stored for more than 12 months. Dilution of AAV Dissolve virus in ice water if virus dilution is required. After dissolving, mix the virus with medium, sterile PBS or normal saline solution, keeping at 4°C (using within a week). Precautions · Avoid AAV exposure to environmental extremes (pH, chelating agents like EDTA, temperature, organic solvents, protein denaturants, strong detergents, etc.) · Avoid introducing air into the AAV samples during vortexing, blowing bubbles or similar operations, which may result in protein denaturation. · Avoid repeated freezing and thawing. · Avoid exposing to “regular” plastics (especially polystyrene or hydrophobic plastics) for prolonged periods in liquid phase. Most AAV viruses are very sticky and loss can occur if exposed to regular plastics, including tubes, cell culture plates, pipette tips, if not frozen. It is best to store AAV in siliconized or low protein binding tubes. Pluronic F-68 used at 0.01%-0.1% in the formulation buffer will minimize sticking if regular plastics are used.
- 4. 3 · Avoid dilutingAAV into low salt solution. Some AAV serotypes, such as AAV2, aggregates in low salt solution, which will be non-infectious. Introduction of AAV In Genemedi Biosciences, recombinant adeno-associated Virus (rAAV) Expression Systems are utilized in delivering and expressing shRNA, human ORF, CRISPR in vitro and in vivo. Adeno-associated virus (AAV) is a small single strand DNA virus infecting human and some other primate species. Currently, AAV has not known to cause disease and only induces very mild immune responses. As a member of the family Parvoviridae, wild type AAV requires the assistance of adenovirus or herpesvirus to complete the duplication, which is the reason why it’s called adeno-associated virus [1,2]. The wild-type AAV2 genome consists of the viral rep and cap genes (encoding replication and capsid genes, respectively), flanked by inverted terminal repeats (ITRs) that contain all the cis-acting elements necessary for replication and packaging. The genome of typical AAV2 is about 4800bp, consisting of two upstream and downstream open read frames (ORFs) which are between two inverted terminal repeats (ITR) comprising Rep and Cap (Figure 1). ITR is required for synthesis of complementary DNA strand, while Rep and Cap can be translated into various proteins, including AAV virus cycle essential protein Rep78, Rep68, Rep52, Rep40 and enveloped protein VP1, VP2, VP3, etc. [3]. The present recombinant AAV (rAAV) vectors are generated by replacing all of the viral genome between the ITRs with a transcriptional cassette of less than 5 kilobases in length. The resulting construct is then co-expressed with two other plasmids: 1) an AAV-RC plasmid that provides the Rep and Cap genes in trans (separate from the ITR/Transgene cassette) and 2) an AAV helper plasmid that harbors the adenoviral helper genes. AAV-293 cells are used as the packaging cell line since they provide the E1a protein in trans as well. By modifying the Rep and Cap genes, scientists can control the serotypes to guide the recombinant AAV infection towards certain tissues. This 3- plasmid co-transfection system liberates the need for adenovirus during AAV production, which greatly simplifies the purification process. To date, a total of 12 serotypes of AAV have been described with their own unique traits and tropisms [4]. Concerning high safety, low immunogenicity, long-term expression of exogenous genes, AAV is thought to be the best gene delivery tool for gene function research in vivo. Figure 1. Schematic diagram of AAV2 genome structure. Advantages of AAV for Gene Delivery and Expression 1. Superior biosafety rating AAV is a naturally defective virus, requiring provision of several factors in trans for productive infection and has not been associated with any human disease. In our AAV production system, the AAV2 ITR sequences and rep/cap genes are present on separate plasmids that lack homology, preventing production of recombinant wild-type virus. These features give AAV a superior biosafety rating among gene delivery and expression vectors of viral origin.
- 5. 4 2. Broad rangeof infectivity AAV viruses infect a broad range of mammalian cells and have been used successfully to express human and non- human proteins. In contrast with other vectors of viral origin, AAV vectors have proven to be competent for gene expression in immunocompetent hosts. 3. High titer Recombinant AAV can be produced at high titers of ≥107 viral particles/ml with this protocol. Titers up to 1013 viral particles/ml after concentration have been published. 4. Infection does not require an actively dividing host cell AAV can infect both dividing and non-dividing cells. 5. Long-term gene transfer potential Recombinant AAV (rAAV) can be maintained in human cells, creating the potential for long-term gene transfer. In most cell populations, the viral genome typically remains epichromosomal, often forming concatemers, which are stable in slowly dividing or non-dividing cells, leading to long-term gene transfer and expression. Whereas in rapidly dividing cell populations, the AAV viruses can integrate into the host genome but not form concatemers, resulting in long-term gene expression in dividing cells, but this is a rare event. The integration occurs more frequently if an extremely high multiplicity of infection (MOI) of AAV is used or if infection occurs in the presence of adenoviral replicase, potentially supplied by the use of wild-type adenovirus. However, it will reduce the biosafety of the AAV system to increase integration events by using wild-type adenovirus. AAV Serotypes and Native Tropism- AAV Selection Guide Over the past decades, numerous AAV serotypes have been identified with variable tropism. To date, 12 AAV serotypes and over 100 AAV variants have been isolated from adenovirus stocks or from human/nonhuman primate tissues. Different AAV serotypes exhibit different tropisms, infecting different cell types and tissue types. So, selecting the suitable AAV serotype is critical for gene delivery to target cells or tissues. Due to the exhibition of natural tropism towards certain cell or tissue types, rAAV has garnered considerable attention. Highly prevalent in humans and other primates, several AAV serotypes have been isolated. AAV2, AAV3, AAV5, AAV6 were discovered in human cells, while AAV1, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 in nonhuman primate samples [5,6]. Genome divergence among different serotypes is most concentrated on hypervariable regions (HVRs) of virus capsid, which might determine their tissue tropisms. In addition to virus capsid, tissue tropisms of AAV vectors are also influenced by cell surface receptors, cellular uptake, intracellular processing, nuclear delivery of the vector genome, uncoating, and second strand DNA conversion [7]. In order to better improve the infection efficiency and specificity of AAV to target tissues, scientists have genetically modified the viral capsid, and generated mosaic vectors to create chimeric AAV by swapping domain’s or amino- acids between serotypes [8,9], which may allow researchers to specifically target cells with certain serotypes to effectively transduce and express genes in a localized area [10]. Meanwhile, the ability of AAV to penetrate the blood-brain barrier in animals is greatly limited or improved. Traditionally, AAV could only be injected into the brain tissue by surgery for scientific research in the central nervous system, which greatly increased the difficulty of the experiment and affected the experimental results. Now the modified AAV serotype of PHP.B and PHP.eB can infect the whole brain through the blood-brain barrier by
- 6. 5 peripheral blood injection[11]. Most popular rAAV serotypes and their tropisms are listed in the following table1. Table 1. rAAV serotypes and their tropisms. AAV Serotype Tissue tropism CNS Retina Lung Liver Pancreas Kidney Heart Muscle AAV1 √ √ √ √ √ AAV2 √ √ √ AAV3 √ √ √ √ AAV4 √ √ √ AAV5 √ √ √ √ AAV6 √ √ √ √ √ AAV7 √ √ AAV8 √ √ √ √ AAV9 √ √ √ √ √ AAV-DJ √ √ √ √ AAV-DJ/8 √ √ √ AAV-Rh10 √ √ √ √ √ AAV-retro √ √ √ AAV-PHP.B √ √ √ AAV-PHP.eB √ √ AAV-PHP.S √ √ √
- 7. 6 AAV Product, Serviceand Information of Vector, List of Goods in Stock of Genemedi Product and Service Item of Genemedi AAV ·Adeno-associated virus (AAV) customized production service (table 2). ·CRISPR/Cas9 adeno-associated virus (AAV) production service. ·Optogenetics adeno-associated virus (AAV) production service (table 3 and table 4). ·AAV-LC3 production service for autophagy flux detection (table 5). ·Pre-made adeno-associated virus (AAV) production service. ·Adeno-associated virus (AAV) control virus production service. Product Character of Genemedi AAV ·High efficiency. The immunogenicity of AAV is extremely low. The virus titer is up to 1014 vg/ml, giving it high infection efficiency in various tissues. ·Long-term expression. The expression of target gene can sustain more than 2 years. ·Large serotype library. With 11 serotypes and a range of mutant subtypes, AAV could infect almost all the animal tissues and organs efficiently. ·Tissue Tropism. A lot of tissue-specific promoters are available for different cell/tissue, including the heart, liver, muscle and various nervous tissue specific promoter. · High quality. All virus products are subjected to rigorous testing, including sterile, non-mycoplasma, non- endotoxin.
- 8. 7 List of MainGenemedi AAV Vector and Goods in Stock Table 2. List of AAV vector (Some tissue-specific promoters such as heart, liver, muscle, etc. are not listed in the table, welcome to consult) Type AAV plasmids Promoter Expression characteristics Fluorescent Label Note Overexpression pAAV-CMV-MCS-T2A- ZsGreen CMV General and strong ZsGreen pAAV-CMV-MCS-EF1- ZsGreen CMV General and strong ZsGreen pAAV-CAG-MCS-T2A- ZsGreen CAG General and strong ZsGreen pAAV-CAG-MCS-T2A- mCherry CAG General and strong mCherry pAAV-CAG-DIO-MCS- T2A-ZsGreen CAG General and strong ZsGreen Cre dependent expression pAAV-CAG-DIO-MCS- T2A-mCherry CAG General and strong mCherry Cre dependent expression pAAV-hsyn-MCS-T2A- ZsGreen hSyn Neuron specific ZsGreen pAAV-hsyn-MCS-T2A- mCherry hSyn Neuron specific mCherry pAAV-CamkII-MCS-T2A- ZsGreen CamkII Neuron specific ZsGreen pAAV-CamkII-MCS-T2A- mCherry CamkII Neuron specific mCherry pAAV-GFAP-T2A-EGFP GFAP Astrocyte specific EGFP Downregulation pAAV-U6-MCS-CMV- ZsGreen U6 General and strong ZsGreen pAAV-U6-CMV-mCherry U6 General and strong mCherry CircRNA Overexpression pAAV-CMV-crRNA-EF1- ZsGreen CMV General and strong ZsGreen Knockout pAAV-gRNA-saCas9 U6 General and strong None
- 9. 8 Table 3. Listof optogenetics tools in AAV. AAV Plasmids Promoter and Expression Characteristics Fluorescent Label Cre Dependent Optogenetics Effect pAAV-CAG-DIO-eNpHR3.0-EYFP CAG (general and strong expression) EYFP yes Inhibition pAAV-CAG -DIO-hChR2(H134R)-mCherry mCherry yes activation pAAV-CAG-DIO-ArchT-EYFP EYFP yes inhibition pAAV-CAG -DIO-C1V1 (t/t)-TS-mCherry mCherry yes activation pAAV-CAG-DIO-Arch3.0-EYFP EYFP yes inhibition pAAV- CAG -DIO-hCHETA-EYFP EYFP yes activation pAAV-CMV-DIO-eNpHR3.0-EYFP CMV (general and strong expression) EYFP yes inhibition pAAV-CMV-DIO-hChR2(H134R)-mCherry mCherry yes activation pAAV-CMV-DIO-ArchT-EYFP EYFP yes inhibition pAAV-CMV-DIO-C1V1 (t/t)-TS-mCherry mCherry yes activation pAAV-CMV-DIO-Arch3.0-EYFP EYFP yes inhibition pAAV-CMV-DIO-hCHETA-EYFP EYFP yes activation pAAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFP hSyn (neuron specific pression) EYFP No inhibition pAAV-hSyn-hChR2(H134R)-mCherry mCherry No activation pAAV-hSyn-ArchT-EYFP EYFP No inhibition pAAV-hSyn-C1V1-(t/t)-TS-mCherry mCherry No activation pAAV-hSyn-Arch3.0-EYFP EYFP No inhibition pAAV-hSyn-DIO-hCHETA-EYFP EYFP yes activation pAAV-GFAP-eNpHR3.0-EYFP GFAP (astrocyte specific expression) EYFP No inhibition pAAV-GFAP-hChR2(H134R)-mCherry mCherry No activation pAAV-GFAP-ArchT-EYFP EYFP No inhibition pAAV-GFAP-C1V1 (t/t)-TS-mCherry mCherry No activation pAAV-GFAP-Arch3.0-EYFP EYFP No inhibition pAAV-GFAP-hCHETA-EYFP EYFP No activation pAAV-CaMKII-eNpHR3.0-EYFP CaMKII (neuron specific expression) EYFP No inhibition pAAV-CaMKII-hChR2(H134R)-mCherry mCherry No activation pAAV-CaMKII-ArchT-EYFP EYFP No inhibition pAAV-CaMKII-C1V1 (t/t)-TS-mCherry mCherry No activation pAAV-CaMKII-Arch3.0-EYFP EYFP No inhibition pAAV-CaMKII-hCHETA-EYFP EYFP No activation
- 10. 9 Table 4. Listof chemical genetics tools in AAV. AAV Plasmids Promoter and Expression Characteristics Fluorescent Label Cre Dependent Optogenetics Effect pAAV-CAG-DIO-DTR-2A-GFP CAG (general and strong expression) EGFP Yes pAAV-hSyn-DTR-2A-GFP hSyn (neuron specific expression) GFP No pAAV-CaMKII-DTR-2A-GFP CaMKII (neuron specific expression EGFP No pAAV-CAG-DIO-hM3D(Gq)- mCherry CAG (general and strong expression) mCherry Yes Gq-DREADD pAAV-CAG-DIO-hM4D(Gi)- mCherry CAG (general and strong expression) mCherry Yes Gi- DREADD pAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)- mCherry hSyn (neuron specific expression) mCherry Yes Gq-DREADD pAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)- mCherry hSyn (neuron specific expression) mCherry Yes Gi- DREADD pAAV-hSyn-hM3D(Gq)- mCherry hSyn (neuron specific expression) mCherry No Gq-DREADD pAAV-hSyn-hM4D(Gi)- mCherry hSyn(neuron specific expression) mCherry No Gi- DREADD pAAV-CaMKII-hM3D(Gq)- mCherry CaMKII (neuron specific expression) mCherry No Gq-DREADD pAAV-CaMKII-hM4D(Gi)- mCherry CaMKII (neuron specific expression) mCherry No Gi- DREADD
- 11. 10 Table 5. Listof autophagy flux monitor tools with AAV Type AAV Plasmids Promoter and Expression Characteristics Fluorescent Label Double label pAAV-mRFP-GFP-LC3 CMV general and strong expression mRFP+GFP Single label pAAV-GFP-LC3 CMV general and strong expression GFP Overall Experiment Procedure of AAV Production A schematic overview of recombinant AAV production is shown in Figure 2. The first step is to clone the gene of interest (GOI) into an appropriate plasmid vector. For most applications, the cDNA of interest is cloned into one of the ITR/MCS containing vectors (table 2). The inverted terminal repeat (ITR) sequences present in these vectors provide all of the cis-acting elements necessary for AAV replication and packaging. The recombinant expression plasmid is co-transfected into the AAV-293 cells with pHelper (carrying adenovirus- derived genes) and pAAV-RC (carrying AAV2 replication and capsid genes), which together supply all of the trans- acting factors required for AAV replication and packaging in the AAV-293 cells. Recombinant AAV viral particles are prepared from infected AAV-293 cells and may then be used to infect a variety of mammalian cells. Upon infection of the host cell, the single-stranded virus must be converted into double-stranded in order for gene expression. The AAV virus relies on cellular replication factors for synthesis of the complementary strand. This conversion is a limiting step in recombinant gene expression and can be accelerated using adenovirus superinfection or etoposides, such as camptothecin or sodium butyrate. Whereas these agents are toxic to the target cells and can kill target cells if left on the cells, so the use of etoposides is only recommended for short-term use or in obtaining viral titers. Typically, the AAV genome will form high molecular weight concatemers which are responsible for stable gene expression in cells.
- 12. 11 Figure 2. AAVpackaging experiment flow chart. Experimental Materials AAV system contains plasmid with gene of interest (GOI), i.e. pAAV-GOI, packaging plasmid pAAV-RC and pHelper. ·The information of pAAV-GOI can be referred in table 2-5, while the plasmid map profiles can be consulted from www.genemedi.net. ·Bacterium strain: Escherichia coli strain Stbl3 is used to amplify AAV vectors and packaging plasmids. ·Cell line: AAV packaging cell AAV-293; Medium: DMEM with penicillin-streptomycin and 10% FBS. To ensure stability and continuity of experiment, it is best to freeze enough AAV-293 cells at logarithmic phase as backup cell bank. Notices: If the cell line is contaminated by mycoplasma, to reach a better cultured cell state, we recommend the use of Genemedi anti-mycoplasma reagent CurePlasmaTM .
- 13. 12 Vector Construction ofAAV Before AAV packaging, gene of interest should be constructed into the vector of ITR-containing plasmids as listed in table 2. Genemedi also provides various AAV vectors with alternative promoters and fluorescent labels. Customization of the vector with tissue specific promoter or conditional dependent regulatory element (e.g cre- dependent FLEX/DIO, tet-on) is also feasible. At the same time, Genemedi has plenty of premade AAV vector goods carrying some genetic tools in stock, such as optogenetics, DRADDs and LC3-indicated autophagy flux detection, etc. (for more details, refer in table 2-5). Note: In order to construct vectors quickly and efficiently, it is strongly recommended to use Genemedi - ClonEasyTM One Step Cloning Kit（Cat. GM-GC-01/02/03. Packaging of AAV Propagate AAV-293 cells in DMEM with 10% FBS and 1% pen/strep. The day before transfection, plate the cells in a 10cm dish such that the cells reach 70-80% confluency the next day. On the day of transfection, set up the 3- plasmid co-transfection as table 6. Table 6. Plasmid and transfection reagent required for transfection of a standard 10cm Dish in AAV Production. Component Amount pAAV-RC 10 μg pHelper 20 μg pAAV-GOI 10 μg LipoGeneTM 100 l DMEM needs to be preheated to 37℃ with water bath. LipoGeneTM transfection reagent needs to be warmed up to room temperature before use, and mix gently before use. Replace the transfection medium of 10cm dish with fresh medium 6 hours post transfection. Note: 1. LipoGeneTM transfection reagent is from Genmedi, please refer to LipoGeneTM manual during transfection. 2. Before transfection, the cells should be in a good state. 3. Please equip with disposable gloves and conduct in BL-2 level.
- 14. 13 Collection and Purificationof AAV Around 72 hours after transfection, harvest the cells from the 10cm plate with a cell scraper. Spin the cells at 1,500g for 5 minutes to collect the cell pellet. Resuspend the cell pellet in 0.5ml lysis buffer (10 mM Tris-HCl (pH8.5), 150 mM NaCl). Freeze/thaw the cell pellet 3 times through a dry ice/ethanol bath and a 37°C water bath to obtain the crude lysate. Spin down the crude lysate at 3,000g for 10 minutes. Collect the supernatant fraction, which contains harvested rAAV. Keep the virus in -80℃. Unless otherwise specified, all AAV viruses are purified with iodixanol gradient ultracentrifugation at 350,000g for 90 min in a T70i rotor at 10℃ to separate out contaminants from the impure AAV preparations. The 15% iodixanol step help destabilize ionic interactions between macromolecules with addition of 1M NaCl. The 40% and 25% steps are used to remove contaminants with lower densities, including empty capsids. The 60% step acts as a cushion for genome-containing virions. The prep with full (genome containing) particles will be enriched after several steps of gradient ultracentrifugation. AAV capsid contains VR1 82kDa, VR2 72kDa and VR3 62kDa, which can be detected using the method of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by silver staining or Coomassie blue staining. Pure AAV should display only three major protein bands, such as the following virus purified in Genemedi shown in Fig 3. We guarantee the purity of the AAV virus based on the specification that we give for different services. Figure 3. Purity of purified AAV virus. Titer Detection of AAV AAV viruses are titered by real-time quantitative PCR using primers targeted the ITR. The amplicons are detected using SYBR green technology. Titer values are then determined by comparison to a standard curve of a plasmid sample of known concentration. An example of the Ct value of standard sample and sample to be tested is shown in table 7, while the standard curve is displayed in figure 4.
- 15. 14 Table 7. Ctvalue of standard and sample in a typical absolute quantification process. Figure 4. Standard curve in absolute quantification. Set the average Ct value of each group as Y-axis, the logarithm of corresponding group as X-axis. Substitute the average Ct value of samples to be tested into formula, obtaining X = 7.45. Substitute the AAV virus titer calculation formula: 10x × 40000 vg/ml= 107.45 × 40000=1.1 × 1012 vg/ml. Cell Infection Test of AAV After AAV titer detection, the infection activity needs to be evaluated before animal experiments. Test the expression of target gene by infecting cells, such as 293T, CHO. MOI will be controlled ranging from 104 to 105 (MOI is multiplicity of infection, namely the number of virus particle needed for infecting a cell). Standard Copy Number (vg/ml) Ct value 1 Ct value 2 Ct value 3 Standard_1 1010 4.51 4.32 4.42 Standard_2 109 7.21 7.61 7.25 Standard_3 108 10.97 10.55 10.67 Standard_4 107 14.19 14.38 14.35 Standard_5 106 17.75 17.58 17.68 AAV Sample 12.78 12.65 12.81
- 16. 15 Recommended protocol forin vitro cell transduction: 1. Thaw the AAV virus on ice. 2. Start cell transduction at MOI of 104 and 106 vg/cell when cells are in a good state and ready for transduction. 3. Incubate cells with the virus-containing media for at least 6-12 hours. Exchanging the virus-containing media during infection is not necessary until 12 hours later. It may take 3-7 days for expression of target genes. 4. If the packaged AAV encoding a fluorescent label protein, the efficiency of viral infection can be observed with a fluorescence microscope, 24h, 48h, 72h and 96h after transduction. Note: AAV infection is cell type and serotype dependent, and the transduction efficiency of some commonly used cell lines are listed in table 8. Generally, AAV has a weak ability to infect cell lines compared to lentivirus and adenovirus, so it is not recommended for in vitro experiments. Table 8. Transduction efficiency comparison among different AAV serotypes. Cell Line AAV1 AAV2 AAV3 AAV4 AAV5 AAV6 AAV8 AAV9 AAV-DJ AAV-DJ/8 Huh-7 13 100 2.5 0 0.1 10 0.7 0 500 0.2 HEK293 25 100 2.5 0.1 0.1 5 0.7 0.1 500 0.3 Hela 3 100 2 0.1 6.7 1 0.2 0.1 667 0.2 HepG2 3 100 16.7 0.3 1.7 5 0.3 ND 1250 0.5 Hep1A 20 100 0.2 1 0.1 1 0.2 0 400 0.1 911 17 100 11 0.2 0.1 17 0.1 ND 500 0 CHO 100 100 14 1.4 333 50 10 1 25000 5 COS 33 100 33 3.3 5 14 2 0.5 500 0.3 MeWo 10 100 20 0.3 6.7 10 1 0.2 2857 1 NIH3T3 10 100 2.9 2.9 0.3 10 0.3 ND 500 0.1 A549 14 100 20 ND 0.5 10 0.5 0.1 1000 0.1 HT1180 20 100 10 0.1 0.3 33 0.5 0.1 333 0.2 Monocytes 1111 100 ND ND 125 1429 ND ND 100 ND Immature DC 2500 100 ND ND 222 2857 ND ND 200 ND Mature DC 2222 100 ND ND 333 3333 ND ND 100 ND
- 17. 16 Animal Experiment withAAV For normal tissues or organs, such as heart, liver, kidney, breast, pancreas, ovary, brain, eye, skeleton muscle, adipose tissue, etc., Genemedi systematically organizes the corresponding optimal AAV serotypes, gene delivery methods and injection volume for mouse and rat tissue infection, which are listed in table 9. Table 9. AAV gene delivery methods in specific organs. Infection organ Recommended serotype Injection route Animal Injection volume (μl) Heart AAV9 Multiple points in situ Rat 10-15/point, 3-5 points Mouse 10-15/point, 3-5 points Tail vein Rat 250 (200g body weight) Mouse 100 Liver AAV8 or AAV9 Tail vein Rat 200 (200g body weight) Mouse 100 Whole brain AAV-PHP.eB Tail vein Rat 200 (200g body weight) Mouse 100 Lateral ventricle AAV9 Stereotactic Rat 1-5 Mouse 1-5 Brain tissue AAV9 Stereotactic Rat 2-3 Mouse 1-2 Fat AAV9 - Intraperitoneal intraperitoneal fat Rat 300 Mouse 150-200 in situ injection - subcutaneous fat Rat 10-15/point, 3-5 points Mouse 10-15/point, 3-5 points Skeletal muscle AAV1 or AAV9 In situ injection Rat 10-15/point, 3-5 points Mouse 10-15/point, 3-5 points Eyes AAV2, AAV10 or AAV-DJ vitreous chamber injection Rat 3-5 Mouse 1-3 subretinal space injection Rat 1-2 Mouse 1-2 Lung AAV6 Intratracheal injection Rat 100 (200g weight) Mouse 50-75 Kidney AAV2 or AAV9 Renal pelvis injection Rat 10-15/point, 3-5 points Mouse 10-15/point, 3-5 points Intestine AAV1 or AAV5 Enema Rat 200 (200g weight) Mouse 100
- 18. 17 As an advancedand safe tool for gene delivery in vivo, AAV has been proved as the most excellent gene therapy vector. How to perform virus injection in specific organs? Four kinds of for AAV gene delivery methods are fully described as follows. Tail Vein Injection Infection sites: Heart, liver and whole brain (AAV-PHP.eB) 1. Put mouse into the device for tail vein injection (If no such device, it can be retrofitted with 50ml centrifuge tube. The whole device should be ventilated and fixed). 2. Disinfect the tail of mouse with 70% alcohol. Be careful to keep the tail warm, the blood vessels will contract if it's too cold. 3. Hold the mouse’s tail with the thumb of the left forefinger, straighten it gently, and then move the forefinger forward, and bend the tail slightly. You can insert needle in the bending place and inject AAV (27-30G insulin needle, 100μl/mouse). 4. Inject slowly, hold for 5-10 seconds to prevent virus from flowing back. 5. Pull out the needle, then press the injection site with fingers or dry aseptic cotton balls or gauze for a few seconds. Figure 5. Diagram of tail vein injection. Hepatic Portal Vein Injection (local delivery of AAV in liver) Infection sites: liver 1. Inject Xylazin/Ketamine mixture (10mg/kg, 100mg/kg) (Xylazin/Ketamine, Sigma-Aldrich X1251, K2753) subcutaneous to anesthetize mouse. 2. Apply ointment on mouse's eyes (Oculentum simplex, Teva Pharmachemie) to prevent eyes from drying. 3. Adjust the mouse's abdomen to make it upward, shave the hair between the second ribs and the area between the fourth nipples. This step can be operated 1 days ahead without anesthesia. 4. Disinfect the depilation site repeatedly. Then cut 3cm from the ribs to the area of the fourth nipple with a scalpel. Be careful not to hurt other tissues such as mammary glands, intestines, liver and so on.
- 19. 18 5. Carefully pullout the internal organs such as the large intestine and small intestine with a sterile cotton swab. And gently cover them with gauze to avoid touching, until the hepatic portal vein can be seen. 6. Suck the virus into a 32g syringe in advance, insert the needle slowly into the hepatic portal vein at an angle of less than 5 degrees and at a distance of about 1 cm below the liver. Insert 3-5 mm along the hepatic portal vein (if it is difficult to see the portal vein, it can be identified by anatomical mirror). 7. Inject the virus slowly. After the injection is completed, stay for 3-5s and then dispense the needle, and gently press it with a cotton swab for a while. Then cover the hepatic portal vein with hemostatic cotton, and gently press with a cotton swab for 5 minutes to help stop bleeding. Make sure hemostasis is done, otherwise continue to press the wound. 8. Remove the hemostatic cotton (If the tissue is tightly attached to the hemostatic cotton, it can be moistened with sterile PBS). 9. Gently put the organ back into the belly of the mouse. Suture the wound using a 4-0 line, approximately 10-15 needles. 10. Inject 100μl of bupivacaine (5mg/ml) to the wound site to relieve pain. Hydration was performed by subcutaneous injection of 500μl of sterile PBS with a 26G insulin needle. The entire operation took about 30 minutes. 11. It is necessary to keep the body of the mouse warm enough (such as a 37-degree heating lamp, a thermostat, etc.) to facilitate recovery when the experiment is completed. Brain Stereotactic Positioning Infection site: brain 1. Inject Xylazin/Ketamine mixture (10mg/kg, 100mg/kg) (Xylazin/Ketamine, Sigma-Aldrich X1251, K2753) subcutaneous to anesthetize mouse. 2. Shave the hair between the mouse's head and the ear, then place it on the warm tray of the stereo positioner. 3. Zero the ruler between teeth and ears. Apply ointment on mouse's eyes (Oculentum simplex, Teva Pharmachemie) to prevent eyes from drying. 4. Fix the upper incisors of the mouse into the slots of the fixed plate to ensure that the head remains fixed. Adjust Bregma and Lambma on the same sagittal line and horizontal plane. Make sure the mouse's nose is centered and stable. 5. Use a scalpel to peel off the skin of the mouse's head and scrape off the surface with a scalpel. If blood flows out, please dry it with a cotton swab to ensure that the position of the bregma and lambda is clearly visible (plus schematic). 6. Zero the bregma coordinates (X, Y, Z = 0), ensuring that the lambda position is on the same level as the bregma. 7. Set the coordinates according to the target brain area. Once the coordinates are fixed, mark the skull, a hole of
- 20. 19 about 0.015 mmis drilled at the mark within 10 seconds. Be careful to protect brain tissue from being damaged. 8. Suck the AAV into the syringe and insert according to the coordinates set before, then the virus is slowly injected at a rate of 0.05-0.1μl/min. Typically, each mouse is injected at a volume between 0.05μl and 2μl. 9. Keep it for 10 minutes, when the injection is completed, and then return the needle slowly. 10. If blood is flowing out during the operation, use a cotton swab to dry the blood in time. 11. The last step is to suture the scalp. It is necessary to keep the body of the mouse warm enough (such as a 37- degree heating lamp, a thermostat, etc.) to facilitate recovery after the experiment. Intrathecal Injection Infection site: spinal nerve 1. Inject Xylazin/Ketamine mixture (10mg/kg, 100mg/kg) (Xylazin/Ketamine, Sigma-Aldrich X1251, K2753) subcutaneous to anesthetize mouse. 2. Apply ointment on mouse's eyes (Oculentum simplex, Teva Pharmachemie) to prevent eyes from drying. 3. Remove the hair at about 2cm2 of the skin near the tail, in order to see where the needle is inserted. 4. Put the mouse on a special rack and place a 15ml centrifuge tube in the lower part of the body to arch the needle insertion site slightly. 5. Suck the virus into 25μl Hamilton with 30G needles. 6. Position the L6 (the most prominent one) of the spine and gently press it with your fingers to make it smooth. 7. Carefully insert the needle into the groove between the L5 vertebrae and L6 vertebra. Note that the tail of the mouse is slightly upturned, which indicates that the needle is successfully inserted into the myelin sheath. 8. Once successfully inserted, secure the needle with one hand and slowly inject 5-10μl of virus with the other hand. Note that the injection volume should be appropriate, small volume will increase the experimental error and a large volume will increase the intrathecal pressure. 9. If necessary, repeat the injection after 24h. 10. After the experiment, it is necessary to keep the body of the mouse warm enough (such as a 37-degree heating lamp, a thermostat, etc.) to facilitate recovery. 11. As previously reported, it will be better to inject 8 points with 1μl per point. Choose two cross-sections at different depths, and 4 points on a cross-sectional line. The schematic is shown in Figure 6.
- 21. 20 Figure 6. Theschematic of multiple points in situ injection. In addition, Genemedi also organizes the injection video of normal tissues and organs, welcome to enquiry. Usually, it will take at least 3 weeks before the target gene can be detected in vivo by frozen section, paraffin section, qPCR or WB since virus injection. In general, for tissues in situ injection, if AAV is labeled with GFP or RFP, the efficiency of viral infection can be observed with a fluorescence microscope at the injection site since 3 to 4 weeks after injection. Case sharing Case 1. AAV Liver Transduction Figure 7. Selected transduction results of AAV9-GFP in mouse liver. Virus and titer: AAV-pTBG-Luc, 1.4×1012 vg/ml Animal: mouse, C57, 2 months Gene delivery method: tail vein, 100μl Determine assay: 3 weeks post infection, frozen section, immunofluorescence microscopy, in vivo imaging Conclusion: intravenous injection of AAV-pTBG-Luc only infects liver cells and no non-specific infection
- 22. 21 Case 2. AAVHeart Transduction Figure 8. Selected transduction results of AAV9-GFP in rat heart (A, B, C) and mouse heart (D). Virus and titer: AAV9-GFP, 1×1012 vg/ml Animal: Rat, SD, 2 months (Figure 8A, B, C); mouse, C57, 8 months (Figure 8D) Infection site: heart Gene delivery method: myocardial in situ injection, 10μl/site, 5 sites in total (Figure 8A, B, C); intraorbital intravenous injection (Figure 8D) Determine assay: 3 weeks post infection, frozen section, immunofluorescence microscopy Case 3. AAV Lung Transduction Figure 9. Selected transduction results of AAV9-GFP in mouse lung. Virus and titer: AAV9-GFP, 1×1012 vg/ml Animal: Rat, SD, 2 months Infection site: Lung Gene delivery method: Trachea injection, 10μl/site, 5 sites in total Determine assay: 3 weeks post infection, frozen section, immunofluorescence microscopy Case 4. AAV Brain Transduction Figure 10. Selected transduction results of AAV9-GFP in mouse brain. Virus and titer: AAV9-GFP, 1×1012 vg/ml
- 23. 22 Animal: Mouse, C57,2 months Infection site: Brain Gene delivery method: Brain localization injection, 1μl Determine assay: 3 weeks post infection, frozen section, immunofluorescence microscopy Case 5. AAV Hippocampus Transduction Figure 11. Selected transduction results of AAV2-GFP in mouse hippocampus. Virus and titer: AAV9-GFAP-GFP, 1×1012 vg/ml Animal: mouse, C57, 2 months Infection site: Hippocampus Gene delivery method: Brain localization injection, 1μl Determine assay: 3 weeks post infection, wholemount, immunofluorescence microscopy Case 6. AAV Retina Transduction Figure 12. Selected transduction results of AAV2-GFP in mouse retina. Virus and titer: AAV2-GFP, 1×1012 vg/ml Animal: mouse, C57, 2 months Infection site: retina Gene delivery method: subretinal cavity injection, 3μl Determine assay: 3 weeks post infection, wholemount, immunofluorescence microscopy
- 24. 23 Case 7. AAVSkeletal Muscle Transduction Figure 13. Selected transduction results of AAV2-GFP in mouse skeletal muscle. Virus and titer: AAV9-Luc, AAV9-GFP, 1×1012 vg/ml Animal: Mouse, C57, 2 months Infection site: Skeletal muscles Gene delivery method: Muscle in situ injection, 10μl/site, 4 sites in total Determine assay: 4 weeks post infection, in vivo imaging, frozen section, immunofluorescence microscopy Case 8. AAV Kidney Transduction Figure 14. Selected transduction results of AAV2-GFP in mouse muscle. Virus and titer: AAV9-GFP, DJ-GFP, 1×1012 vg/ml Animal: mouse, C57, 2 months Infection site: Kidney Gene delivery method: Multiple sites injection in kidney 10μl/site, 6 sites in total Determine assay: 3 weeks post infection, frozen section, immunofluorescence microscopy
- 25. 24 Case 9. AAVBreast Transduction Figure 15. Selected transduction results of AAV2-GFP in mouse muscle. Virus and titer: AAV9-GFP, 1×1012 vg/ml Animal: mouse, C57, 2 months Infection site: Mammary fat pad Gene delivery method: Breast injection, 10μl/site, 4 sites in total Determine assay: 3 weeks post infection, frozen section, immunofluorescence microscopy Case 10. AAV Tumor Transduction Figure 16. Selected transduction results of AAV-DJ/9-GFP in tumor. Virus and titer: AAV-DJ/9-GFP, 1×1012 vg/ml Animal: Nude mouse, 2 months Infection site: Subcutaneous transplant of bowel cancer cells Gene delivery method: Tumor injection, 10μl/site, 4 sites in total Determine assay: 3 weeks post infection, frozen section, immunofluorescence microscopy
- 26. 25 Case 11. AAVTransduction in vitro Figure 17. Selected transduction results of AAV in vitro Virus and titer: AAV1/6/8/Rh10/DJ/9-GFP, 1×1012 vg/ml Cells: HEK-293T MOI: MOI=1×104 Determine assay: 36 hours post infection, immunofluorescence microscopy References 1. Atchison RW, BC Casto and WM Hammon. (1965). Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science 149:754-6. 2. Hoggan MD, NR Blacklow and WP Rowe. (1966). Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations: physical, biological, and immunological characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A 55:1467-74. 3. Weitzman MD and RM Linden. (2011). Adeno-associated virus biology. Methods Mol Biol 807:1-23. 4. Schmidt M, A Voutetakis, S Afione, C Zheng, D Mandikian and JA Chiorini. (2008). Adeno-associated virus type 12 (AAV12): a novel AAV serotype with sialic acid- and heparan sulfate proteoglycan-independent transduction activity. J Virol 82:1399-406. 5. Gao G, LH Vandenberghe, MR Alvira, Y Lu, R Calcedo, X Zhou and JM Wilson. (2004). Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J Virol 78:6381-8. 6. Vandenberghe LH, JM Wilson and G Gao. (2009). Tailoring the AAV vector capsid for gene therapy. Gene Ther 16:311-9. 7. Wu Z, A Asokan and RJ Samulski. (2006). Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol Ther 14:316-27. 8. Hauck B, L Chen and W Xiao. (2003). Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Mol Ther 7:419-25. 9. Rabinowitz JE, DE Bowles, SM Faust, JG Ledford, SE Cunningham and RJ Samulski. (2004). Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno- associated virus serotypes functionally defines subgroups. J Virol 78:4421-32. 10. Choi VW, DM McCarty and RJ Samulski. (2005). AAV hybrid serotypes: improved vectors for gene delivery. Curr Gene Ther 5:299-310. 11. Dayton RD, MS Grames and RL Klein. (2018). More expansive gene transfer to the rat CNS: AAV PHP.EB vector dose-response and comparison to AAV PHP.B. Gene Ther 25:392-400. 12. Du X, H Hao, Y Yang, S Huang, C Wang, S Gigout, R Ramli, X Li, E Jaworska, I Edwards, J Deuchars, Y Yanagawa, J Qi, B Guan, DB Jaffe, H Zhang and N Gamper. (2017). Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest 127:1741-1756. 13. Feng D, B Wang, L Wang, N Abraham, K Tao, L Huang, W Shi, Y Dong and Y Qu. (2017). Pre-ischemia melatonin treatment alleviated acute neuronal injury after ischemic stroke by inhibiting endoplasmic reticulum stress-dependent autophagy via PERK and IRE1 signalings. J Pineal Res 62. 14. Li C, W Sun, C Gu, Z Yang, N Quan, J Yang, Z Shi, L Yu and H Ma. (2018). Targeting ALDH2 for Therapeutic Interventions in Chronic Pain-Related Myocardial Ischemic Susceptibility. Theranostics 8:1027-1041.
- 27. 26 15. Li L,B Li, M Li, C Niu, G Wang, T Li, E Krol, W Jin and JR Speakman. (2017). Brown adipocytes can display a mammary basal myoepithelial cell phenotype in vivo. Mol Metab 6:1198-1211. 16. Li S, X Dou, H Ning, Q Song, W Wei, X Zhang, C Shen, J Li, C Sun and Z Song. (2017). Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology 66:936-952. 17. Wei Y, Y Chen, Y Qiu, H Zhao, G Liu, Y Zhang, Q Meng, G Wu, Y Chen, X Cai, H Wang, H Ying, B Zhou, M Liu, D Li and Q Ding. (2016). Prevention of Muscle Wasting by CRISPR/Cas9-mediated Disruption of Myostatin In vivo. Mol Ther 24:1889-1891. 18. Wu X, X Wu, Y Ma, F Shao, Y Tan, T Tan, L Gu, Y Zhou, B Sun, Y Sun, X Wu and Q Xu. (2016). CUG-binding protein 1 regulates HSC activation and liver fibrogenesis. Nat Commun 7:13498. 19. Yang H, J Yang, W Xi, S Hao, B Luo, X He, L Zhu, H Lou, YQ Yu, F Xu, S Duan and H Wang. (2016). Laterodorsal tegmentum interneuron subtypes oppositely regulate olfactory cue-induced innate fear. Nat Neurosci 19:283-9. 20. Yuan Y, Y Zheng, X Zhang, Y Chen, X Wu, J Wu, Z Shen, L Jiang, L Wang, W Yang, J Luo, Z Qin, W Hu and Z Chen. (2017). BNIP3L/NIX-mediated mitophagy protects against ischemic brain injury independent of PARK2. Autophagy 13:1754-1766. 21. Zhang X, Y Yuan, L Jiang, J Zhang, J Gao, Z Shen, Y Zheng, T Deng, H Yan, W Li, WW Hou, J Lu, Y Shen, H Dai, WW Hu, Z Zhang and Z Chen. (2014). Endoplasmic reticulum stress induced by tunicamycin and thapsigargin protects against transient ischemic brain injury: Involvement of PARK2-dependent mitophagy. Autophagy 10:1801-13. 22. Yuan YP, ZG Ma, X Zhang, SC Xu, XF Zeng, Z Yang, W Deng and QZ Tang. (2018). CTRP3 protected against doxorubicin-induced cardiac dysfunction, inflammation and cell death via activation of Sirt1. J Mol Cell Cardiol 114:38-47. 23. Shi TY, SF Feng, MX Wei, Y Huang, G Liu, HT Wu, YX Zhang and WX Zhou. (2018). Kainate receptor mediated presynaptic LTP in agranular insular cortex contributes to fear and anxiety in mice. Neuropharmacology 128:388-400. 24. Lu NN, C Tan, NH Sun, LX Shao, XX Liu, YP Gao, RR Tao, Q Jiang, CK Wang, JY Huang, K Zhao, GF Wang, ZR Liu, K Fukunaga, YM Lu and F Han. (2018). Cholinergic Grb2-Associated-Binding Protein 1 Regulates Cognitive Function. Cereb Cortex 28:2391-2404. 25. Li C, D Huang, J Tang, M Chen, Q Lu, H Li, M Zhang, B Xu and J Mao. (2018). ClC-3 chloride channel is involved in isoprenaline-induced cardiac hypertrophy. Gene 642:335-342. 26. Fan C, X Zhu, Q Song, P Wang, Z Liu and SY Yu. (2018). MiR-134 modulates chronic stress-induced structural plasticity and depression-like behaviors via downregulation of Limk1/cofilin signaling in rats. Neuropharmacology 131:364-376. 27. Ma Y, L Yu, S Pan, S Gao, W Chen, X Zhang, W Dong, J Li, R Zhou, L Huang, Y Han, L Bai, L Zhang and L Zhang. (2017). CRISPR/Cas9-mediated targeting of the Rosa26 locus produces Cre reporter rat strains for monitoring Cre-loxP-mediated lineage tracing. FEBS J 284:3262-3277. 28. Liu X, F Tian, S Wang, F Wang and L Xiong. (2017). Astrocyte Autophagy Flux Protects Neurons Against Oxygen-Glucose Deprivation and Ischemic/Reperfusion Injury. Rejuvenation Res. 29. Liang J, L Li, Y Sun, W He, X Wang and Q Su. (2017). The protective effect of activating Nrf2 / HO-1 signaling pathway on cardiomyocyte apoptosis after coronary microembolization in rats. BMC Cardiovasc Disord 17:272. 30. He Y, S Pan, M Xu, R He, W Huang, P Song, J Huang, HT Zhang and Y Hu. (2017). Adeno-associated virus 9-mediated Cdk5 inhibitory peptide reverses pathologic changes and behavioral deficits in the Alzheimer's disease mouse model. FASEB J 31:3383-3392. 31. Duan NN, XJ Liu and J Wu. (2017). Palmitic acid elicits hepatic stellate cell activation through inflammasomes and hedgehog signaling. Life Sci 176:42-53. 32. Du D, L Hu, J Wu, Q Wu, W Cheng, Y Guo, R Guan, Y Wang, X Chen, X Yan, D Zhu, J Wang, S Zhang, Y Guo and C Xia. (2017). Neuroinflammation contributes to autophagy flux blockage in the neurons of rostral ventrolateral medulla in stress-induced hypertension rats. J Neuroinflammation 14:169. 33. Bai J, XJ Yu, KL Liu, FF Wang, GX Jing, HB Li, Y Zhang, CJ Huo, X Li, HL Gao, J Qi and YM Kang. (2017). Central administration of tert- butylhydroquinone attenuates hypertension via regulating Nrf2 signaling in the hypothalamic paraventricular nucleus of hypertensive rats. Toxicol Appl Pharmacol 333:100-109. 34. Lei S, RZ Sun, D Wang, MZ Gong, XP Su, F Yi and ZW Peng. (2016). Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol 7:270.
- 28. 27 Contact Information Genemedi Biotech.Inc. For more information about AAV, please visit: www.genemedi.net/i/aav-packaging For more information about Genemedi products and to download manuals in PDF format, please visit our web site: www.genemedi.net For additional information or technical assistance, please call or email us Worldwide：+86-21-50478399 Fax：+86-21-50478399 E-mail: support@genemedi.net © 2018 Genemedi Biotech. Inc. All rights reserved. Related products 1. AAV packaging system More details please visit: https://www.genemedi.net/i/aav-vector-system 2. AAV Promise-ORF TM : Sequence-verified CDNA clones in AAV and mammalian expression vectors. More details please visit: https://www.genemedi.net/i/virus-plasmid 3. AAV custom production More details please visit: https://www.genemedi.net/i/adeno-associated-virus-aav-customized-production-service
- 29. About GeneMedi GeneMedi specializesin creating superior antibody, protein, and vector-based bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions. At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of unparalleled expertise in the following areas: Innovative Antigen Design and Robust Assay Development Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical and research settings. Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUSTM for accelerated antibody discovery and LIBRATM for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize molecules with optimal stability and functionality. Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXTTM platform is our answer to the industry's need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking gene therapy approaches. High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent quality controls. Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification techniques to guarantee vector efficacy and integrity Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic accuracy. Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry. Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability Scalable Production and Uncompromising Quality Comprehensive Solutions for Diverse Application Needs GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner. Website: https://www.genemedi.net Contact Email: support@genemedi.net | sales@genemedi.net
- 30. Protocols Library: Gene Therapy Biologics GENEMEDI nnovati ion forTherapeutics&Diagnostics Industry DiagnosticsTarMart Click to download. Table of Content ユーザーマニュアル アデノ随伴ウイルス（AAV） s Storage and Diutionof AAV………………………………………………………………………2 Introductionof AAV……………………………………………………………………………… Table ofContents………………………………………………………………………………1 SafeUse of AAV…………………………………………………………………… …………… ……………2 3 Advantages of AAV forGeneDelveryand Expression………………………………………………3 AAVSerotypes andNative Tropism-AAV Seledion Guide…………………………………………………4 AAV Product, Service and Information ofVector,Listof Goods inStockofGenemedi……………………6 ProductandService tem ofGenemedi AAV………………………………………………………………6 ProductCharacterofGenemedi AAV… …………………… … …… …………………………… …… … …6 Listof MainGenemedi AAVVectorand Goods in Stock……………………………………………………7 Overall ExperimentProcedureofAAVProduction………………………………………………………10 Experimental Materials………………………………………………………………………………………11 Vector ConstructionofAAV…………………………………………………………………………………12 Packagingof AAV………………………………………………………………………………12 Collection and Purificationof AAV…………………………………………………………………………13 TiterDetectionof AAV………………………… ……………………………………………………13 Cell InfectionTestofAAV………………………… …………………………………………………14 AnimalExperimentwithAAV………………………………………………………………………………16 TailVein Injedion………………………… ………………………………………… ……………………17 Hepafic Portal Vein Injection (localdelveryof AAVinliver)……………………………………………17 Brain Stereotacic Posiioning…………………………………………………………………18 Inrathecal njection……………………………… …………………………………………………………19 Casesharing………………………………………………………………………………………………20 Case 1.AAVLiverTransduction……………………………………………………………………………20 Case2.AAVHeart Transducion………………………………………… …… ……………………………21 Case 3.AAV LungTransduction…………………………………………………………………………21 Case 4.AAV Brain Transduction……………………………………………………………………21 Case 5.AAV HippocampusTransduction………………………………………………………………22 Case6.AAV Retna Transducion………………………… ………………………………………………22 Case 7.AAVSkeletal Muscle Transdudtion………………………………………………………………23 Case 8.AAV Kidney Transduction………………………………………………………………………23 Case 9.AAV Breast Transducion………………………… ………………………………………………24 Case 10.AAVTumorTransduction………………………………………………………………………24 Case 11.AAVTransducion in vino……………………………………………………………25 References……………………………………………………………………………………………………25 1
- 31. AAV の安全な使用 1. AAV関連実験は、生物安全レベル 2 施設（BL-2 レベル）で実施する必要があります。 2. ラボコート、マスク、手袋を完全に装備し、手と腕を露出させないよう最善を尽くしてください。 3. ウイルス懸濁液を飛ばすのに注意してください。運転中にバイオセーフティキャビネットがウイルスに汚染 された場合は、すぐに 70%アルコールと 1%SDS を含む溶液でテーブルボードをこすります。すべてのチッ プ、チューブ、培養プレート、ウイルスに接触する培地は、廃棄する前に塩素含有消毒液に浸す必要があり ます。 4. 遠心分離が必要な場合は、遠心チューブを密閉する必要があります。条件が許容されている場合は、遠心分 離する前にパラフィルムでチューブをシールします。 5. AAV 関連の動物実験も BL-2 レベルで実施する必要があります。 6. AAV 関連廃棄物は、処分前に特別に収集しオートクレーブする必要があります。 7. 実験後は消毒剤で手を洗います。 AAV の保存と希釈 AAV の保管 ウイルスは 4°C で短時間（1 週間未満）保存し、受信後に使用することができます。AAV ウイルスは凍結解 凍に敏感であり、凍結解凍を繰り返すと価数が低下するため、アリコットウイルス在庫は到着直後に-80°C 冷凍庫で保管して長期使用する必要があります。一方、AAV ウイルスが 12 か月以上保存されている場合 は、使用前にウイルス価の再検出が推奨されます。 AAV の希釈 ウイルス希釈が必要な場合は、ウイルスを氷の水に溶かします。溶解後、ウイルスを培地、無菌 PBS または 生理食塩水と混合し、4°C に保ちます(1 週間以内に使用します)。 注意事項 · 環境の極端な状況(pH、EDTA などのキレート剤、温度、有機溶剤、タンパク質変性剤、強力な洗剤など )への AAV 曝露を避ける。 · 渦、泡の吹き付け、または同様の操作中に AAV サンプルに空気を導入することを避け、タンパク質の変性を ください。ほとんどの AAV ウイルスは非常に粘着性があり、冷凍しないとチューブ、細胞培養プレート、ピ ペット先端などの通常のプラスチックにさらされると損失が発生する可能性があります。AAV をシリコン化 または低タンパク質結合チューブに保存するのが最善です。プラ ロニック F-68 を配合緩衝液で 0.01%~0.1%で使用すると、通常のプラスチックを使用すると、付着が最小限に抑えら 引き起こす可能性があります。 · 繰り返しの凍結と解凍は避けてください。 · 「通常の」プラスチック(特にポリスチレンまたは疎水性プラスチック)に液相で長期間曝露しないようにして れます。 2
- 32. 3 ・AAV を低塩溶液に希釈しないようにしてください。AAV2 などのいくつかのAAV 血清型は、低塩溶液に凝 集し、非感染性になります。 AAV の導入 ゲネメディバイオサイエンスでは、組換えアデノ関連ウイルス（rAAV）発現システムが、in vitro および in vivo でシュラ、ヒトオルフ、クリスプルを送達および発現するのに利用されています。 アデノ関連ウイルス（AAV）は、ヒトおよび他の霊長類種に感染する小さな単鎖 DNA ウイルスです。現 在、AAV は病気を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫反応しか誘発しません。野生型 AAV はパルボウイルス科の一員として、複製を完了するにはアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの支援が必 要であり、これがアデノ関連ウイルスと呼ばれる理由です[1,2]。野生型 AAV2 ゲノムは、ウイルスの rep 遺 伝子と cap 遺伝子（複製遺伝子とカプシド遺伝子をそれぞれコードする）で構成され、複製とパッケージ化 に必要なすべてのシス作用元素を含む反転末端繰り返し（ITRs）で囲まれています。典型的な AAV2 のゲノ ムは約 4800bp で、Rep と Cap を含む 2 つの反転終端繰り返し(ITR)の間にある 2 つの上流と下流のオープ ンリードフレーム(orf)で構成されます(図 1)。補完的な DNA 鎖の合成には ITR が必要ですが、Rep と Cap は AAV ウイルスサイクル必須タンパク質 Rep78、Rep68、Rep52、Rep40、および包囲タンパク質 VP1、VP2、VP3 などを含むさまざまなタンパク質に翻訳することができます[3]。 本組換え AAV（rAAV）ベクターは、ITR 間のすべてのウイルスゲノムを長さ 5 キロベース未満の転写カセッ トに置き換えることによって生成されます。次に、得られた構築物は、他の 2 つのプラスミドと共同発現さ れます。1)トランスで Rep および Cap 遺伝子を提供する AAV-RC プラスミド(ITR/Transgene カセットと は別の)、および 2)アデノウイルスを保持する AAV ヘルパープラスミド。ヘルパー遺伝子。AAV-293 細胞 は、トランスにおいても E1a タンパク質を提供するため、包装細胞株として使用されています。Rep 遺伝子 と Cap 遺伝子を修正することで、科学者は血清型を制御して組換え AAV 感染を特定の組織に誘導することが できます。この 3 プラスミド共トランスフェクションシステムは、AAV 生産中のアデノウイルスの必要性を 解放し、精製プロセスを大幅に簡素化します。 これまでに、合計 12 の AAV 血清型が、独自の特徴と熱帯性を備えて記述されています[4]。高安全性、低免 疫原性、外因性遺伝子の長期発現に関して、AAV は in vivo 遺伝子機能研究のための最良の遺伝子送達ツール であると考えられています。 図 1。AAV2 ゲノム構造の模式図。 遺伝子の送達と発現における AAV の利点 1.優れたバイオセーフティ評価 AAV は自然に欠陥のあるウイルスであり、生産的な感染のためにトランスのいくつかの因子の提供を必要と し、ヒトの疾患と関連していません。当社の AAV 生産システムでは、AAV2 ITR 配列と rep/cap 遺伝子は、 相同性の欠如した別のプラスミド上に存在し、組換え野生型ウイルスの産生を防ぎます。これらの特徴 は、AAV にウイルス由来の遺伝子送達および発現ベクターの中で優れた生物安全性評価を与えます。
- 33. 4 2. 広範囲の感染性 AAV ウイルスは幅広い哺乳類細胞に感染し、ヒトおよび非ヒトタンパク質を発現するために成功しています。ウ イルス由来の他のベクターとは対照的に、AAVベクターは免疫能力のある宿主における遺伝子発現に有能である ことが証明されています。 3. 高価 このプロトコルでは、107 以上のウイルス粒子/ml の高価で組換え AAV を製造することができます。濃度が公開 された後、最大 1013 個のウイルス粒子/ml の価数が得られます。 4. 感染は積極的に分裂する宿主細胞を必要としません AAV は分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染する可能性があります。 5. 長期遺伝子移動可能性 組換え AAV（rAAV）はヒト細胞内で維持され、長期的な遺伝子移行の可能性を生み出します。ほとんどの細胞集 団では、ウイルスゲノムは通常、表染色体のままであり、しばしばコンテマーを形成し、ゆっくり分裂している 細胞または分裂していない細胞で安定しており、長期的な遺伝子移動と発現につながります。一方、細胞集団が急 速に分割される場合、AAV ウイルスは宿主ゲノムに統合することができますが、コンテマーを形成することはで きません。これにより、分割された細胞において長期的な遺伝子発現が生じますが、これはまれな出来事で す。AAV の非常に高い多数感染(MOI)が使用されている場合、または野生型アデノウイルスの使用によって供給さ れる可能性のあるアデノウイルスレプリカーゼの存在下で感染が発生した場合、統合はより頻繁に発生します。た だし、野生型アデノウイルスを使用することで統合イベントを増加させるために、AAV システムの生物安全性が 低下します。 AAV 血清型とネイティブトロピズム-AAV 選択ガイド 過去数十年にわたって、多数の AAV 血清型が可変熱帯性で同定されてきました。これまでに、アデノウイルス株 またはヒト/非ヒト霊長類組織から 12 の AAV 血清型と 100 以上の AAV 変異体が分離されています。さまざまな AAV 血清型は異なる熱帯性を示し、さまざまな細胞タイプや組織タイプに感染します。したがって、適切な AAV 血清型を選択することは、標的細胞または組織への遺伝子送達に不可欠です。 特定の細胞または組織タイプに対する自然な熱帯性が示されたため、rAAV はかなりの注目を集めています。ヒト や他の霊長類に非常に蔓延しており、いくつかの AAV 血清型が分離されています。AAV2、AAV3、AAV5、AAV6 はヒト細胞で発見され、AAV1、AAV4、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12 は非ヒト霊長類サン プルで発見されました[5,6]。さまざまな血清型間のゲノムの発散は、ウイルスカプシドの超可変領域（HVRs）に 最も集中しており、それが組織の熱帯性を決定する可能性があります。ウイルスカプシドに加えて、 AAV ベク ターの組織トロピズムは、細胞表面受容体、細胞の取り込み、細胞内処理、ベクターゲノムの核送達、コーティン グ解除、および第 2 鎖 DNA 変換の影響も受けます[7]。 標的組織に対する AAV の感染効率と特異性をよりよく向上させるために、科学者たちはウイルスカプシドを遺伝 子組み換え、血清型間でドメインまたはアミノ酸を交換することによってキメラ AAV を作成するモザイクベク ターを生成しました[8,9]。これにより、研究者が特定の血清型を持つ細胞を特異的に標的にして、局在領域で遺 伝子を効果的に伝達および発現することができる可能性があります[10]。 一方、動物の血液脳関門を貫通する AAV の能力は大幅に制限されているか、または改善されています。従 来、AAV は中枢神経系の科学研究のための手術によってのみ脳組織に注入することができ、実験の難易度が大幅 に高まり、実験結果に影響を与えました。現在、PHP.B と PHP.eB の修正された AAV 血清型は、血液脳関門を介 して脳全体に感染する可能性があります。
- 34. 5 末梢血注射[11]。最も人気のある rAAV 血清型とその熱帯性を次の表1 に示します。 表 1。rAAV 血清型とその熱帯性。 AAV 血清型 組織トロピズム CNS の 網膜 肺 肝臓 膵臓；膵臓 腎臓 心臓 筋 AAV1 √ √ √ √ √ AAV2 √ √ √ AAV3 √ √ √ √ AAV4 √ √ √ AAV5 √ √ √ √ AAV6 √ √ √ √ √ AAV7 √ √ AAV8 √ √ √ √ AAV9 √ √ √ √ √ AAV-DJ √ √ √ √ AAV-DJ/8 √ √ √ AAV-Rh10 √ √ √ √ √ AAV レトロ √ √ √ AAV-PHP.B √ √ √ AAV-PHP.eB √ √ AAV-PHP.S √ √ √
- 35. 6 AAV ベクターの製品、サービスおよび情報、ジェネメディの在庫商品一覧 Genemedi AAVの製品およびサービスアイテム ・アデノ関連ウイルス（AAV）カスタマイズされた生産サービス（表 2）。 ・CRISPR/Cas9 アデノ関連ウイルス（AAV）生産サービス。 ·光遺伝学アデノ関連ウイルス（AAV）生産サービス（表 3 および表 4）。 ・オートファジーフラックス検出のための AAV-LC3 生産サービス（表 5）。 ・事前に作られたアデノ関連ウイルス(AAV)生産サービス。 ・アデノ関連ウイルス(AAV)コントロールウイルス生産サービス。 ジェネメディ AAV の製品特性 ・高効率。AAV の免疫原性は非常に低い。ウイルス価は最大 1014 vg/ml であり、さまざまな組織での 感染効率が高い。 ・長期的な表現。標的遺伝子の発現は 2 年以上持続することができる。 ·大きな血清型ライブラリ。11 種類の血清型とさまざまな変異サブタイプを備えた AAV は、ほぼすべて の動物組織や臓器に効率的に感染する可能性があります。 ・組織トロピズム。心臓、肝臓、筋肉、さまざまな神経組織特異的プロモーターなど、さまざまな細 胞/組織に多くの組織特異的プロモーターが利用可能です。 ・高品質。すべてのウイルス製品は、無菌、非マイコプラズマ、非エンドトキシンを含む厳格なテスト を受けています。
- 36. 7 表 2。AAV ベクトルのリスト （心臓、肝臓、筋肉などの組織特異的なプロモーターの一部は表に記載されていませんので、ご相談くださ 主な遺伝子ベクターと在庫商品のリスト い） タイプAAV プラスミド 推進者；推進 者 表現特性 蛍光ラベル 注記 過剰表現 pAAV-CMV-MCS-T2A- ズグリーン CMV；CMV 一般的で強い ズグリーン pAAV-CMV-MCS-EF1- ズグリーン CMV；CMV 一般的で強い ズグリーン pAAV-CAG-MCS-T2A- ズグリーン カグ；カグ； カグ 一般的で強い ズグリーン pAAV-CAG-MCS-T2A- ムチェリー カグ；カグ； カグ 一般的で強い ムチェリー パアブ・カグ・ディオ・ミク ス- T2A-ZsGreen カグ；カグ； カグ 一般的で強い ズグリーン クレ依存式 パアブ・カグ・ディオ・ミク ス- T2A-mCherry カグ；カグ； カグ 一般的で強い ムチェリー クレ依存式 pAAV-hsyn-MCS-T2A- ズグリーン ヒシン；ヒシ ン ニューロン特異的 ズグリーン pAAV-hsyn-MCS-T2A- ムチェリー ヒシン；ヒシ ン ニューロン特異的 ムチェリー pAAV-CamkII-MCS-T2A- ズグリーン カムキー ニューロン特異的 ズグリーン pAAV-CamkII-MCS-T2A- ムチェリー カムキー ニューロン特異的 ムチェリー pAAV-GFAP-T2A-EGFP GFAP；GFAP アストロサイト特異 的な EGFP ダウンレギュレー ション pAAV-U6-MCS-CMV- ズグリーン U 6 一般的で強い ズグリーン pAAV-U6-CMV-mCherry U 6 一般的で強い ムチェリー CircRNA 過剰 表現 pAAV-CMV-crRNA-EF1- ズグリーン CMV；CMV 一般的で強い ズグリーン ノックアウト；ノッ クアウト パブグルナサカス 9 U 6 一般的で強い なし
- 37. 8 表 3。AAV の光遺伝学ツールのリスト。 AAVプラスミド プロモーターおよび発現特性 蛍光ラベル クレ依 存の 光学遺伝学効 果 pAAV-CAG-DIO-eNpHR3.0-EYFP カグ；カグ；カグ （一般的で強い表現） EYFP；EYFP はい 阻害 paav-cag-dio-hchr2(H134R)-mCherry ムチェリー はい 活性化；活性化 pAAV-CAG-DIO-ArchT-EYFP EYFP；EYFP はい 阻害 paav-cag-dio-c1v1(t/t)-TS-mCherry ムチェリー はい 活性化；活性化 pAAV-CAG-DIO-Arch3.0-EYFP EYFP；EYFP はい 阻害 paav-cag-dio-hcheta-eyfp EYFP；EYFP はい 活性化；活性化 pAAV-CMV-DIO-eNpHR3.0-EYFP CMV；CMV （一般的で強い表現） EYFP；EYFP はい 阻害 pAAV-CMV-DIO-hChR2(H134R)-mCherry ムチェリー はい 活性化；活性化 pAAV-CMV-DIO-ArchT-EYFP EYFP；EYFP はい 阻害 pAAV-CMV-DIO-C1V1(t/t)-TS-mCherry ムチェリー はい 活性化；活性化 pAAV-CMV-DIO-Arch3.0-EYFP EYFP；EYFP はい 阻害 pAAV-CMV-DIO-hCHETA-EYFP EYFP；EYFP はい 活性化；活性化 pAAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFP ヒシン；ヒシン (ニューロン特異的圧迫) EYFP；EYFP いいえ 阻害 pAAV-hSyn-hChR2(H134R)-mCherry ムチェリー いいえ 活性化；活性化 pAAV-hSyn-ArchT-EYFP EYFP；EYFP いいえ 阻害 pAAV-hSyn-C1V1-(t/t)-TS-mCherry ムチェリー いいえ 活性化；活性化 pAAV-hSyn-Arch3.0-EYFP EYFP；EYFP いいえ 阻害 pAAV-hSyn-DIO-hCHETA-EYFP EYFP；EYFP はい 活性化；活性化 pAAV-GFAP-eNpHR3.0-EYFP GFAP；GFAP （アストロサイト特異的発現） EYFP；EYFP いいえ 阻害 pAAV-GFAP-hChR2(H134R)-mCherry ムチェリー いいえ 活性化；活性化 pAAV-GFAP-ArchT-EYFP EYFP；EYFP いいえ 阻害 pAAV-GFAP-C1V1(t/t)-TS-mCherry ムチェリー いいえ 活性化；活性化 pAAV-GFAP-Arch3.0-EYFP EYFP；EYFP いいえ 阻害 pAAV-GFAP-hCHETA-EYFP EYFP；EYFP いいえ 活性化；活性化 pAAV-CaMKII-eNpHR3.0-EYFP カムキー （ニューロン特異的発現） EYFP；EYFP いいえ 阻害 pAAV-CaMKII-hChR2(H134R)-mCherry ムチェリー いいえ 活性化；活性化 パアブ・カムキー・アルト・エイフプ EYFP；EYFP いいえ 阻害 pAAV-CaMKII-C1V1(t/t)-TS-mCherry ムチェリー いいえ 活性化；活性化 pAAV-CaMKII-Arch3.0-EYFP EYFP；EYFP いいえ 阻害 pAAV-CaMKII-hCHETA-EYFP EYFP；EYFP いいえ 活性化；活性化
- 38. 9 表 4。AAV の化学遺伝学ツールのリスト。 AAVプラスミド プロモーターおよび発現特 性 蛍光ラベル クレ依 存の 光学遺伝学効 果 pAAV-CAG-DIO-DTR-2A-GFP カグ；カグ；カグ （一般的で強い表現） EGFP はい pAAV-hSyn-DTR-2A-GFP ヒシン；ヒシン （ニューロン特異的発現） GFP いいえ pAAV-CaMKII-DTR-2A-GFP カムキー (ニューロン特異的発現 EGFP いいえ pAAV-CAG-DIO-hM3D(Gq)- ムチェリー カグ；カグ；カグ （一般的で強い表現） ムチェリー はい Gq-ドレアド pAAV-CAG-DIO-hM4D(Gi)- ムチェリー カグ；カグ；カグ （一般的で強い表現） ムチェリー はい ギ・ドレアド pAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)- ムチェリー ヒシン；ヒシン （ニューロン特異的発現） ムチェリー はい Gq-ドレアド pAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)- ムチェリー ヒシン；ヒシン （ニューロン特異的発現） ムチェリー はい ギ・ドレアド pAAV-hSyn-hM3D(Gq)- mCherry ヒシン；ヒシン （ニューロン特異的発現） ムチェリー いいえ Gq-ドレアド pAAV-hSyn-hM4D(Gi)- mCherry hSyn(ニューロン特異的発現) ムチェリー いいえ ギ・ドレアド pAAV-CaMKII-hM3D(Gq)- ムチェリー カムキー （ニューロン特異的発現） ムチェリー いいえ Gq-ドレアド pAAV-CaMKII-hM4D(Gi)- ムチェリー カムキー （ニューロン特異的発現） ムチェリー いいえ ギ・ドレアド
- 39. 10 表 5。AAV を備えたオートファジーフラックスモニターツールのリスト タイプAAV プラスミド プロモーターおよび発現特性 蛍光ラベル 二重ラベル pAAV-mRFP-GFP-LC3 CMV 一般的で強い表現 mrfp gfp 単一ラベル pAAV-GFP-LC3 CMV 一般的で強い表現 GFP AAV 生産の全体的な実験手順 組換え AAV 生産の概略的な概要を図 2 に示します。最初のステップは、関心遺伝子（GOI）を適切なプ ラスミドベクターにクローンすることです。ほとんどのアプリケーションでは、関心のある cDNA は、 ベクトルを含む ITR/MCS のいずれかにクローンされます(表 2)。これらのベクトルに存在する反転端子 繰り返し(ITR)配列は、AAV 複製とパッケージ化に必要なすべての cis 作用要素を提供します。 組換え発現プラスミドは、AAV-293 細胞にフェルパー(アデノウイルス由来遺伝子を運ぶ)と pAAV- RC(AAV2 複製およびカプシド遺伝子を運ぶ)と共にトランスフェクトされ、AAV-293 細胞内の AAV 複 製およびパッケージに必要なすべてのトランス作用因子を提供します。組換え AAV ウイルス粒子は、 感染した AAV-293 細胞から調製され、その後、様々な哺乳類細胞を感染させるために使用され得る。 宿主細胞が感染すると、遺伝子発現のために単鎖ウイルスを二鎖に変換する必要があります。AAV ウイ ルスは、相補鎖の合成のために細胞複製因子に依存しています。この転換は、組換え遺伝子発現の制限 ステップであり、アデノウイルス重複感染やカンプトテシンや酪酸ナトリウムなどのエトポシドを用い て促進することができる。これらの薬剤は標的細胞に有毒であり、細胞上に残すと標的細胞を殺す可能 性があるため、エトポシドの使用は短期的な使用またはウイルス価を得るためにのみ推奨されます。通 常、AAV ゲノムは、細胞内の安定した遺伝子発現の原因となる高分子量のコンテマーを形成します。
- 40. 11 図 2。AAV パッケージ実験フローチャート。 実験材料 AAVシステムには、関心遺伝子（GOI）を持つプラスミド、すなわち pAAV-GOI、パッケージングプラ スミド pAAV-RC およびフェルパーが含まれています。 ·pAAV-GOI の情報は表 2-5 で参照できますが、プラスミドマッププロファイルは www.genemedi.net から参照できます。 ・細菌株：大腸菌株 Stbl3 は、AAV ベクターの増幅とプラスミドの包装に使用されます。 ・細胞株：AAV パッケージングセル AAV-293；培地：ペニシリンストレプトマイシンと 10%FBS を含 む DMEM。実験の安定性と継続性を確保するために、バックアップセルバンクとして十分な AAV-293 セルを対数相で凍結するのが最善です。 通知： 細胞株がマイコプラズマによって汚染されている場合、より良い培養細胞状態に達するために、ゲネメ ディ抗マイコプラズマ試薬キュレプラズマの使用をお勧めします。
- 41. 12 AAV のベクトル構造 AAV パッケージ化の前に、表2 に記載されているように、イトル含有プラスミドのベクターに関心のあ る遺伝子を構築する必要があります。Genemedi はまた、代替プロモーターと蛍光ラベルを備えたさま ざまな AAV ベクターを提供します。組織固有のプロモーターまたは条件付きの調節要素(例えば、クレ 依存のフレックス/ディオ、テットオン)を使用したベクターのカスタマイズも可能です。同時に、ゲネ メディには、光学遺伝学、DRADDs、LC3 指示オートファジーフラックス検出などのいくつかの遺伝 ツールを備えた事前に作成された AAV ベクターグッズが豊富に在庫されています(詳細については、表 2-5 を参照してください)。 注意： ベクターを迅速かつ効率的に構築するためには、genemedi-cloneasytm ワンステップクローンキット (cat.gm-gc-01/02/03)を使用することを強くお勧めします。 AAV のパッケージ 10%の FBS と 1%の pen/strep で DMEM 内で AAV-293 細胞を伝播します。トランスフェクションの 前日、次の日に細胞が 70〜80%の合流に達するように 10cm の皿に細胞をプレートします。トランス フェクション当日は、3 プラスミド共トランスフェクションを表 6 に設定した。 表 6。AAV 製造における標準 10cm 皿のトランスフェクショ ンに必要なプラスミドおよびトランスフェクション試薬。 成分 額 pAAV-RC 10 μ g フェルパー；フェルパー 20 μ g パアブ・ゴイ 10 μ g 脂肪遺伝子 100 μ l DMEM は水浴で 37℃に予熱する必要があります。リポゲネットトランスフェクション試薬は、使用前 に室温まで温め、使用前に穏やかに混合する必要があります。10cm 皿のトランスフェクション媒体 を、トランスフェクション後 6 時間後に新鮮な媒体に置き換えます。 注意： 1. LipoGeneTM トランスフェクション試薬は Genmedi からのものです。トランスフェクション中は LipoGeneTM マニュアルを参照してください。 2. トランスフェクション前に、細胞は良好な状態にある必要があります。 3. 使い捨て手袋を装備し、BL-2 レベルで行動してください。
- 42. 13 AAV の収集と精製 トランスフェクション後約 72時間後、10cm プレートから細胞スクレーパーで細胞を収穫します。 細胞を 1,500g で 5 分間回転させて細胞ペレットを採取します。細胞ペレットを 0.5ml 溶解緩衝液(10 mM Tris-HCl(pH8.5)、150 mM NaCl)に再懸濁させます。上記細胞ペレットをドライアイス/エタノー ル浴および 37℃水浴で 3 回凍結・解凍して粗溶解液を得ることを特徴とする。 粗溶解液を 3,000 g で 10 分間回転させます。収穫された rAAV を含む上清分画を収集します。ウイル スを-80℃に保ちます。 特に明記されていない限り、すべての AAV ウイルスは、10℃の T70i ローター内で 350,000 g で 90 分間ヨージキスノール勾配超遠心分離で精製され、不純物の AAV 製剤から汚染物質を分離しま す。15%ヨージキスノール工程は、1M NaCl を添加すると、高分子間のイオン相互作用を不安定化させ るのに役立ちます。40%および 25%のステップは、空のカプシドを含む密度の低い汚染物質を除去す るために使用されます。前記 60%ステップは、ゲノム含有ウイリオンのクッションとして機能しま す。フル（ゲノムを含む）粒子を含むプレップは、勾配超遠心分離の数段階の後に濃縮されます。 AAV カプシドには VR1 82kDa、VR2 72kDa、VR3 62kDa が含まれており、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動（ページ）の後に銀染色またはクーマシーブルー染色の方法で検出することができます。Pure AAV は、図 3 に示すゲネメディで精製された次のウイルスなど、3 つの主要なタンパク質バンドのみを 表示する必要があります。当社は、さまざまなサービスに対して提供する仕様に基づいて、AAV ウイル スの純度を保証します。 図 3。精製された AAV ウイルスの純度。 AAV の価測定 AAV ウイルスは、ITR を標的としたプライマーを使用して、リアルタイムの定量的 PCR によって滴定 されます。アンプリコンは SYBR グリーンテクノロジーを使用して検出されます。次に、公知濃度のプ ラスミド試料の標準曲線と比較して滴定値を求めることを特徴とする。標準試料及び試験対象試料の Ct 値の例を表 7 に示し、標準曲線を図 4 に示す。
- 43. 14 表 7。典型的な絶対定量化プロセスにおける標準とサンプルの Ct値。 標準 コピー番号(vg/ml) Ct 値 1 Ct 値 2 Ct 値 3 標準_1 1010 4.51 4.32 4.42 標準_2 109 7.21 7.61 7.25 標準_3 108 10.97 10.55 10.67 標準_4 107 14.19 14.38 14.35 標準_5 106 17.75 17.58 17.68 AAV サンプル 12.78 12.65 12.81 図 4。絶対定量化における標準曲線。 各グループの平均 Ct 値を Y 軸とし、対応するグループの対数を X 軸とする。試験対象サンプルの平均 Ct 値を式に置き換え、X=7.45 を取得します。AAV ウイルス価計算式：10x × 40000 vg/ml=107.45 × 40000=1.1 × 1012 vg/ml に代えます。 AAV の細胞感染試験 AAV 価検出後、動物実験の前に感染活性を評価する必要があります。293T、CHO などの細胞に感染す ることによって標的遺伝子の発現をテストします。モイは 104~105 の範囲で制御されます（モイは感 染の多数、すなわち細胞に感染するために必要なウイルス粒子の数です）。
- 44. in vitro 細胞伝達の推奨プロトコル： 1.AAV ウイルスを氷の上に解凍します。 2. 細胞が良好な状態で伝達の準備ができているときに、moi 104 および 106 vg/細胞で細胞伝達を開始しま す。 3. ウイルス含有媒体で細胞を少なくとも 6~12 時間インキュベートします。感染時にウイルスを含む媒体を 交換する必要は 12 時間後までありません。標的遺伝子の発現には 3~7 日かかる場合があります。 4. 蛍光ラベルタンパク質をコードするパッケージ化された AAV であれば、ウイルス感染の効率は、伝達後 24 時間、48 時間、72 時間、および 96 時間に蛍光顕微鏡で観察することができる。 注意： AAV 感染は細胞型と血清型依存性であり、いくつかの一般的な細胞株の伝達効率を表 8 に示した。一般的 に、AAV はレンティウイルスやアデノウイルスと比較して細胞株に感染する能力が弱いため、in vitro 実験 には推奨されません。 表 8。異なる AAV 血清型間の伝達効率の比較。 細胞株 AAV1 AAV2 AAV3 AAV4 AAV5 AAV6 AAV8 AAV9 AAV-DJ AAV-DJ/8 うーん 7 13 100 2.5 0 0.1 10 0.7 0 500 0.2 ヘク 293 25 100 2.5 0.1 0.1 5 0.7 0.1 500 0.3 ヘラ；ヘラ；ヘ ラ 3 100 2 0.1 6.7 1 0.2 0.1 667 0.2 HepG2 3 100 16.7 0.3 1.7 5 0.3 ND；ND 1250 0.5 Hep1A 20 100 0.2 1 0.1 1 0.2 0 400 0.1 911 17 100 11 0.2 0.1 17 0.1 ND；ND 500 0 チョー；チョー 100 100 14 1.4 333 50 10 1 25000 5 コスのため 33 100 33 3.3 5 14 2 0.5 500 0.3 ミーウォー 10 100 20 0.3 6.7 10 1 0.2 2857 1 NIH3T3 10 100 2.9 2.9 0.3 10 0.3 ND；ND 500 0.1 A549 14 100 20 ND；ND 0.5 10 0.5 0.1 1000 0.1 HT1180 20 100 10 0.1 0.3 33 0.5 0.1 333 0.2 単球 1111 100 ND；ND ND；ND 125 1429 ND；ND ND；ND 100 ND；ND 未熟 DC 2500 100 ND；ND ND；ND 222 2857 ND；ND ND；ND 200 ND；ND 成熟 DC 2222 100 ND；ND ND；ND 333 3333 ND；ND ND；ND 100 ND；ND 15
- 45. 16 心臓、肝臓、腎臓、乳房、膵臓、卵巣、脳、目、骨格筋、脂肪組織などの正常な組織または臓器につい て、Genemedi は、マウスおよびラットの組織感染に対する対応する最適な AAV血清型、遺伝子送達方法、注射 量を体系的に整理します。表 9 AAV による動物実験 にリストされています。 表 9。特定の臓器における AAV 遺伝子送達方法。 感染器官 推奨血清型 注入経路 動物 注入量（μ l） 心臓 AAV9 その場での複数の点 ねずみ 10-15/ポイント、3-5 ポイ ント ねずみ 10-15/ポイント、3-5 ポイ ント 尾静脈 ねずみ 250（体重 200g） ねずみ 100 肝臓 AAV8 または AAV9 尾静脈 ねずみ 200（体重 200g） ねずみ 100 脳全体 AAV-PHP.eB 尾静脈 ねずみ 200（体重 200g） ねずみ 100 外側心室 AAV9 立体的な ねずみ 1-5 ねずみ 1-5 脳組織 AAV9 立体的な ねずみ 2-3 ねずみ 1-2 脂肪 AAV9 腹腔内の - 腹腔内脂肪 ねずみ 300 ねずみ 150-200 で~する 現場の；現場 注射 ・皮下脂肪 ねずみ 10-15/ポイント、3-5 ポイ ント ねずみ 10-15/ポイント、3-5 ポイ ント 骨格筋 AAV1 または AAV9 その場注射 ねずみ 10-15/ポイント、3-5 ポイ ント ねずみ 10-15/ポイント、3-5 ポイ ント 目 AAV2、AAV10、または AAV-DJ 硝子体室注射 ねずみ 3-5 ねずみ 1-3 網膜下空間注射 ねずみ 1-2 ねずみ 1-2 肺 AAV6 気管内注射 ねずみ 100（重量 200g） ねずみ 50-75 腎臓 AAV2 または AAV9 腎骨盤注射 ねずみ 10-15/ポイント、3-5 ポイ ント ねずみ 10-15/ポイント、3-5 ポイ ント 腸 AAV1 または AAV5 注腸 ねずみ 200（重量 200g） ねずみ 100
- 46. in vivo 遺伝子送達のための高度で安全なツールとして、AAVは最も優れた遺伝子治療ベクターとして 証明されています。特定の臓器にウイルス注射を行う方法は？4 種類の AAV 遺伝子送達方法について以 下のように完全に記述した。 尾静脈注射 感染部位：心臓、肝臓、全脳(AAV-PHP.eB) 1. 尾静脈注入のための装置にマウスを入れます(そのような装置がない場合は、50ml 遠心分離チューブ で改装することができます。装置全体を換気して固定する必要があります)。 2. マウスの尾を 70%アルコールで消毒します。尻尾を暖かく保つように注意してください。寒くすぎ ると血管が収縮します。 3. 左人差し指の親指でマウスの尾を握り、そっとまっすぐにしてから、人差し指を前方に動かし、尾を わずかに曲げます。曲げた場所に針を挿入し、AAV(インスリン針 27-30G、100 μ l/マウス)を注入で きます。 4. ゆっくり注射し、ウイルスが戻ってくるのを防ぐために 5〜10 秒間保持します。 5. 針を引き出してから、指または乾燥無菌綿ボールまたはガーゼで注射部位を数秒間押します。 図 5。尾静脈注射図。 肝門脈注射（肝臓に AAV の局所送達） 感染部位：肝臓 1. キシラジン/ケタミン混合物(10mg/kg、100mg/kg)(キシラジン/ケタミン、シグマアルドリッチ X1251、K2753)を皮下に注射してマウスを麻酔します。 2. 目の乾燥を防ぐために、マウスの目(Oculentum simplex、Teva Pharmachemie)に軟膏を塗ります。 3. マウスの腹部を調整して上向きにし、2 番目の肋骨と 4 番目の乳首の間の領域の髪を剃ります。この 工程は麻酔なしで 1 日前に操作することができます。 4. 脱毛部位を繰り返し消毒します。次に、肋骨から 4 番目の乳首の領域まで 3cm をメスで切ります。 乳腺、腸、肝臓などの他の組織を傷つけないように注意してください。 17
- 47. 18 5. 大腸や小腸などの内臓を無菌綿棒で慎重に引き出す。肝臓門脈が見えるまで、触れないようにガーゼ でそっと覆います。 6. 事前に32g の注射器にウイルスを吸引し、5 度未満の角度で肝臓の下約 1cm の距離で肝門脈に針を ゆっくりと挿入します。肝門脈に沿って 3~5mm を挿入します(門脈が見えにくい場合は、解剖学的鏡 によって識別できます)。 7. ゆっくりとウイルスを注射します。注射終了後、3〜5 秒間滞在してから針を分配し、綿棒でしばらく 軽く押します。次に、止血綿で肝門脈を覆い、綿棒で 5 分間軽く押して止血を助けます。止血が行われ ていることを確認してください。そうしないと、傷を押し続けます。 8. 止血綿を取り除きます（組織が止血綿にしっかりと取り付けられている場合は、無菌 PBS で湿らせる ことができます）。 9. 臓器をマウスの腹部にそっと戻します。4-0 ライン、約 10-15 針を使用して創傷を縫合します。 10. 痛みを和らげるために創傷部位に 100 μ l のブピバカイン(5mg/ml)を注入します。インスリン針 26G で無菌 pbs 500 μ l を皮下注入して水分補給を行った。手術全体に約 30 分かかりました。 11. 実験終了時に回復を容易にするために、マウスの体を十分に暖かく保つ必要があります(37 度暖房ラ ンプ、サーモスタットなど)。 脳立体定位 感染部位：脳 1. キシラジン/ケタミン混合物(10mg/kg、100mg/kg)(キシラジン/ケタミン、シグマアルドリッチ X1251、K2753)を皮下に注射してマウスを麻酔します。 2. マウスの頭と耳の間の髪を剃ってから、ステレオポジショナーの暖かいトレイの上に置きます。 3. 歯と耳の間の定規をゼロにします。目の乾燥を防ぐために、マウスの目(Oculentum simplex、Teva Pharmachemie)に軟膏を塗ります。 4. マウスの上切歯を固定プレートのスロットに固定して、頭部が固定されたままであることを確認しま す。同じ矢状線と水平面上でブレグマとラムマを調整します。マウスの鼻が中心で安定していることを 確認してください。 5. メスでマウスの頭の皮を剥がし、メスで表面をこすり落とします。血が流出した場合は、綿棒で乾か して、ブレグマとラムダの位置がはっきりと見えるようにしてください(概略的に加えて)。 6. ブレグマ座標(X、Y、Z=0)をゼロにし、ラムダ位置がブレグマと同じレベルにあることを確認しま す。 7. 前記目標脳領域に応じて前記座標を設定することを特徴とする。座標が固定されたら、頭蓋骨の穴を マークします。
- 48. 19 約 0.015mm を10 秒以内にマークで掘削します。脳組織が損傷しないように注意してください。 8. 注射器に AAV を吸い込み、前に設定した座標に従って挿入し、0.05〜0.1 μ l/min の速度でウイルス をゆっくり注入します。通常、各マウスは 0.05 μ l~2 μ l の体積で注入される。 9. 注射が完了したら 10 分間保管し、次に針をゆっくりと返します。 10. 手術中に血液が流出している場合は、綿棒を使用して時間内に血液を乾かします。 11. 最後のステップは頭皮を縫合することです。実験後の回復を容易にするために、マウスの体を十分 に暖かく保つ必要があります(37 度暖房ランプ、サーモスタットなど)。 胸腔内注射 感染部位：脊髄神経 1. キシラジン/ケタミン混合物(10mg/kg、100mg/kg)(キシラジン/ケタミン、シグマアルドリッチ X1251、K2753)を皮下に注射してマウスを麻酔します。 2. 目の乾燥を防ぐために、マウスの目(Oculentum simplex、Teva Pharmachemie)に軟膏を塗ります。 3. 針がどこに挿入されているかを確認するために、尻尾付近の皮膚の約 2cm2 で毛を取り除きます。 4. マウスを特別なラックに置き、体の下部に 15ml の遠心チューブを置き、針挿入部位をわずかにアー チさせます。 5. 30G の針で 25 μ l のハミルトンにウイルスを吸い込みます。 6. 背骨の L6（最も目立つもの）を配置し、指でそっと押して滑らかにします。 7. L5 椎骨と L6 椎骨の間の溝に注意深く針を挿入します。マウスの尾がわずかに上がっていることに注 意してください。これは、針がミエリンシースに正常に挿入されたことを示しています。 8. 挿入に成功したら、片手で針を固定し、もう片手で 5〜10 μ l のウイルスをゆっくり注入します。注 入量は適切である必要があり、体積が小さいと実験誤差が増加し、体積が大きいと腸内圧力が増加する ことに注意してください。 9. 必要に応じて、24 時間後に注射を繰り返します。 10. 実験後は、回復を容易にするためにマウスの体を十分に暖かく保つ必要があります (37 度暖房ラン プ、サーモスタットなど)。 11. 以前に報告されたように、1 ポイントあたり 1 μ l で 8 ポイントを注入した方が良いでしょう。異な る深さの 2 つの断面と、断面線上の 4 点を選択します。模式図を図 6 に示しています。
- 49. 20 図 6。複数点 insitu 注射の模式図。 さらに、Genemedi は正常な組織や臓器の注射ビデオも整理しています。お問い合わせへようこそ。 通常、ウイルス注射以来、凍結切片、パラフィン切片、qPCR または WB によって標的遺伝子を in vivo で検出するまでに少なくとも 3 週間かかります。一般的に、組織 in situ 注射の場合、AAV を GFP また は RFP で標識すると、注射後 3~4 週間以降、注射部位の蛍光顕微鏡でウイルス感染の効率を観察する ことができる。 事例共有 ケース 1。AAV 肝臓伝達 図 7。マウス肝臓における AAV9-GFP の選択された伝達結果。 ウイルスと価数：AAV-pTBG-Luc、1.4 × 1012 vg/ml 動物：マウス、C57、2 ヶ月 遺伝子送達方法：尾静脈、100 μ l 決定アッセイ：感染後 3 週間、凍結切片、免疫蛍光顕微鏡、in vivo イメージング結論：AAV-pTBG-Luc の静脈内注射は肝臓細胞のみに感染し、非特異的感染はありません
- 50. 21 図 8。ラットの心臓(a、B、C)およびマウスの心臓(D)における AAV9-GFPの選択された伝達結果。 ウイルスと価数：AAV9-GFP、1 × 1012 vg/ml 動物：ラット、SD、2 か月(図 8A、B、C);マウス、C57、8 か月(図 8D)感染部 位：心臓 遺伝子送達方法：心筋 in situ 注射、10 μ l/部位、合計 5 部位(図 8A、B、C)。 ケース 2。AAV 心臓伝達 眼窩 内静脈内注射（図 8D） 決定アッセイ：感染後 3 週間、凍結切片、免疫蛍光顕微鏡 ケース 3。AAV 肺伝達 図 9。マウス肺における AAV9-GFP の選択された伝達結果。 ウイルスと価数：AAV9-GFP、1 × 1012 vg/ml 動物：ラット、SD、2 ヶ月 感染部位：肺 遺伝子送達方法：気管注射、10 μ l/部位、計 5 部位 決定アッセイ：感染後 3 週間、凍結切片、免疫蛍光顕微鏡 ケース 4。AAV 脳伝達 図 10。マウス脳における AAV9-GFP の選択された伝達結果。 ウイルスと価数：AAV9-GFP、1 × 1012 vg/ml
- 51. 22 動物：マウス、C57、2 か月感染部 位：脳 遺伝子送達方法：脳局在注射、1 μl 決定アッセイ：感染後 3 週間、凍結切片、免疫蛍光顕微鏡 ケース 5。AAV 海馬伝達 図 11。マウス海馬における AAV2-GFP の選択された伝達結果。 ウイルスと価数：AAV9-GFAP-GFP、1 × 1012 vg/ml 動物：マウス、C57、2 ヶ月 感染部位：海馬 遺伝子送達方法：脳局在注射、1 μ l 測定方法：感染後 3 週間、全量、免疫蛍光顕微鏡 ケース 6。AAV 網膜伝達 図 12。マウス網膜における AAV2-GFP の選択された伝達結果。 ウイルスと価数：AAV2-GFP、1 × 1012 vg/ml 動物：マウス、C57、2 ヶ月 感染部位：網膜 遺伝子送達方法：網膜下腔注射、3 μ l 測定方法：感染後 3 週間、全量、免疫蛍光顕微鏡
- 52. 23 ケース 7。AAV 骨格筋伝達 図13。マウス骨格筋における AAV2-GFP の選択された伝達結果。 ウイルスと価数：AAV9-Luc、AAV9-GFP、1 × 1012 vg/ml 動物：マウス、C57、2 か月感染部 位：骨格筋 遺伝子送達方法：筋肉 in situ 注射、10 μ l/部位、計 4 部位 決定アッセイ：感染後 4 週間、in vivo イメージング、冷凍切片、免疫蛍光顕微鏡 ケース 8。AAV 腎臓伝達 図 14。マウス筋肉における AAV2-GFP の選択された伝達結果。 ウイルスと価数：AAV9-GFP、DJ-GFP、1 × 1012 vg/ml 動物：マウス、C57、2 ヶ月 感染部位：腎臓 遺伝子送達方法：腎臓への多部位注射 10 μ l/部位、合計 6 部位決定アッセイ： 感染後 3 週間、冷凍切片、免疫蛍光顕微鏡
- 53. 24 ケース 9。AAV 乳房伝達 図15。マウス筋肉における AAV2-GFP の選択された伝達結果。 ウイルスと価数：AAV9-GFP、1 × 1012 vg/ml 動物：マウス、C57、2 ヶ月 感染部位：乳房脂肪パッド 遺伝子送達方法：乳房注射、10 μ l/部位、計 4 部位 決定アッセイ：感染後 3 週間、凍結切片、免疫蛍光顕微鏡 ケース 10。AAV 腫瘍伝達 図 16。腫瘍における AAV-DJ/9-GFP の選択された伝達結果。 ウイルスと価数：AAV-DJ/9-GFP、1 × 1012 vg/ml 動物：ヌードマウス、2 か月 感染部位：腸がん細胞皮下移植遺伝子送達方法：腫瘍注 射、10 μ l/部位、計 4 部位 決定アッセイ：感染後 3 週間、凍結切片、免疫蛍光顕微鏡
- 54. 25 ケース 11。in vitroaav 伝達 図 17。in vitro で選択された AAV の伝達結果 ウイルスと価数：AAV1/6/8/Rh10/DJ/9-GFP、1 × 1012 vg/ml 細胞：HEK-293T モイ：モイ=1 × 104 測定方法：感染後 36 時間、免疫蛍光顕微鏡 参照 1. アチソン RW、BC カストと WM ハモン。(1965).アデノウイルス関連の欠陥ウイルス粒子。科学 149：754-6。 2. ホッガン MD、NR ブラックロウ、WP ロウ。(1966).さまざまなアデノウイルス製剤に含まれる小さな DNA ウイルスの研究：物理的、生物 学的、および免疫学的特性。Proc Natl Acad Sci U S A 55：1467-74。 3. ワイツマン MD と RM リンデン。(2011).アデノ関連ウイルス生物学。メソッド Mol Biol 807：1-23。 4. Schmidt M、A Voutetakis、S Afione、C Zheng、D Mandikian、JA Chiorini。(2008).アデノ関連ウイルスタイプ 12(AAV12)：シアル 酸およびヘパラン硫酸プロテオグリカンに依存しない伝達活性を持つ新しい AAV 血清型。J Virol 82：1399-406。 5. Gao G、LH Vandenberghe、MR Alvira、Y Lu、R Calcedo、X Zhou、JM Wilson。(2004).アデノ関連ウイルスのクラードはヒトの組織 に広く拡散しています。J Virol 78：6381-8。 6. ヴァンデンバーゲ LH、JM ウィルソン、G ガオ。(2009).遺伝子治療用に AAV ベクターカプシドを調整します。遺伝子 16：311-9。 7. ウズ、アソカンと RJ サムルスキー。(2006).アデノ関連ウイルス血清型：ヒト遺伝子治療のためのベクターツールキット。Mol Ther 14： 316-27。 8. ハウク・ブ、ル・チェン、W・シャオ。(2003).キメラ組換え AAV ベクターの生成と特性評価。モルサー 7：419-25。 9. ラビノウィッツ・ジェ、デ・ボウルズ、SM ファウスト、JG レッドフォード、セ・カニンガム、RJ・サムルスキー。(2004).ウイリオンの クロスドレッシング：アデノ関連ウイルス血清型のトランスカプシデーションは機能的にサブグループを定義します。J Virol 78：4421-32。 10. チョイ・VW、DM・マッカーティ、RJ・サムルスキ。(2005).AAV ハイブリッド血清型：遺伝子送達のための改良されたベクター。Curr Gene Ther 5：299-310。 11. デイトン RD、MS Grames、RL Klein。(2018).ラットへのより拡大的な遺伝子移行 CNS：AAV PHP.EB ベクター線量応答と AAV PHP.B との比較。遺伝子 Ther 25：392-400。 12. Du X、H Hao、Y Yang、S Huang、C Wang、S Gigout、R Ramli、X Li、E Jaworska、I Edwards、J Deuchars、Y Yanagawa、J Qi、B Guan、DB Jaffe、H Zhang、and N Gamper。(2017).感覚神経節内の局所的なガバーン性シグナル伝達は、末梢の傷害感受性伝達を 制御します。J Clin Invest 127：1741-1756。 13. Feng D、B Wang、L Wang、N アブラハム、K Tao、L Huang、W Shi、Y Dong、Y Qu。(2017).虚血前のメラトニン治療は、PERK お よび IRE1 シグナリングを介して内細胞網ストレス依存性オートファジーを阻害することにより、虚血性脳卒中後の急性神経損傷を軽減しまし た。J 松果体の解像度 62。 14. Li C、W Sun、C Gu、Z Yang、N Quan、J Yang、Z Shi、L Yu、H Ma。(2018).慢性疼痛関連心筋虚血感受性における治療介入のために ALDH2 をターゲットにする。テラノスティクス 8：1027-1041。
- 55. 26 15. Li L、BLi、M Li、C Niu、G Wang、T Li、E Krol、W Jin、JR Speakman。(2017).茶色の脂肪細胞は、in vivo で乳腺基底筋上皮細胞の 表現型を示すことができます。Mol メタブ 6：1198-1211。 16. Li S、X Dou、H Ning、Q Song、W Wei、X Zhang、C Shen、J Li、C Sun、Z Song。(2017).シルチュイン 3 は、脂肪毒性に対する肝 細胞の感受性を決定するオートファジーの負の調節因子として機能します。肝疾患 66：936-952。 17. ウェイ・イ、Y・チェン、Y・チュー、H・Zhao、G・リュー、Y・チャン、Q・メン、G・ウ、Y・チェン、X・カイ、H・ワン、H・イ ン、B・Zhou、M・リュー、D・リ、Q・ディング。(2016).CRISPR/Cas9 を介したミオスタチンの In vivo 破壊による筋肉の浪費の予 防。Mol Ther 24：1889-1891。 18. Wu X、X Wu、Y Ma、F Shao、Y Tan、T Tan、L Gu、Y Zhou、B Sun、Y Sun、X Wu、Q Xu。(2016).カグ結合タンパク質 1 は、HSC 活性化と肝臓の線維形成を調節します。ナットコミュン 7：13498。 19. 陽 H、J 陽、W Xi、S Hao、b lo、X He、L Zhu、H Lou、YQ Yu、F Xu、S Duan、および H Wang。(2016).後背筋間ニューロンサブタ イプは、嗅覚キューによって誘発された先天的恐怖を反対に調節します。ナット神経科学 19：283-9。 20. Yuan Y、Y Zheng、X Zhang、Y Chen、X Wu、J Wu、Z Shen、L Jiang、L Wang、W Yang、j lo、Z Qin、W Hu、and Z Chen。 (2017).BNIP3L/NIX 媒介マイトファジーは、PARK2 とは無関係に虚血性脳損傷から保護します。オートファジー 13：1754-1766。 21. 張 X、Y Yuan、L Jiang、J Zhang、J Gao、Z Shen、Y Zheng、T Deng、H Yan、W Li、WW Hou、J Lu、Y Shen、H Dai、WW Hu、Z Zhang、and Z Chen。(2014).チュニカマイシンとタプシガルギンによって誘発される内質網ストレスは、一過性虚血性脳損傷から保護しま す：PARK2 依存性マイトファジーの関与。オートファジー 10：1801-13。 22. Yuan YP、ZG Ma、X Zhang、SC Xu、XF Zeng、Z Yang、W Deng、QZ Tang。(2018).CTRP3 は、Sirt1 の活性化を介してドキソル ビシンによって誘発される心臓機能障害、炎症、細胞死から保護されます。J Mol 細胞カルディオール 114：38-47。 23. Shi TY、SF Feng、MX Wei、Y Huang、G Liu、HT Wu、YX Zhang、WX Zhou。(2018).カイネート受容体を介した島粒皮質のシナプ ス前 LTP は、マウスの恐怖と不安に寄与します。神経薬理学 128：388-400。 24. Lu NN、C Tan、NH Sun、LX Shao、XX Liu、YP Gao、RR Tao、Q Jiang、CK Wang、JY Huang、K Zhao、GF Wang、ZR Liu、K Fukunaga、YM Lu、F Han。(2018).コリン作動性 Grb2 関連結合タンパク質 1 は認知機能を調節します。大脳皮質 28：2391-2404。 25. Li C、D Huang、J Tang、M Chen、Q Lu、H Li、M Zhang、B Xu、J Mao。(2018).ClC-3 塩化チャネルは、イソプレナリンによる心臓 肥大に関与しています。遺伝子 642：335-342。 26. ファン C、X Zhu、Q Song、P Wang、Z Liu、SY Yu。(2018).MiR-134 は、ラットにおける Limk1/cofilin シグナル伝達のダウン調節を 介して、慢性的なストレス誘発構造可塑性とうつ病のような行動を調節します。神経薬理学 131：364-376。 27. マイ、リユー、パン、スガオ、W チェン、X チャン、W ドン、J リ、R 州、L ファン、イハン、L バイ、L チャン、L チャン。 (2017).CRISPR/Cas9 を介した Rosa26 遺伝子座のターゲティングは、Cre-loxP を介した系統追跡をモニタリングするための crereporter ラット株を生成します。2 月 J 284：3262-3277。 28. リュー×、F ティアン、S ワン、F ワン、L シオン。(2017).アストロサイトオートファジーフラックスは、酸素グルコース欠乏や虚血/再灌 流損傷からニューロンを保護します。若返りレズ。 29. リアン J、L Li、Y Sun、W He、X Wang、Q Su。(2017).ラットの冠状動脈微塞栓術後の心筋細胞アポトーシスに対する Nrf2/HO-1 シグ ナル伝達経路を活性化することの保護効果。BMC 心臓血管障害 17：272。 30. He Y、S Pan、M Xu、R He、W Huang、P Song、J Huang、HT Zhang、Y Hu。(2017).アデノ関連ウイルス 9 媒介 Cdk5 阻害ペプチド は、アルツハイマー病マウスモデルにおける病理学的変化と行動欠陥を逆転させます。FASEB J 31：3383-3392。 31. ドゥアン・ナン、XJ・リュー、J・ウ。(2017).パルミチン酸は、炎症体とハリネズミシグナル伝達を通じて肝星状細胞の活性化を引き起こし ます。ライフサイエンス 176：42-53。 32. Du D、L Hu、J Wu、Q Wu、W Cheng、Y Guo、R Guan、Y Wang、X Chen、X Yan、D Zhu、J Wang、S Zhang、Y Guo、and C Xia。(2017).神経炎症は、ストレス誘発性高血圧ラットの立体腹側髄のニューロンにおけるオートファジーフラックス閉塞に寄与します。J 神 経炎症 14：169。 33. Bai J、XJ Yu、KL Liu、FF Wang、GX Jing、HB Li、Y Zhang、CJ Huo、X Li、HL Gao、J Qi、YM Kang。(2017).tert-ブチルヒドロキ ノンの中央投与は、高血圧ラットの視床下部心室外核における Nrf2 シグナル伝達を調節することにより、高血圧を減衰させます。トキシコー ルアプリファーマコール 333：100-109。 34. Lei S、RZ Sun、D Wang、MZ Gong、XP Su、F Yi、ZW Peng。(2016).LRPPRC による酸化リン酸化による肝脂肪酸の取り込みと酸化 の増加は、血中脂質レベルを低下させます。フロントフィジオール 7：270。
- 56. 27 連絡先情報 ジェネメディバイオテクノロジー。株式会社。 aav の詳細については、www.genemedi.net/i/aav-packaging をご覧ください。 genemedi製品の詳細および PDF 形式のマニュアルをダウンロードするには、当社の web サイト： www.genemedi.net をご覧ください。 追加情報または技術支援については、お電話またはメールでお問い合わせください。 世界中で：86-21- 50478399 ファックス： 86-21-50478399 電子メール：support@genemedi.net ©2018 ジェネメディバイオテクノロジー。株式会社全著作権所有。 関連製品 1. AAV 包装システム 詳細は、https://www.genemedi.net/i/aav-vector-system をご覧ください。 2. AAV Promise-ORFTM： AAV および哺乳類の発現ベクターにおける配列検証された CDNA クロー ン。詳細は、https://www.genemedi.net/i/virus-plasmid をご覧くださ い。 3. AAV カスタム生産 詳細は、https://www.genemedi.net/i/adeno-associated-virus-aav-customized-production-service をご覧ください。
- 57. About GeneMedi GeneMedi specializesin creating superior antibody, protein, and vector-based bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions. At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of unparalleled expertise in the following areas: Innovative Antigen Design and Robust Assay Development Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical and research settings. Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUSTM for accelerated antibody discovery and LIBRATM for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize molecules with optimal stability and functionality. Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXTTM platform is our answer to the industry's need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking gene therapy approaches. High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent quality controls. Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification techniques to guarantee vector efficacy and integrity Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic accuracy. Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry. Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability Scalable Production and Uncompromising Quality Comprehensive Solutions for Diverse Application Needs GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner. Website: https://www.genemedi.net Contact Email: support@genemedi.net | sales@genemedi.net
- 58. Protocols Library: Gene Therapy Biologics GENEMEDI nnovati ion forTherapeutics&Diagnostics Industry DiagnosticsTarMart Click to download. Table of Content 사용 설명서 아데노연관 바이러스 (AAV) s Storage and Diutionof AAV………………………………………………………………………2 Introductionof AAV……………………………………………………………………………… Table ofContents………………………………………………………………………………1 SafeUse of AAV…………………………………………………………………… …………… ……………2 3 Advantages of AAV forGeneDelveryand Expression………………………………………………3 AAVSerotypes andNative Tropism-AAV Seledion Guide…………………………………………………4 AAV Product, Service and Information ofVector,Listof Goods inStockofGenemedi……………………6 ProductandService tem ofGenemedi AAV………………………………………………………………6 ProductCharacterofGenemedi AAV… …………………… … …… …………………………… …… … …6 Listof MainGenemedi AAVVectorand Goods in Stock……………………………………………………7 Overall ExperimentProcedureofAAVProduction………………………………………………………10 Experimental Materials………………………………………………………………………………………11 Vector ConstructionofAAV…………………………………………………………………………………12 Packagingof AAV………………………………………………………………………………12 Collection and Purificationof AAV…………………………………………………………………………13 TiterDetectionof AAV………………………… ……………………………………………………13 Cell InfectionTestofAAV………………………… …………………………………………………14 AnimalExperimentwithAAV………………………………………………………………………………16 TailVein Injedion………………………… ………………………………………… ……………………17 Hepafic Portal Vein Injection (localdelveryof AAVinliver)……………………………………………17 Brain Stereotacic Posiioning…………………………………………………………………18 Inrathecal njection……………………………… …………………………………………………………19 Casesharing………………………………………………………………………………………………20 Case 1.AAVLiverTransduction……………………………………………………………………………20 Case2.AAVHeart Transducion………………………………………… …… ……………………………21 Case 3.AAV LungTransduction…………………………………………………………………………21 Case 4.AAV Brain Transduction……………………………………………………………………21 Case 5.AAV HippocampusTransduction………………………………………………………………22 Case6.AAV Retna Transducion………………………… ………………………………………………22 Case 7.AAVSkeletal Muscle Transdudtion………………………………………………………………23 Case 8.AAV Kidney Transduction………………………………………………………………………23 Case 9.AAV Breast Transducion………………………… ………………………………………………24 Case 10.AAVTumorTransduction………………………………………………………………………24 Case 11.AAVTransducion in vino……………………………………………………………25 References……………………………………………………………………………………………………25 1
- 59. 2 aav 의 안전한사용 1. aav 관련 실험은 생물 안전 2 급 시설(bl-2 급) 내에서 진행되어야 한다. 2. 실험실 코트, 마스크, 장갑을 완전히 갖추고 손과 팔을 노출하지 않도록 최선을 다해 주십시오. 3. 바이러스 현액을 뿌리지 않도록 조심하세요. 만약 생물 안전 캐비닛이 작동 중에 바이러스에 오염되면, 즉시 70% 알코올과 1% sds 를 포함한 용 4. 원심분리가 필요하다면 원심분리기 튜브를 단단히 밀봉해야 한다. 조건이 허용되면 원심분리하기 전에 파라필름으로 튜브를 밀봉합니다 액으로 탁자 보드를 닦아라. 모든 첨단, 튜브, 배양판, 바이러스와 접촉하는 매질은 폐기하기 전에 염소를 함유한 소독액에 담그어야 한다. . 5. aav 관련 동물 실험도 bl-2 수준에서 진행해야 한다. 6. aav 관련 폐기물은 처리하기 전에 특별히 수집하고 오토클레이션해야 한다. 7. 실험 후 세정제로 손을 씻어라. aav 의 저장 및 희석 aav 저장 바이러스는 수신 후에 사용하기 전에 짧은 시간 (일주일 미만)에 4 ° c 에서 저장될 수 있습니다. aav 바이러스는 얼음-해동에 민감하며, 얼음-해 동이 반복되면 적량이 떨어지기 때문에, aliquot 바이러스 재고는 도착하면 즉시 -80°C 냉동고에 보관되어 장기간 사용해야 한다. 만약 aav 바이 러스가 12 개월 이상 저장되어 있다면, 사용하기 전에 바이러스 적정을 재검사하는 것이 좋습니다. aav 희석 바이러스 희석이 필요하다면 바이러스를 얼음물에 용해시킨다. 용해한 후, 바이러스를 중간, 무균 pbs 또는 생리식염수 용액과 섞어, 4°C 에서 유 지하십시오 (일주일 이내에 사용하십시오). 주의사항 · aav 가 환경의 극단적인 환경(pH, edta 와 같은 킬레이트제, 온도, 유기용매, 단백질 변성제, 강한 세제 등)에 노출되는 것을 피합니다. · 소용돌이, 거품 불기 또는 유사한 작업 중에 aav 샘플에 공기를 도입하는 것을 피하십시오. 이는 단백질 변성을 초래할 수 있다. · 반복적인 냉동과 해동을 피하세요. · 액상에서 장기간 '일반적' 플라스틱(특히 폴리스티렌이나 소수성 플라스틱)에 노출되지 않도록 하십시오. 대부분의 aav 바이러스는 매우 끈적끈적 하며, 파이프, 세포 배양 판, 피켓 끝을 포함한 일반적인 플라스틱에 노출되면 손실이 발생할 수 있다. 냉동하지 않으면 Aav 를 실리콘화되거나 낮 은 단백질 결합관에 저장하는 것이 좋다. Pluronic f-68 은 0.01%-0.1%의 배합 완충기에서 사용되는 일반적인 플라스틱을 사용하는 경우 점착을 최소화합니다.
- 60. 3 · aav 를저염용액으로 희석시키는 것을 피한다. Aav2 와 같은 일부 aav 혈청형은 저염용액에 집결되어 전염 성이 없다. aav 도입 Genemedi 생물 과학에서 재조합 선과 관련된 바이러스(rAAV) 발현 시스템은 체외 및 체내에서 shrna, 인간 orf, crispr 를 전달하고 발현하는 데 사용된다. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 인간과 다른 영장류 종에 감염되는 작은 단일 스란드 dna 바이러스이다. 현재 aav 는 질병을 유발할 수 있다는 것을 알지 못하고 매우 가벼운 면역 반응만 유발한다. 파르보바이러스의 일원 으로서 야생형 aav 는 복제를 완료하기 위해 아데노바이러스나 헤르페스바이러스의 도움을 필요로 하는데, 이 것이 바로 아데노 관련 바이러스라고 불리는 이유[1,2]이다. 야생형 aav2 게놈은 바이러스 rep 유전자와 cap 유전자(각각 복제 유전자와 capside 유전자를 코딩)로 구성되어 있으며, 그 옆에는 복제 및 포장에 필요한 모 든 cis 작용 원소를 포함하는 역말 반복(ITRs)이 있다. 전형적인 aav2 의 게놈은 약 4800bp 이며, 두 개의 상 류 및 하류 개방 읽기 프레임(ORFs)으로 구성되어 있으며, 두 개의 반전 단말기 반복(ITR) 사이에 rep 와 cap 사이로 구성된다(그림 1). 상호 보완 dna 스란드의 합성은 itr 가 필요하며, rep 와 cap 는 aav 바이러스 주기 의 필수 단백질 rep78, Rep68, Rep52, rep40 및 포위된 단백질 vp1, VP2, VP3 등을 포함한 다양한 단백질 로 번역될 수 있다. [3] 현재의 재조합 aav(rAAV) 벡터는 itrs 사이의 모든 바이러스 게놈을 길이가 5 킬로베이스 미만의 전사 카세트 로 대체함으로써 생성된다. 그 후 결과된 구조물은 다른 두 개의 플라즈미드와 공동으로 발현된다: 1) 트랜스에 서 rep 유전자와 cap 유전자를 제공하는 aav-rc 플라즈미드, 2) 아데노바이러스 유전자를 보관하는 aav 유전 자 플라즈미드. aav-293 세포는 트랜스에서도 e1a 단백질을 제공하기 때문에 포장 세포라인으로 사용됩니다. rep 유전자와 cap 유전자를 수정함으로써 과학자들은 재조합 aav 감염을 특정 조직으로 유도하기 위해 혈청 유형을 제어할 수 있다. 이 3 플라즈드 공동 전염 시스템은 aav 생산 과정에서 아데노바이러스의 필요성을 해 방시켜 정화 과정을 크게 단순화한다. 지금까지 12 개의 aav 의 혈청 유형이 그것들의 독특한 특징과 열대성을 가지고 묘사되었다[4]. 높은 안전성, 낮은 면역 원성, 장기적인 외생 유전자의 발현에 관하여 aav 는 체내 유전자 기능 연구에 가장 좋은 유전자 전 달 도구로 여겨진다. 그림 1. aav2 게놈 구조의 구조도 유전자 전달 및 발현에 대한 aav 의 장점 1. 우수한 생물안전등급 aav 는 자연적으로 결함이 있는 바이러스로, 생산적인 감염을 위해 트랜스에서 몇 가지 요인을 제공해야 하며, 어떤 인간의 질병과도 관련이 없다. 우리의 aav 생산 시스템에서 aav2 itr 서열과 rep/cap 유전자는 동성이 부 족한 별도의 플라스미드에 존재하여 재조합 야생형 바이러스의 생성을 막는다. 이러한 특징들은 aav 에게 유전 자 전달과 바이러스 기원의 발현 매개체에서 우수한 생물 안전 등급을 제공한다.
- 61. 4 2. 광범위한 전염성 aav바이러스는 광범위한 포유류 세포에 감염되어 인간과 비인간의 단백질을 발현하는 데 성공적으로 사용되었다. 다른 바이러스 기원의 매개체와 대조적으로, aav 매개체는 면역 능력 숙주에서 유전자 발현에 능력이 있다는 것이 증명되었다. 3. 높은 적사 재조합 aav 는 이 프로토콜을 가진 ≥ 107 바이러스 입자/ml 의 높은 적사에서 생성될 수 있습니다. 농도가 발표된 후 최대 1013 개의 바이러스 입자/ml 에 달한다. 4. 감염은 숙주 세포를 적극적으로 분할할 필요가 없다 aav 는 분할된 세포와 분할되지 않은 세포를 모두 감염시킬 수 있다. 5. 장기 유전자 전달 잠재력 재조합 aav(rAAV)는 인체 세포에서 유지될 수 있어 장기적인 유전자 이전의 잠재력을 만들 수 있다. 대부분의 세포 집단에서 바이러스 게놈은 일반적으로 표염색체를 유지하며, 종종 느리게 분할되거나 분할되지 않는 세포에서 안정 적이며, 유전자의 장기적 이전과 발현을 이끌어낸다. 반면 세포 집단이 빠르게 분할되는 경우 aav 바이러스는 숙주 게놈에 통합될 수 있지만 concatemers 를 형성하지 않아 분할된 세포에서 유전자의 장기적 발현을 초래하지만 이 것은 드문 사건이다. Aav 의 극도로 높은 다수성 감염(MOI)을 사용하거나 야생형 아데노바이러스의 사용으로 공급 될 수 있는 아데노바이러스 복제효소의 존재에서 감염이 발생하는 경우, 통합은 더 자주 발생한다. 그러나 야생형 아 데노바이러스를 사용하여 통합 사건을 증가시키는 aav 시스템의 생물적 안전성을 감소시킬 것이다. aav 혈청형과 본토 열대주의-aav 선택 가이드 지난 수십 년 동안 많은 aav 혈청형이 변동적인 열대성을 가지고 있다는 것을 확인했다. 지금까지 12 개의 aav 혈청 형과 100 개가 넘는 aav 변종이 아데노바이러스 주식이나 인간/비인간 영장류 조직에서 분리되었다. 서로 다른 aav 혈청형은 서로 다른 열대성을 나타내며 서로 다른 세포 유형과 조직 유형에 감염된다. 따라서 적절한 aav 혈청형을 선택하는 것은 표적 세포나 조직에 유전자를 전달하는 데 매우 중요하다. raav 는 특정 세포나 조직 유형에 대한 자연 열대성의 전시로 인해 상당한 관심을 받았다. 인간과 다른 영장류에서 매우 유행하며, 몇 가지 aav 혈청형이 분리되었다. AAV2, AAV3, AAV5, aav6 은 인간 세포에서 발견되었고, aav1, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, aav12 는 비인간 영장류 샘플에서 발견되었다 [5,6]. 서로 다른 혈청 형 간의 게놈 분산은 바이러스 캡시드의 초변수 영역(HVRs)에 가장 집중되어 있으며, 이는 그 조직의 열대성을 결정 할 수 있다. 바이러스 카피드 외에도 aav 매개체의 조직 열대성은 세포 표면 수용체, 세포 흡수, 세포 내 가공, 매개 체 게놈의 핵 전달, 코팅 해제, 두 번째 사슬 DNA 전환에 의해 영향을 받는다. 표적 조직에 대한 aav 의 감염 효율성과 특이성을 더 잘 향상시키기 위해, 과학자들은 바이러스 캡시드를 유전자적 으로 개조하고, 혈청형 사이에 도메인이나 아미노산을 교환함으로써 모자이크 매개체를 생성하여 접합성 aav 를 만 들 수 있으며, 이는 연구자들이 특정 혈청형 세포를 특별히 표적하여 유전자를 효과적으로 전환하고 발현할 수 있게 할 수 있을 것이다. 동시에 aav 가 동물의 혈뇌 장벽을 관통하는 능력은 크게 제한되거나 향상된다. 전통적으로 aav 는 수술을 통해 뇌 조직에 주입할 수 있어야 중추신경계의 과학적 연구를 진행할 수 있어 실험의 난이도를 크게 높이고 실험 결과에 영 향을 미친다. 이제 php.b 와 php.eb 의 개선된 aav 혈청형은 혈액 뇌장벽을 통해 전 뇌를 감염시킬 수 있습니다.
- 62. 5 외주 혈액 주사[11]. 가장 인기있는 raav 혈청형과 그 열대성은 아래 표 1 에 나열되어 있다. 표 1. raav 혈청형과 그 열대성. aav 혈청형 조직 열대성 CNS 망막 폐 간 췌장 신장 심장 근육 AAV1 √ √ √ √ √ AAV2 √ √ √ AAV3 √ √ √ √ AAV4 √ √ √ AAV5 √ √ √ √ AAV6 √ √ √ √ √ AAV7 √ √ AAV8 √ √ √ √ AAV9 √ √ √ √ √ AAV-DJ √ √ √ √ AAV-DJ/8 √ √ √ AAV-Rh10 √ √ √ √ √ aav-빈티지 √ √ √ AAV-PHP.B √ √ √ AAV-PHP.eB √ √ AAV-PHP.S √ √ √
- 63. 6 매개체의 aav 제품,서비스 및 정보, genemedi 재고 상품 리스트 genemedi aav 제품 및 서비스 항목 · 아데노 관련 바이러스(AAV) 맞춤형 생산 서비스(표 2). · CRISPR/cas9 아데노 관련 바이러스(AAV) 생산 서비스. · 광유전학 선관련 바이러스(AAV) 생산 서비스(표 3 및 표 4). · aav-lc3 자가식용 흐름 검사를 위한 생산 서비스(표 5). · 사전 제작 아데노 관련 바이러스(AAV) 생산 서비스. · 아데노 관련 바이러스(AAV) 제어 바이러스 생산 서비스. genemedi aav 의 제품 특성 · 높은 효율성. aav 의 면역 원성은 매우 낮다. 바이러스의 적사량은 1014vg/ml 에 달하여 다양한 조직에 서 높은 감염 효율을 제공한다. · 장기적인 표현. 표적 유전자의 발현은 2 년 이상 유지될 수 있다. · 큰 혈청형 라이브러리. 11 개의 혈청형과 다양한 돌연변이 아형으로 aav 는 거의 모든 동물의 조직과 기 관에 효율적으로 감염할 수 있다. · 조직 열대성. 심장, 간, 근육 및 다양한 신경 조직 특이성 촉진제를 포함한 다양한 세포/조직에 대해 많은 조직 특이성 촉진제를 사용할 수 있습니다. · 높은 품질. 모든 바이러스 제품은 무균, 비나이코플라즈마, 비내독소를 포함하여 엄격한 검사를 받는다.
- 64. 7 주요 genemedi aav매개체와 재고 상품 목록 표 2. aav 벡터 목록 (심장, 간, 근육 등 일부 조직 특이성 촉진제는 표에 열거되지 않았으니 문의를 환영합니다.) 유형 aav 플라스미드 추진자 표현 특성 형광 라벨 주석 과도한 표현 pAAV-CMV-MCS-T2A- ZsGreen CMV 일반적이고 강하다 ZsGreen pAAV-CMV-MCS-EF1- ZsGreen CMV 일반적이고 강하다 ZsGreen pAAV-CAG-MCS-T2A- ZsGreen 카그 일반적이고 강하다 ZsGreen pAAV-CAG-MCS-T2A- mCherry 카그 일반적이고 강하다 mCherry pAAV-CAG-DIO-MCS- T2A-ZsGreen 카그 일반적이고 강하다 ZsGreen cre 종속 표 현식 pAAV-CAG-DIO-MCS- T2A-mCherry 카그 일반적이고 강하다 mCherry cre 종속 표 현식 pAAV-hsyn-MCS-T2A- ZsGreen hSyn 뉴런특이성 ZsGreen pAAV-hsyn-MCS-T2A- mCherry hSyn 뉴런특이성 mCherry pAAV-CamkII-MCS-T2A- ZsGreen 캄키 뉴런특이성 ZsGreen pAAV-CamkII-MCS-T2A- mCherry 캄키 뉴런특이성 mCherry pAAV-GFAP-T2A-EGFP GFAP 성형세포 특이성 EGFP 하향 조정 pAAV-U6-MCS-CMV- ZsGreen U6 일반적이고 강하다 ZsGreen pAAV-U6-CMV-mCherry U6 일반적이고 강하다 mCherry circrna 과표 현 pAAV-CMV-crRNA-EF1- ZsGreen CMV 일반적이고 강하다 ZsGreen 토너먼트 pAAV-gRNA-saCas9 U6 일반적이고 강하다 없음
- 65. 8 표 3. aav의 광유전학 도구 목록. aav 플라스미드 촉진자 및 표현 특성 형광 라벨 크레에 의존하다 광유전학 효 과 pAAV-CAG-DIO-eNpHR3.0-EYFP 카그 (일반적이고 강한 표현) EYFP 그래 억제 paav-cag-dio-hchr2(H134R)-mCherry mCherry 그래 활성화 pAAV-CAG-DIO-ArchT-EYFP EYFP 그래 억제 paav-cag-dio-c1v1(t/t)-TS-mCherry mCherry 그래 활성화 pAAV-CAG-DIO-Arch3.0-EYFP EYFP 그래 억제 paav-cag-dio-hcheta-eyfp EYFP 그래 활성화 pAAV-CMV-DIO-eNpHR3.0-EYFP CMV (일반적이고 강한 표현) EYFP 그래 억제 pAAV-CMV-DIO-hChR2 (H134R)- mCherry mCherry 그래 활성화 pAAV-CMV-DIO-ArchT-EYFP EYFP 그래 억제 pAAV-CMV-DIO-C1V1(t/t)-TS- mCherry mCherry 그래 활성화 pAAV-CMV-DIO-Arch3.0-EYFP EYFP 그래 억제 pAAV-CMV-DIO-hCHETA-EYFP EYFP 그래 활성화 pAAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFP hSyn (뉴런 특이적 압박) EYFP 아니요 억제 pAAV-hSyn-hChR2 (H134R)-mCherry mCherry 아니요 활성화 pAAV-hSyn-ArchT-EYFP EYFP 아니요 억제 pAAV-hSyn-C1V1-(t/t) -TS-mCherry mCherry 아니요 활성화 pAAV-hSyn-Arch3.0-EYFP EYFP 아니요 억제 pAAV-hSyn-DIO-hCHETA-EYFP EYFP 그래 활성화 pAAV-GFAP-eNpHR3.0-EYFP GFAP (성형세포 특이성 발현) EYFP 아니요 억제 pAAV-GFAP-hChR2 (H134R)-mCherry mCherry 아니요 활성화 pAAV-GFAP-ArchT-EYFP EYFP 아니요 억제 pAAV-GFAP-C1V1 (t/t) -TS-mCherry mCherry 아니요 활성화 pAAV-GFAP-Arch3.0-EYFP EYFP 아니요 억제 pAAV-GFAP-hCHETA-EYFP EYFP 아니요 활성화 pAAV-CaMKII-eNpHR3.0-EYFP 캄키 (뉴런 특이성 발현) EYFP 아니요 억제 pAAV-CaMKII-hChR2 (H134R)- mCherry mCherry 아니요 활성화 pAAV-CaMKII-ArchT-EYFP EYFP 아니요 억제 pAAV-CaMKII-C1V1 (t/t) -TS-mCherry mCherry 아니요 활성화 pAAV-CaMKII-Arch3.0-EYFP EYFP 아니요 억제 pAAV-CaMKII-hCHETA-EYFP EYFP 아니요 활성화
- 66. 9 표 4. aav의 화학 유전학 도구 목록. aav 플라스미드 촉진자 및 표현 특성 형광 라벨 크레에 의존하다 광유전학 효과 pAAV-CAG-DIO-DTR-2A-GFP 카그 (일반적이고 강한 표현) EGFP 그래 pAAV-hSyn-DTR-2A-GFP hSyn (뉴런 특이성 발현) GFP 아니요 pAAV-CaMKII-DTR-2A-GFP 캄키 (뉴런의 특이성 발현 EGFP 아니요 pAAV-CAG-DIO-hM3D(Gq)- mCherry 카그 (일반적이고 강한 표현) mCherry 그래 Gq-DREADD pAAV-CAG-DIO-hM4D(Gi)- mCherry 카그 (일반적이고 강한 표현) mCherry 그래 지-드레아드 pAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)- mCherry hSyn (뉴런 특이성 발현) mCherry 그래 Gq-DREADD pAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)- mCherry hSyn (뉴런 특이성 발현) mCherry 그래 지-드레아드 pAAV-hSyn-hM3D(Gq)- mCherry hSyn (뉴런 특이성 발현) mCherry 아니요 Gq-DREADD pAAV-hSyn-hM4D(Gi)- mCherry hSyn (뉴런특이성 발현) mCherry 아니요 지-드레아드 pAAV-CaMKII-hM3D(Gq)- mCherry 캄키 (뉴런 특이성 발현) mCherry 아니요 Gq-DREADD pAAV-CaMKII-hM4D(Gi)- mCherry 캄키 (뉴런 특이성 발현) mCherry 아니요 지-드레아드
- 67. 10 표 5. aav를 사용한 자가식용 흐름 모니터링 도구 목록 유형 aav 플라스미드 촉진자 및 표현 특성 형광 라벨 이중 레이블 pAAV-mRFP-GFP-LC3 cmv 일반과 강한 표현 mRFP + GFP 단일 레이블 pAAV-GFP-LC3 cmv 일반과 강한 표현 GFP aav 생산 전체 실험 절차 재조합 aav 생산에 대한 구조적 개요는 그림 2 와 같다. 첫 번째 단계는 관심 유전자(GOI)를 적절한 질체 매개체로 복제하는 것이다. 대부분의 응용 프로그램의 경우 관심 있는 cdna 는 벡터를 포함하는 itr/mcs 중 하나로 복제됩니다(표 2). 이러한 벡터에 존재하는 반전 단말기 반복(ITR) 서열은 aav 복제 및 포장에 필요한 모든 cis 작용 요소를 제공한다. 재조합 발현 질립은 aav-293 세포에 아데노바이러스 유전 유전자를 가진 phelper 와 aav-rc(aav2 복제 및 capsid 유전자를 가진 paav-rc)와 함께 전염되어 aav-293 세포의 aav 의 복제 및 포장에 필요한 모든 트랜스작용 인자를 공급한다. 재조합 aav 바이러스 입자는 감염된 aav-293 세포에서 제조되어 다양한 포 유류 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있다. 숙주 세포가 감염되면, 유전자 발현을 위해 단일 바이러스는 이중 바이러스로 전환되어야 한다. aav 바이 러스는 상호 보완 사슬을 합성하기 위해 세포 복제 인자에 의존한다. 이러한 전환은 재조합 유전자 발현의 제한적인 단계이며, 아데노바이러스 중복 감염이나 캠프테신이나 부티산나트륨과 같은 에토포시드를 사 용하여 가속화될 수 있다. 그러나 이러한 약제들은 표적 세포에 독성이 있으며, 세포에 남기면 표적 세포 를 죽일 수 있기 때문에 에토포시드의 사용은 단기간 사용이나 바이러스 적사를 얻을 때 권장된다. 일반적 으로 aav 게놈은 세포의 안정적인 유전자 발현을 위한 고분자량의 concatemer 를 형성한다.
- 68. 11 그림 2. aav포장 실험 흐름도. 실험 재료 aav 시스템에는 관심 유전자(GOI), 즉 paav-GOI, 포장 플라즈드 paav-rc 및 phelper 가 포함되어 있다. Paav-goi 의 정보는 표 2-5 에서 참조할 수 있고, 플라즈미드 지도 프로파일은 www.genemedi.net 에서 참조할 수 있다. · 세균주: 대장균주 stbl3 은 aav 매개체를 증폭시키고 플라스미드를 포장하는 데 사용된다. · 세포 라인: aav 포장 세포 aav-293; 매질: 페니실린-스트립토마이신과 10% FBS 가 포함된 dmem. 실 험의 안정성과 연속성을 보장하기 위해서는 충분한 aav-293 세포를 대수상에서 백업 세포 은행으로 동결 하는 것이 가장 좋다. 알림: 만약 세포계가 바이코플라즈마에 오염되면, 더 나은 배양 세포 상태에 도달하기 위해, 우리는 genemedi 항바이코플라즈마 시약 cureplasmatm 의 사용을 권장한다.
- 69. 12 aav 의 벡터구성 aav 포장하기 전에, 관심 있는 유전자는 표 2 에 열거된 itr 을 함유한 플라스미드의 매개체에 구축되어야 한다. genemedi 는 또한 다양한 aav 매개체에 대체 촉진제와 형광 라벨을 제공한다. 조직 특이성 촉진자 또는 조건부 의존성 조절 요소(예: cre-의존성 flex/DIO, tet-on)를 사용자 정의하는 매개체도 가능하다. 동시에 genemedi 는 광유전학, dradds, lc3 표시 자가식용 흐름 검사 등과 같은 유전자 도구를 가지고 있는 많은 사전 제작된 aav 매개체 상품을 보유하고 있다(자세한 내용은 표 2-5 를 참조하십시오). 참고: 벡터를 신속하고 효율적으로 구축하기 위해 genemedi-cloneasytm 1 단계 복제 키트(cat.gm-gc- 01/02/03)를 사용하는 것이 강력하다. aav 포장 dmem 에서 aav-293 세포를 10% fbs 및 1% pen/strep 으로 전파합니다. 전염되기 전날, 세포가 다음 날 70-80%의 합류에 도달하도록 10cm 접시에 세포를 접시한다. 전염당일, 3-플라스미드 공동전염을 표 6 로 설정한다. 표 6. aav 생산에서 표준 10cm 접시의 전염에 필요한 플라즈 미드 및 전염제. 구성 요소 금액 pAAV-RC 10μg 펠퍼 20μg 파브 고이 10μg 지방 제품 100μl dmem 는 물욕과 37 ℃까지 사전 가열되어야 합니다. lipogenetm 전염 시약은 사용하기 전에 실온까지 따뜻하게 해야 하며, 사용하기 전에 가볍게 섞어야 한다. 10cm 접시의 전염 매체를 전염 후 6 시간 동안 신선한 매체로 교체한다. 참고: 1. lipogenetm 전염 시약은 genmedi 에서 나온 것입니다. 전염 과정에서 lipogenetm 매뉴얼을 참조하십 시오. 2. 전염되기 전에 세포는 좋은 상태에 있어야 한다. 3. 일회용 장갑을 장착하고 bl-2 등급으로 행동하십시오.
- 70. 13 aav 의 수집및 정화 전염 후 약 72 시간, 세포 스크레이퍼로 10cm 판에서 세포를 수확한다. 세포 펠릿을 수집하기 위해 5 분 동안 1,500 g 에서 세포를 회전합니다. 세포 알갱이를 0.5ml 분해 완충 기(10mm tris-hcl(pH8.5), 150mm nacl)에 다시 부유시킨다. 세포 펠릿을 드라이 아이스/에탄올 욕조 와 37 ° c 수욕조를 통해 3 회 동결/해동시키고 조분해액을 얻는다. 조분해액을 3,000g 로 10 분 동안 회전하세요. 수확한 raav 를 포함한 상청액 부분을 수집합니다. 바이러 스를 -80℃에 유지하십시오. 별도의 규정이 없는 한, 모든 aav 바이러스는 10℃의 t70i 로터에서 350,000 g 에서 90 분 동안 요오디 탄올 그라데이션 초원심으로 정화되어 불순한 aav 제제물에서 오염물질을 분리한다. 15% 요오드 옥살올 단계는 1m 의 nacl 을 첨가하여 대분자 간의 이온 상호작용을 불안정시키는 데 도움이 된다. 40%와 25% 의 단계는 빈 캡시드를 포함한 밀도가 낮은 오염물질을 제거하는 데 사용된다. 이 60%의 단계는 게놈을 함유한 바이러스에 대한 패션으로 작용한다. 전체 (게놈을 포함한) 입자를 가진 제제는 몇 단계의 경도 초 원심분리를 거쳐 풍부하게 된다. aav capsid 는 vr1 82kda, vr2 72kda, vr3 62kda 를 함유하고 있으며, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (페이지)을 이용하여 은염색이나 쿠마시 블루 염색을 통해 검출할 수 있다. 순수 aav 는 그림 3 과 같은 genemedi 에서 정화된 다음 바이러스와 같은 세 가지 주요 단백질 밴드만 표시해야 한다. 우리는 다양한 서비스에 제공하는 규격에 따라 aav 바이러스의 순도를 보장합니다. 그림 3. 정화된 aav 바이러스의 순도 aav 의 적사 검사 aav 바이러스는 itr 을 대상으로 하는 프라이머를 사용하여 실시간 정량적 pcr 로 적정한다. 증폭기는 sybr 녹색 기술을 사용하여 검출됩니다. 그런 다음 알려진 농도의 플라즈미드 샘플의 표준 곡선과 비교하 여 적사 값을 결정한다. 표준 샘플과 테스트할 샘플의 ct 값의 예는 표 7 에 나와 있고 표준 곡선은 그림 4 에 나와 있다.
- 71. 14 표 7. 표준및 샘플의 ct 값은 전형적인 절대 정량화 과정에서. 표준 복사 번호(vg/ml) ct 값 1 ct 값 2 ct 값 3 표준 _1 1010 4.51 4.32 4.42 표준 _2 109 7.21 7.61 7.25 표준 _3 108 10.97 10.55 10.67 표준 _4 107 14.19 14.38 14.35 표준 _5 106 17.75 17.58 17.68 aav 샘플 12.78 12.65 12.81 그림 4. 절대 계량화의 표준 곡선. 각 그룹의 평균 ct 값을 y 축으로 설정하고, 해당 그룹의 대수를 x 축으로 설정합니다. 테스트할 샘플의 평균 ct 값을 공식으로 대체하여 x=7.45 를 얻습니다. aav 바이러스 적사 계산 공식을 대체하십시오: 10x×40000 vg/ml = 107.45×40000 = 1.1×1012 vg/ml. aav 세포 감염 실험 aav 적사 검사 후, 동물 실험 전에 감염 활성도를 평가해야 한다. 293t, CHO 와 같은 세포에 감염되어 표적 유 전자의 발현을 검사한다. moi 는 104 에서 105 의 범위를 통제할 것입니다 (moi 는 감염의 다중성, 즉 세포를 감염시키는 데 필요한 바이러스 입자의 수입니다).
- 72. 체외 세포 전달권장 프로토콜: 1. AAV 바이러스를 얼음 위에 해동시키세요. 2. 세포가 양호한 상태에 있고 전도할 준비가 되어 있을 때, moi104 와 106vg/세포에서 세포의 전도를 시작한 다. 3. 세포를 바이러스를 함유한 매체로 적어도 6-12 시간 동안 부화시킨다. 감염 중에 바이러스를 함유한 매체를 교환하는 것은 12 시간 후에야 필요하지 않습니다. 표적 유전자의 발현은 3-7 일이 걸릴 수 있다. 4. 만약 포장된 aav 가 형광 라벨 단백질을 코딩한다면, 유도 후 24h, 48h, 72h, 96h 형광 현미경으로 바이러 스 감염 효율을 관찰할 수 있다. 참고: aav 감염은 세포 유형과 혈청 유형에 의존하며, 일부 자주 사용되는 세포계의 전도 효율을 표 8 에 나열한다. 일반적으로 aav 는 렌티바이러스와 아데노바이러스에 비해 세포계에 감염하는 능력이 약하기 때문에 체외 실 험은 권장되지 않는다. 표 8. 다른 aav 혈청형 간의 전도 효율성 비교 세포 줄기 AAV1 AAV2 AAV3 AAV4 AAV5 AAV6 AAV8 AAV9 AAV-DJ AAV-DJ/8 어 -7 13 100 2.5 0 0.1 10 0.7 0 500 0.2 HEK293 25 100 2.5 0.1 0.1 5 0.7 0.1 500 0.3 헬라 3 100 2 0.1 6.7 1 0.2 0.1 667 0.2 HepG2 3 100 16.7 0.3 1.7 5 0.3 ND 1250 0.5 Hep1A 20 100 0.2 1 0.1 1 0.2 0 400 0.1 911 17 100 11 0.2 0.1 17 0.1 ND 500 0 CHO 100 100 14 1.4 333 50 10 1 25000 5 왜냐하면 33 100 33 3.3 5 14 2 0.5 500 0.3 메우 10 100 20 0.3 6.7 10 1 0.2 2857 1 NIH3T3 10 100 2.9 2.9 0.3 10 0.3 ND 500 0.1 A549 14 100 20 ND 0.5 10 0.5 0.1 1000 0.1 HT1180 20 100 10 0.1 0.3 33 0.5 0.1 333 0.2 단세포 1111 100 ND ND 125 1429 ND ND 100 ND 미성숙한 dc 2500 100 ND ND 222 2857 ND ND 200 ND 성숙한 dc 2222 100 ND ND 333 3333 ND ND 100 ND 15
- 73. 16 심장, 간, 신장,유방, 췌장, 난소, 뇌, 눈, 골격근, 지방조직 등과 같은 정상적인 조직이나 기관에 대해 genemedi 는 생쥐와 쥐의 조직 감염에 대한 최적의 aav 혈청형, 유전자 전달 방법 및 주사량을 체계적으로 조직하여 표 9 에 열거한다 aav 를 이용한 동물 실험 . 표 9. 특정 기관에서의 aav 유전자 전달 방법 감염 기관 추천 혈청형 주사 경로 동물 주입량(μl) 심장 AAV9 현장에서 여러 지점 쥐가 10-15/점, 3-5 점 마우스 10-15/점, 3-5 점 꼬리 정맥 쥐가 250(체중 200g) 마우스 100 간 aav8 또는 aav9 꼬리 정맥 쥐가 200(체중 200g) 마우스 100 전체 뇌 AAV-PHP.eB 꼬리 정맥 쥐가 200(체중 200g) 마우스 100 측심실 AAV9 입체 방향 쥐가 1-5 마우스 1-5 뇌 조직 AAV9 입체 방향 쥐가 2-3 마우스 1-2 지방 AAV9 복막 내 - 복막내 지방 쥐가 300 마우스 150-200 에서 원지 주사 - 피하지방 쥐가 10-15/점, 3-5 점 마우스 10-15/점, 3-5 점 골격 근육 aav1 또는 aav9 제자리 주사 쥐가 10-15/점, 3-5 점 마우스 10-15/점, 3-5 점 눈 AAV2, aav10 또는 aav-dj 유리실 주사 쥐가 3-5 마우스 1-3 망막하공주사 쥐가 1-2 마우스 1-2 폐 AAV6 기관내 주사 쥐가 100(무게 200g) 마우스 50-75 신장 aav2 또는 aav9 신장 골반 주사 쥐가 10-15/점, 3-5 점 마우스 10-15/점, 3-5 점 장 aav1 또는 aav5 관장 쥐가 200(무게 200g) 마우스 100
- 74. aav 는 선진적이고안전한 체내 유전자 전달 도구로서 가장 우수한 유전자 치료 매개체로 입증되었다. 특정 장 기에 바이러스를 주사하는 방법은 어떻습니까? 다음과 같이 aav 유전자 전달 방법의 네 가지 종류를 완전히 설 명합니다. 꼬리 정맥 주사 감염 부위: 심장, 간, 전 뇌 (AAV-PHP.eB) 1. 마우스를 장치에 넣어 꼬리 정맥을 주입하십시오(만약 이런 장치가 없다면 50ml 의 원심분리기 튜브를 개조 할 수 있다. 전체 장치는 통풍과 고정되어야 한다). 2. 쥐의 꼬리를 70% 알코올로 소독하세요. 꼬리를 따뜻하게 유지하세요. 너무 추워도 혈관이 수축됩니다. 3. 왼쪽 검지의 엄지손가락으로 쥐의 꼬리를 잡고 부드럽게 곧게 펴고 검지를 앞으로 움직이고 꼬리를 약간 구 부린다. 당신은 구부러진 장소에 바늘을 삽입하고 aav (27-30g 인슐린 바늘, 100μl/마우스) 주입할 수 있습니 다. 4. 천천히 주사하고 5-10 초 동안 유지하여 바이러스가 다시 흐르지 않도록 하세요. 5. 바늘을 뽑은 다음 손가락이나 건조한 무균 면공 또는 거즈로 주사 부위를 몇 초 동안 누릅니다. 그림 5. 꼬리 정맥 주사 그림. 간 문정맥 주사(간 내에 aav 국소 투여) 감염 부위 간 1. Xylazin/ketamin 혼합물(10mg/kg, 100mg/kg)(Xylazin/ketamin, Sigma-Aldrich X1251, K2753)을 피하에 주사하여 쥐를 마취한다. 2. 쥐의 눈(Oculentum simplex, Teva Pharmachemie)에 연고를 바르면 눈이 건조하지 않도록 한다. 3. 쥐의 복부를 위로 조정하고 두 번째 갈비뼈와 네 번째 유두들 사이의 부위에 머리카락을 깎아라. 이 단계는 마취 없이 1 일 전에 수술할 수 있다. 4. 탈피부를 반복적으로 소독한다. 그런 다음 메스로 갈비뼈에서 네 번째 유두의 영역까지 3cm 를 자르세요. 유 선, 장, 간 등과 같은 다른 조직을 해치지 않도록 조심하세요. 17
- 75. 18 5. 시진핑은 무균면봉으로 대장, 소장 등 내장을 조심스럽게 뽑는다. 간문정맥이 볼 수 있을 때까지 만지 지 않도록 가즈로 가볍게 덮어라. 6. 사전에 바이러스를 32g 의 주사기에 빨아들이고, 바늘을 5 도 미만의 각도로 간 아래 약 1 센티미터 거 리로 천천히 간 문정맥에 삽입한다. 간 문정맥을 따라 3-5mm 를 삽입하십시오(문정맥을 보기 어려운 경 우 해부 거울로 식별할 수 있다). 7. 바이러스를 천천히 주사하다. 주사가 완료되면 3-5s 동안 머물고 바늘을 분배하고 면봉으로 잠시 부드 럽게 누르세요. 그런 다음 지혈면으로 간 문정맥을 덮고 면봉으로 5 분 동안 가볍게 누르면 지혈을 돕는다. 지혈이 완료되었는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 상처를 계속 누르세요. 8. 지혈면을 제거하세요(조직이 지혈면에 단단히 부착되어 있다면 무균 pbs 로 윤택하게 할 수 있다). 9. 장기를 쥐의 배에 부드럽게 넣으세요. 4-0 라인, 대략 10-15 바늘을 사용하여 상처를 봉합합니다. 10. 통증을 완화하기 위해 부피바카인 100μl (5mg/ml)를 상처 부위에 주입합니다. 26g 의 인슐린 바늘로 500μl 의 무균 pbs 를 피하에 주입하여 수화한다. 전체 수술은 약 30 분이 걸렸다. 11. 실험이 완료되면 생쥐의 몸을 충분히 따뜻하게 유지해야 한다(예를 들면 37 도 가열등, 온도조절기 등) 하여 회복이 편리하다. 뇌 입체방향 위치 감염 부위: 뇌 1. Xylazin/ketamin 혼 합 물 (10mg/kg, 100mg/kg)(Xylazin/ketamin, Sigma-Aldrich X1251, K2753)을 피하에 주사하여 쥐를 마취한다. 2. 쥐의 머리와 귀 사이의 머리카락을 깎고 스테레오 포지셔닝기의 따뜻한 트레이에 놓으세요. 3. 치아와 귀 사이의 자를 0 으로 만듭니다. 쥐의 눈(Oculentum simplex, Teva Pharmachemie)에 연 고를 바르면 눈이 건조하지 않도록 한다. 4. 마우스의 위쪽 절치를 고정 판의 슬롯에 고정하여 머리가 고정되지 않도록 합니다. 동일한 사령선과 수 평면에 브레그마와 램블마를 조정합니다. 마우스의 코가 중심이고 안정되어 있는지 확인합니다. 5. 메스로 쥐의 머리 피부를 벗기고 메스로 표면을 긁어내라. 혈액이 흘러나오면 면봉으로 말려주세요. 브 레그마와 람다의 위치가 뚜렷하게 볼 수 있는지 확인하십시오. 6. 브레그마 좌표(X, Y, Z = 0)를 0 으로 삼아 람다 위치가 브레그마와 같은 수준에 있는지 확인합니다. 7. 대상 뇌 영역에 따라 좌표를 설정합니다. 좌표가 고정되면 두개골의 구멍을 표시합니다.
- 76. 19 약 0.015mm 가10 초 이내에 마크에서 드릴됩니다. 뇌조직이 손상되지 않도록 조심하세요. 8. Aav 를 주사기에 흡입하고 이전에 설정한 좌표에 따라 삽입한 다음 0.05-0.1μl/min 의 속도로 바이러 스를 천천히 주입한다. 일반적으로 각 쥐는 0.05μl 에서 2μl 사이의 부피로 주사된다. 9. 주사가 완료되면 10 분 동안 그것을 유지하고 천천히 바늘을 돌려주십시오. 10. 수술 중에 혈액이 흘러나오는 경우 면봉을 사용하여 적시에 혈액을 건조시키십시오. 11. 마지막 단계는 두피를 봉합하는 것이다. 실험 후 회복을 용이하게 하기 위해 쥐의 몸을 충분히 따뜻하 게 유지해야 한다(예를 들면 37 도 가열등, 온도조절기 등)한다. 도막 내 주사 감염부위: 척추신경 1. Xylazin/ketamin 혼 합 물 (10mg/kg, 100mg/kg)(Xylazin/ketamin, Sigma-Aldrich X1251, K2753)을 피하에 주사하여 쥐를 마취한다. 2. 쥐의 눈(Oculentum simplex, Teva Pharmachemie)에 연고를 바르면 눈이 건조하지 않도록 한다. 3. 꼬리 근처의 피부의 약 2cm2 에서 머리카락을 제거하여 바늘이 어디에 삽입되는지를 보십시오. 4. 마우스를 전용 선반에 놓고 15ml 의 원심분리관을 몸의 하부에 놓아 바늘 삽입 부위를 약간 아치시킨 다. 5. 30g 바늘로 바이러스를 25μl 해밀턴에 빨아들이세요. 6. 척추의 l6(가장 두드러진) 위치를 놓고 손가락으로 부드럽게 누르세요. 7. L5 척추와 L6 척추 사이의 홈에 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오. 쥐의 꼬리가 약간 위로 돌아섰다는 점에 주의하십시오. 이것은 바늘이 골수껍질에 성공적으로 삽입되었음을 나타냅니다. 8. 일단 성공적으로 삽입되면 한 손으로 바늘을 고정하고 다른 손으로 5-10μl 의 바이러스를 천천히 주입 하십시오. 주사 용량은 적절해야 하며, 작은 용적은 실험 오차를 증가시키고, 큰 용적은 장내 압력을 증가 시킨다는 점에 주의하십시오. 9. 필요하다면 24h 후에 주사를 반복하십시오. 10. 실험이 끝난 후에는 쥐의 몸을 충분히 따뜻하게 유지해야 한다(예를 들면 37 도 가열등, 온도조절기 등)하여 회복을 용이하게 한다. 11. 이전에 보고했듯이, 포인트당 1μl 로 8 포인트를 주입하는 것이 좋습니다. 다른 깊이의 두 개의 단면을 선택하고 단면선에서 4 점을 선택합니다. 도표는 그림 6 에 나와 있습니다.
- 77. 20 그림 6. 여러포인트 주사의 구조도 게다가, genemedi 는 정상 조직 및 기관의 주사 동영상을 조직합니다. 문의하는 것을 환영합니다. 일반적으로 바이러스 주사 이후 냉동 절개, 파라핀 절개, qpcr 또는 wb 를 통해 표적 유전자를 체내에서 검출하기 전에 적어도 3 주가 걸린다. 일반적으로, 조직의 원위 주사의 경우, aav 에 gfp 또는 rfp 를 표시 하면 주사 후 3~4 주 이후 주사 부위에서 형광 현미경으로 바이러스 감염의 효율을 관찰할 수 있다. 사례 공유 사례 1. aav 간 전달 그림 7. 쥐의 간에서의 aav9-gfp 의 전도 결과를 선택합니다. 바이러스 및 적사: AAV-pTBG-Luc, 1.4×1012vg/ml 동물: 쥐,C57, 2 개월 유전자 전달 방법: 꼬리 정맥, 100μl 결정 측정: 감염 후 3 주, 냉동 절단, 면역 형광 현미경, 체내 영상 결론: aav-ptbg-luc 정맥주사 간세포만 감염시키고 비특이적 감염은 없다
- 78. 21 사례 2. aav심장 전달 그림 8. 쥐의 심장(a,B,C)과 쥐의 심장(D)에서 aav9-gfp 의 전도 결과를 선택합니다. 바이러스 및 적사: AAV9-GFP, 1×1012vg/ml 동물: 쥐,SD,2 개월(그림 8a,B,C); 쥐,C57, 8 개월(그림 8d) 감염부위: 심장 유전자 전달 방법: 심근 원위 주사, 10μl/부위, 총 5 부위(그림 8a, B, C); 안경내 정맥 주사(그림 8d) 결정 측정: 감염 후 3 주, 냉동 절단, 면역 형광 현미경 사례 3. aav 폐 전도 그림 9. 쥐의 폐에서의 aav9-gfp 의 전도 결과를 선택합니다. 바이러스 및 적사: AAV9-GFP, 1×1012vg/ml 동물: 쥐,SD, 2 개월 감염 부위: 폐 유전자 전달 방법: 기관주사, 10μl/부위, 총 5 부위 결정 측정: 감염 후 3 주, 냉동 절단, 면역 형광 현미경 사례 4. aav 뇌전도 그림 10. 쥐의 뇌에서 aav9-gfp 의 전도 결과를 선택합니다. 바이러스 및 적사: AAV9-GFP, 1×1012vg/ml
- 79. 22 동물: 쥐,C57, 2개월 감염부위: 뇌 유전자 전달 방법: 뇌 위치 주사, 1μl 결정 측정: 감염 후 3 주, 냉동 절단, 면역 형광 현미경 사례 5. aav 해마 전도 그림 11. 쥐의 해마에서 aav2-gfp 의 전도 결과를 선택합니다. 바이러스 및 적사: AAV9-GFAP-GFP, 1×1012vg/ml 동물: 쥐,C57, 2 개월 감염 부위: 해마 유전자 전달 방법: 뇌 위치 주사, 1μl 결정 측정: 감염 후 3 주, 전량, 면역 형광 현미경 사례 6. aav 망막 전도 그림 12. 쥐의 망막에서 aav2-gfp 의 전도 결과를 선택합니다. 바이러스 및 적사: AAV2-GFP, 1×1012vg/ml 동물: 쥐,C57, 2 개월 감염 부위: 망막 유전자 전달 방법: 망막하강 주사, 3μl 결정 측정: 감염 후 3 주, 전량, 면역 형광 현미경
- 80. 23 사례 7. aav골격근 전달 그림 13. 쥐의 골격근에서 aav2-gfp 의 전달 결과를 선택합니다. 바이러스 및 적사: AAV9-Luc, AAV9-GFP, 1×1012vg/ml 동물: 쥐,C57, 2 개월 감염부위: 골 격근육 유전자 전달 방법: 근원 주사, 10μl/부위, 총 4 부위 결정 측정: 감염 후 4 주, 체내 영상, 냉동 절단, 면역 형광 현미경 사례 8. aav 신장 전달 그림 14. 쥐의 근육에서의 aav2-gfp 의 전도 결과를 선택합니다. 바이러스 및 적사: AAV9-GFP, DJ-GFP, 1×1012vg/ml 동물: 쥐,C57, 2 개월 감염 부위: 신장 유전자 전달 방법: 신장 다부위 주사 10μl/부위, 총 6 부위 측정 방법: 감염 후 3 주, 냉동 절단, 면역 형광 현미경
- 81. 24 사례 9. aav유방 전달 그림 15. 쥐의 근육에서의 aav2-gfp 의 전도 결과를 선택합니다. 바이러스 및 적사: AAV9-GFP, 1×1012vg/ml 동물: 쥐,C57, 2 개월 감염 부위: 유선 지방 패드 유전자 전달 방법: 유방 주사, 10μl/부위, 총 4 부위 결정 측정: 감염 후 3 주, 냉동 절단, 면역 형광 현미경 사례 10. aav 종양 전달 그림 16. 종양에서의 aav-dj/9-gfp 의 선택된 전도 결과. 바이러스 및 적사: AAV-DJ/9-GFP, 1×1012vg/ml 동물: 누드 쥐,2 개월 감염부위: 피하이식 장암세포 유전자 전달방법: 종양주사, 10μl/부위, 총 4 부위 결정 측정: 감염 후 3 주, 냉동 절단, 면역 형광 현미경
- 82. 25 그림 17. aav체외 선택 전도 사례 11. aav 체외 전도 결과 바이러스 및 적사: AAV1/6/8/Rh10/DJ/9-GFP, 1×1012vg/ml 세포: HEK-293T MOI:MOI=1×104 측정 측정: 감염 후 36 시간, 면역 형광 현미경 참조 1. 아치슨 rw, bc casto 와 wm hammon. (1965). 아데노바이러스와 관련된 결함 바이러스 입자 과학 149:754-6. 2. 호건 md, nr 블랙로우, wp rowe. (1966). 다양한 아데노바이러스 제제에서 발견되는 작은 DNA 바이러스에 대한 연구: 물리적, 생물학적, 면역학적 특성. Proc natl acad si u s a 55:1467-74. 3. 와이츠만 md 와 rm linden. (2011). 아데노 관련 바이러스 생물학. 방법 mol biol 807:1-23. 4. Schmidt M, A Voutetakis, S Afione, C Zheng, d mandikian, ja chiorini. (2008). 아데노 관련 바이러스 12 형 (AAV12): 시알산과 황산헤파란 프로테오글리칸과 무관한 전도 활성을 가진 새로운 aav 혈청형. J Virol 82:1399-406. 5. Gao G, LH Vandenberghe, MR Alvira, Y Lu, R Calcedo, x zhou, jm wilson. (2004). 아데노 관련 바이러스의 클라이드는 인체 조직에 널리 퍼져 있다. J Virol 78:6381-8. 6. 반덴버그 lh, jm wilson, g gao. (2009). 유전자 치료를 위한 aav 매개체 캡시드를 맞추다. 유전자 16:311-9. 7. Wu Z, a asokan 과 rj samulski. (2006). 아데노 관련 바이러스 혈청형: 인간 유전자 치료를 위한 벡터 도구 키트. 14:316-27. 8. Hauck B, l 진과 w xiao. (2003). 접합 재조합 aav 매개체의 생성 및 특성 7:419-25. 9. 라비노위츠 je, 드 볼스, SM Faust, JG Ledford, se cunningham, rj samulski. (2004). 바이러스의 교차 착용: 아데노 관련 바이러스 혈청형의 전환은 아군을 기능적으로 정 의한다. J Virol 78:4421-32. 10. 조이 vw, dm 맥카티, rj samulski. (2005). aav 하이브리드 혈청형: 유전자 전달을 위한 개선된 매개체. curr 유전자 5:299-310. 11. 데이턴 rd, ms grames, rl 클라인. (2018). 쥐로 더 넓은 유전자 전달 cns: aav php.eb 벡터 복용량-반응 및 aav php.b 와의 비교. 유전자 25:392-400. 12. Du X, H Hao, Y Yang, S Huang, C Wang, S Gigout, R Ramli, X Li, e jahorska, I Edwards, J Deuchars, Y Yanagawa, J Qi, b 관, DB Jaffe, h 장 및 n gamper. (2017). 감각 신절 내의 국부 가바에르지 신호는 주변 피해 감지 전달을 제어한다. j 클린 투자 127:1741-1756. 13. 풍 d, b 왕, l 왕, n 아브라함, K Tao, L Huang, W Shi, y dong, y qu. (2017). 허혈전 멜라토닌 치료는 perk 와 ire1 신호를 통해 내질망 스트레스 의존성 자가식을 억제함으 로써 허혈성 뇌졸중 후의 급성 신경세포 손상을 완화시킨다. j 소나무 레이스 62. 14. Li C, W Sun, C Gu, z 양, N Quan, j 양, Z Shi, l yu 및 h ma. (2018). 만성 통증 관련 심근 허혈 민감성에 대한 치료적 개입을 위해 aldh2 를 목표로 한다. Theranostics 8:1027-1041.
- 83. 26 15. Li L,B Li, M Li, C Niu, G Wang, T Li, E Krol, w jin 및 jr speakman. (2017). 갈색 지방세포는 체내에서 유선기저근상피세포의 표현형을 나타낼 수 있다. Mol Metab 6:1198-1211. 16. Li S, X Dou, H Ning, q 노래, W Wei, x 장, c 신, J Li, c sun, z 노래. (2017). Sirtuin 3 은 지방 독성에 대한 간세포의 민감성을 지정하는 자 가식용의 음성 조절제로서 작용한다. 간학 66:936-952. 17. 웨이 y, y 진, y 추, h 조, g 류, y 장, q 몽, g 우, y 진, x 재, h 왕, h 영, b 주, m 류, d 리 및 qding. (2016). 크리스프/카스 9 매개된 근저항의 체내 파괴에 의한 근육 낭비를 예방합니다. 24:1889-1891. 18. Wu X, X Wu, Y Ma, F Shao, Y Tan, T Tan, L Gu, Y Zhou, B Sun, Y Sun, X Wu and Q Xu. (2016). Cug-binding 단백질 1 은 hsc 활성 화와 간 섬유 생성을 조절한다. Nat Commun 7:13498. 19. 양 h, j 양, W Xi, s 호, b 호, x 하, l 주, h 루, YQ Yu, f 욱, s 단과 h 왕. (2016). 후각 신호에 의한 선천적 공포를 반대적으로 조절하는 후각 신호 간의 신경세포 아형이다. Nat Neurosci 19:283-9. 20. 위안 y, y 정, x 장, y 진, x 오, j 오, z 신, l 장, l 왕, w 양, j 라, z 친, w 호 및 z 진. (2017). BNIP3L/nix 를 매개한 미타식은 park2 와 상관없 이 허혈성 뇌 손상을 방지한다. 자가식용 13:1754-1766. 21. 장 x,y 위안,l 강,j 장,j 고,z 신,y 정,tden,hyan,wli,ww 후,jlu,y 신,hdai,wwhu, z 장과 z 천이다. (2014). 투니카마이신과 타프시가르킨에 의한 내질망 스트레스는 일시적인 허혈성 뇌 손상을 방지한다: park2 의존성 유사식의 관여를 보호한다. 자가식용 10:1801-13. 22. 위안 yp, ZG Ma, xzhang, SC Xu, xf geng, zyang, w deng, qz tang. (2018). ctrp3 는 sirt1 의 활성화를 통해 독소루비신에 의한 심장 기 능 장애, 염증 및 세포 사망으로부터 보호된다. jmol 세포 카디올 114:38-47. 23. shity, sffeng, mxwei, yhuang, gliu, htwu, yxzhang, wxzhou. (2018). 카이네이트 수용체를 매개하는 육상 섬피질의 사이 naptic ltp 는 쥐의 두려움과 불안을 유발한다. 신경약리학 128:388-400. 24. Lu NN, C Tan, NH Sun, LX Shao, XX Liu, YP Gao, RR Tao, qjiang, CK Wang, JY Huang, k zao, GF Wang, ZR Liu, K Fukunaga, ym lu 및 f han. (2018). 콜린에너지 grb2 관련 결합 단백질 1 은 인지 기능을 조절한다. 뇌피질 28:2391-2404. 25. 이 c, d 황, j 당, m 진, q 루, h 리, m 장, b 욱, j 마오. (2018). clc-3 염화물 채널은 이소프레날린으로 인한 심장 비대에 관여한다. 유전자 642: 335-342. 26. 팬 c, x 주, q 송, p 왕, z 류, sy yu. (2018). mir-134 는 쥐의 limk1/coflin 신호를 하향 조정함으로써 만성 스트레스로 인한 구조적 가소성과 우울증과 같은 행동을 조절한다. 신경약리학 131: 364-376. 27. Ma Y, L Yu, S Pan, S Gao, w 진, x 장, W Dong, J Li, r 주, l 황, y 한, l 백, l 장, l 장. (2017). CRISPR/cas9 를 매개한 rosa 26 지점의 표적 은 cre-loxp 를 매개한 혈통 추적을 모니터링하기 위해 cre-reporter 쥐의 균주를 생성한다. 2 월 j 284:3262-3277. 28. 류 x, ftian, swang, fwang, lxiong. (2017). 아스트로세포 자가식용 흐름은 산소-포도당 박탈과 허혈/재주입 손상으로부터 뉴런을 보호한 다. 회복 ress. 29. leang j, L Li, Y Sun, W He, x wang, q su. (2017). 활성화 nrf2/ho-1 신호 경로가 쥐의 관상 동맥 미세 색전술 후 심근세포 자살에 대한 보 호 작용 BMC 심혈관 장애 17:272. 30. 그는 y,span, mxu, rhe, whuang, psong, jhuang, ht 장과 yhu. (2017). 아데노 관련 바이러스 9 를 매개한 cdk5 억제 펩타이드는 알츠하 이머병 쥐의 병리적 변화와 행동 결함을 반전시킨다. 파세브 J 31:3383-3392. 31. Duan NN, xj 류와 jwu. (2017). 팔미틴산은 염증체와 고슴도치 신호를 통해 간 별형 세포의 활성화를 유발한다. 생명 과학 176:42-53. 32. Du D, L Hu, j u, q u, W Cheng, y 국, r 관, y 왕, x 진, x 연, d 주, j 왕, s 장, y 국 및 c 하. (2017). 신경염증은 스트레스로 유발된 고혈압 쥐의 기부 배외부 골수의 신경세포의 자가식용 흐름의 막힘에 기여한다. j 신경염증 14:169. 33. Bai J, XJ Yu, KL Liu, FF Wang, GX Jing, HB Li, y 장, CJ Huo, X Li, HL Gao, j qi 및 ym 강. (2017). tert-butilhydroquinon 의 중앙 투여 는 고혈압 쥐의 시상하부 심실 외핵의 nrf2 신호를 조절함으로써 고혈압을 감소시킨다. Toxicol Appl Pharmacol 333:100-109. 34. Lei S, RZ Sun, D Wang, MZ Gong, XP Su, f yi 및 zw peng. (2016). lrpprc 에 의한 산화 인산화에 의한 간 지방산 흡수와 산화를 증가시 켜 혈액 수준을 감소시킨다. 전면 물리적 7:270.
- 84. 27 연락처 정보 제네메디 바이오테크놀로지Inc. aav 에 대한 자세한 내용은 www.genemedi.net/i/aav-packaging 를 참조하십시오. genemedi 제품에 대한 자세한 내용과 pdf 형식의 매뉴얼을 다운로드하려면 우리의 웹사이트 www.genemedi.net 를 방문하십시오. 추가 정보나 기술 지원을 원하시면 전화하거나 이메일을 주시기 바랍니다. 전 세계: +86-21-50478399 팩스: +86-21-50478399 이메일: support@genemedi.net © 2018 genemedi 바이오테크놀로지. Inc. All rights reserved. 관련 제품 1. aav 포장 시스템 자세한 내용은 https://www.genemedi.net/i/aav-vector-system 을 참조하십시오. 2. aav 약속-orftm: aav 와 포유동물 발현 매개체의 서열 검증 cdna 복제 자세한 내용은 https://www.genemedi.net/i/virus-plasmid 를 참조하십시오. 3. aav 맞춤형 생산 자세한 내용은 https://www.genemedi.net/i/adeno-association-virus-aav-customized-production-service 를 참조하십시오.
- 85. About GeneMedi GeneMedi specializesin creating superior antibody, protein, and vector-based bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions. At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of unparalleled expertise in the following areas: Innovative Antigen Design and Robust Assay Development Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical and research settings. Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUSTM for accelerated antibody discovery and LIBRATM for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize molecules with optimal stability and functionality. Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXTTM platform is our answer to the industry's need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking gene therapy approaches. High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent quality controls. Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification techniques to guarantee vector efficacy and integrity Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic accuracy. Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry. Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability Scalable Production and Uncompromising Quality Comprehensive Solutions for Diverse Application Needs GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner. Website: https://www.genemedi.net Contact Email: support@genemedi.net | sales@genemedi.net
- 86. Protocols Library: Gene Therapy Biologics GENEMEDI nnovati ion forTherapeutics&Diagnostics Industry DiagnosticsTarMart Click to download. Storage and Diutionof AAV……………………………………………………………………… Table of Content Руководство пользователя аденоассоциированный вирус (ААВ) s 2 A Introductionof AAV……………………………………………………………………………… Table ofContents………………………………………………………………………………1 SafeUse of AAV…………………………………………………………………… …………… ……………2 3 dvantages of AAV forGeneDelveryand Expression………………………………………………3 AAVSerotypes andNative Tropism-AAV Seledion Guide…………………………………………………4 AAV Product, Service and Information ofVector,Listof Goods inStockofGenemedi……………………6 ProductCharacterof ProductandService tem ofGenemedi AAV………………………………………………………………6 Genemedi AAV… …………………… … …… …………………………… …… … …6 Listof MainGenemedi AAVVectorand Goods in Stock……………………………………………………7 Overall ExperimentProcedureofAAVProduction………………………………………………………10 Experimental Materials………………………………………………………………………………………11 Vector ConstructionofAAV…………………………………………………………………………………12 Packagingof AAV………………………………………………………………………………12 Collection and Purificationof AAV…………………………………………………………………………13 TiterDetectionof AAV………………………… ……………………………………………………13 Cell InfectionTestofAAV………………………… …………………………………………………14 AnimalExperimentwithAAV………………………………………………………………………………16 TailVein Injedion………………………… ………………………………………… ……………………17 Hepafic Portal Vein Injection (localdelveryof AAVinliver)……………………………………………17 Brain Stereotacic Posiioning…………………………………………………………………18 Inrathecal njection……………………………… …………………………………………………………19 Casesharing………………………………………………………………………………………………20 Case 1.AAVLiverTransduction……………………………………………………………………………20 Case2.AAVHeart Transducion………………………………………… …… ……………………………21 Case 3.AAV LungTransduction…………………………………………………………………………21 Case 4.AAV Brain Transduction……………………………………………………………………21 Case 5.AAV HippocampusTransduction………………………………………………………………22 Case6.AAV Retna Transducion………………………… ………………………………………………22 Case 7.AAVSkeletal Muscle Transdudtion………………………………………………………………23 Case 8.AAV Kidney Transduction………………………………………………………………………23 Case 9.AAV Breast Transducion………………………… ………………………………………………24 Case 10.AAVTumorTransduction………………………………………………………………………24 Case 11.AAVTransducion in vino……………………………………………………………25 References……………………………………………………………………………………………………25 1
- 87. безопасное использование aav 1.Соответствующие эксперименты AAV должны проводиться на объектах биобезопасности 2 класса (BL-2 класс). 2. пожалуйста, полностью оснастите лабораторное пальто, маску, перчатки и старайтесь избежать обнажения рук и рук. 3. Будьте осторожны, чтобы брызгать вирусную суспензию. Если шкаф биобезопасности заражен вирусом во время эксплуатации, немедленно вытерьте стол раствором, содержащим 70% спирта и 1% SDS. Перед утилизацией все наконечники, трубки, культуральные пластины, контактные среды вируса должны быть замочены хлорсодержащим дезинфицирующим раствором. 4. Если необходимо центрифугировать, трубка центрифуги должна быть плотно герметизирована. Если позволяют условия, закройте трубку парапленкой перед центрифугом. 5. Эксперименты на животных, связанные с aav, также должны проводиться на уровне bl-2. 6. Отходы, связанные с AAV, должны быть специально собраны и автоклавированы перед утилизацией. 7. После эксперимента вымыть руки дезинфицирующим средством. хранение и разбавление aav хранение aav Вирус может храниться при температуре 4 ° C в течение короткого времени (менее недели), прежде чем его использовать после приема. Поскольку вирусы AAV чувствительны к замораживанию-оттаиванию, а титр снижается при повторном замораживании-оттаивании, запасы вируса Aliquot должны храниться при морозильной камере -80 ° C сразу по прибытии для длительного использования. в то время как перед использованием рекомендуется повторное обнаружение титра вируса, если вирусы AAV хранятся более 12 месяцев. разбавление аав растворите вирус в ледяной воде, если необходимо разбавление вируса. После растворения смешайте вирус с средой, стерильным PBS или физиологическим раствором при температуре 4 ° C (используйте в течение недели). меры предосторожности · избегайте воздействия aav на экстремальные условия окружающей среды (pH, хелатирующие агенты, такие как edta, температура, органические растворители, белковые денатуранты, сильные моющие средства и т. д.) · Избегайте ввода воздуха в образец aav во время вихревого, пузырькового дувания или аналогичных операций, что может привести к денатурации белка. · Избегайте повторного замораживания и оттаивания. · избегайте воздействия «обычных» пластиков (особенно полистирола или гидрофобных пластиков) в течение длительного периода времени в жидкой фазе. большинство вирусов AAV очень липкие, и потеря может возникнуть при воздействии обычного пластика, включая трубки, пластины для культивирования клеток, кончики пипетки, если не замороженные. Лучше всего хранить aav в силиконизированных или низкобелковых связывающих трубках. Плюроник f-68, используемый при 0,01%-0,1% в буфере для формулы, минимизирует приклеивание при использовании обычного пластика. 2
- 88. 3 · Избегайте разбавленияaav в раствор с низким содержанием соли. некоторые серотипы AAV, такие как AAV2, агрегируются в растворе с низким содержанием соли, который будет неинфекционным. введение aav в биологических науках genemedi системы экспрессии рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) используются для доставки и экспрессии шрны, человеческого орфа, криспра in vitro и in vivo. Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой одноцепочечный вирус ДНК, заражающий человека и некоторые другие виды приматов. В настоящее время aav не знает, что вызывает заболевание и вызывает только очень легкие иммунные ответы. как член семейства parvoviridae, aav дикого типа нуждается в помощи аденовируса или герпесвируса для завершения дублирования, поэтому его называют аденоассоциированным вирусом [1,2]. геном aav2 дикого типа состоит из генов вирусного репликации и капа (кодирующих гены репликации и капсида соответственно), окруженных перевернутыми терминальными повторениями (ITRs), которые содержат все элементы цис-действия, необходимые для репликации и упаковки. геном типичного aav2 составляет около 4800 б.п., состоящего из двух открытых кадров чтения (orf) вверх и вниз по течению, которые находятся между двумя перевернутыми терминальными повторениями (ITR), состоящими из rep и cap (рисунок 1). Itr необходим для синтеза дополнительной цепочки ДНК, в то время как rep и cap могут трансформироваться в различные белки, включая незаменимый белок цикла вируса aav rep78, Rep68, Rep52, rep40 и оболоченный белок vp1, VP2, VP3 и т. д. [3]. Нынешние рекомбинантные векторы aav (rAAV) генерируются путем замены всего вирусного генома между itrs транскрипционной кассетой длиной менее 5 килобазов. полученная конструкция затем экспрессируется совместно с двумя другими плазмидами: 1) плазмидой aav-rc, которая обеспечивает гены rep и cap в трансе (отдельно от кассеты itr/трансгена), и 2) плазмидой aav-вспомогательной, которая удерживает аденовирусные вспомогательные гены. Клетки aav-293 используются в качестве линии упаковочных клеток, поскольку они также обеспечивают белок e1a в трансе. модифицируя гены rep и cap, ученые могут контролировать серотипы, направляя рекомбинантную AAV-инфекцию к определенным тканям. эта система ко-трансфекции 3-плазмиды освобождает потребность в аденовирусе во время производства AAV, что значительно упрощает процесс очистки. на сегодняшний день описано в общей сложности 12 серотипов aav со своими уникальными чертами и тропизмами [4]. Что касается высокой безопасности, низкой иммуногенности, долгосрочной экспрессии экзогенных генов, aav считается лучшим инструментом доставки генов для исследования функции генов in vivo. рисунок 1. схематическая схема структуры генома aav2. преимущества aav для доставки и экспрессии генов 1. превосходный рейтинг биобезопасности Aav — это естественно дефектный вирус, требующий предоставления нескольких факторов транса для продуктивной инфекции и не был связан с какими-либо заболеваниями человека. В нашей системе производства aav последовательности aav2 itr и гены rep/cap присутствуют на отдельных плазмидах, которым не хватает гомологии, что предотвращает выработку рекомбинантного вируса дикого типа. эти характеристики дают aav превосходный рейтинг биобезопасности среди векторов доставки генов и экспрессии вирусного происхождения.
- 89. 4 2. широкий диапазонинфекции Вирусы aav заражают широкий спектр клеток млекопитающих и успешно используются для экспрессии белков человека и нечеловека. в отличие от других векторов вирусного происхождения, векторы aav оказались компетентными для экспрессии генов у иммунокомпетентных хозяев. 3. высокий титр Рекомбинантный aav можно производить при высоких титрах ≥107 вирусных частиц/мл с помощью этого протокола. титры до 1013 вирусных частиц/мл после публикации концентрации. 4. инфекция не требует активно делящейся клетки-хозяина Aav может заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. 5. долгосрочный потенциал переноса генов Рекомбинантный aav (rAAV) может поддерживаться в клетках человека, создавая потенциал для долгосрочного переноса генов. в большинстве клеточных популяций вирусный геном обычно остается эпихромосомой, часто образуя конкатемеры, которые стабильны в медленно делящихся или не делящихся клетках, что приводит к длительному переносу и экспрессии генов. тогда как при быстро делящихся клеточных популяциях вирусы aav могут интегрироваться в геном хозяина, но не образуют конкатемеров, что приводит к длительной экспрессии генов в делящихся клетках, но это редкое событие. Интеграция происходит чаще, если используется чрезвычайно высокое множество инфекций (MOI) aav или если инфекция происходит в присутствии аденовирусной репликазы, потенциально обеспечиваемой использованием аденовируса дикого типа. однако это снизит биобезопасность системы aav для увеличения интеграционных событий путем использования аденовируса дикого типа. Серотипы aav и местный тропизм-руководство по отбору aav За последние десятилетия многочисленные серотипы AAV были идентифицированы с переменным тропизмом. на сегодняшний день 12 серотипов AAV и более 100 вариантов AAV были выделены из запасов аденовирусов или из тканей приматов человека/нечеловека. разные серотипы aav проявляют разные тропизмы, заражая разные типы клеток и типов тканей. поэтому выбор подходящего серотипа AAV имеет решающее значение для доставки генов клеткам или тканям-мишеням. благодаря проявлению естественного тропизма в отношении определенных типов клеток или тканей, raav привлек значительное внимание. очень распространенное у людей и других приматов, было выделено несколько серотипов aav. AAV2, AAV3, AAV5, aav6 были обнаружены в клетках человека, а aav1, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, aav12 в образцах нечеловеческих приматов [5,6]. дивергенция генома между различными серотипами наиболее сосредоточена на гиперпеременных областях (HVRs) капсида вируса, которые могут определять их тканевые тропизмы. В дополнение к вирусному капсиду, на тропизмы тканей векторов aav также влияют рецепторы поверхности клеток, поглощение клеток, внутриклеточная обработка, ядерная доставка генома вектора, разъем покрытия и конверсия ДНК второй цепи [7]. Чтобы лучше повысить эффективность инфекции и специфичность aav к мишеням тканей, ученые генетически модифицировали вирусный капсид и генерировали мозаичные векторы для создания химерных aav путем обмена доменами или аминокислотами между серотипами [8,9], что может позволить исследователям специально нацелить клетки с определенными серотипами на эффективную трансдукцию и экспрессию генов в локализованной области [10]. тем временем способность AAV проникнуть через гематоэнцефалический барьер у животных значительно ограничена или улучшена. традиционно aav можно вводить в ткань головного мозга только с помощью хирургии для научных исследований в центральной нервной системе, что значительно увеличивает сложность эксперимента и влияет на результаты эксперимента. теперь модифицированный серотип aav php.b и php.eb может заразить весь мозг через гематоэнцефалический барьер через
- 90. 5 инъекция периферической крови[11]. самые популярные серотипы raav и их тропизмы перечислены в следующей таблице1. таблица 1. серотипы raav и их тропизмы. серотип аав тканевой тропизм CNS. сетчатка, сетчатка легочное печень, печень поджелудо чная железа почка сердце, сердце мышечная мышца AAV 1 √ √ √ √ √ AAV 2 √ √ √ AAV 3 √ √ √ √ AAV 4 √ √ √ AAV 5 √ √ √ √ AAV 6 √ √ √ √ √ AAV 7 √ √ AAV 8 √ √ √ √ AAV 9 √ √ √ √ √ AAV-DJ √ √ √ √ ААВ-ДЖ/8 √ √ √ AAV-Rh10 √ √ √ √ √ аав-ретро √ √ √ AAV-PHP.B √ √ √ AAV-PHP.eB √ √ AAV-PHP.S √ √ √
- 91. 6 Сведения о продуктах,услугах и векторах аав, перечень товаров на складе genemedi Продукты и услуги genemedi aav · Индивидуальное производственное обслуживание аденосвязанного вируса (AAV) (таблица 2). · Служба по производству аденоассоциированного вируса (AAV) CRISPR/cas9. · услуги по производству оптогенетических аденоассоциированных вирусов (AAV) (таблицы 3 и 4). · сервис по производству aav-lc3 для обнаружения аутофагического потока (таблица 5). · услуга по производству предварительно сделанного аденоассоциированного вируса (AAV). · Служба по производству вирусов контроля аденоассоциированного вируса (AAV). Характер продукта genemedi aav · высокая эффективность. иммуногенность aav чрезвычайно низкая. титр вируса составляет до 1014 вг/мл, что дает ему высокую эффективность инфекции в различных тканях. · долгосрочное выражение. экспрессия мишеневого гена может продолжаться более 2 лет. · большая библиотека серотипов. с 11 серотипами и рядом мутантных подтипов aav может эффективно заражать почти все ткани и органы животных. · тканевой тропизм. Для различных клеток/тканей доступно множество тканеспецифических промоторов, включая сердце, печень, мышцы и различные промоторы, специфичные для нервных тканей. · высокое качество. все вирусные продукты подвергаются строгому тестированию, включая стерильные, немикоплазменные, неэндотоксиновые.
- 92. 7 список основных векторовгенемеди аав и товаров в наличии таблица 2. список векторов aav (Некоторые специфические для тканей промоторы, такие как сердце, печень, мышцы и т. Д., Не указаны в таблице, добро пожаловать на консультацию) тип типа ААВ плазмиды промоутер характеристики выражения флуоресцент ная метка примечание, примечание чрезмерное выражение pAAV-CMV-MCS-T2A- Зринь Зринь СМВ общий и сильный Зринь Зринь pAAV-CMV-MCS-EF1- Зринь Зринь СМВ общий и сильный Зринь Зринь pAAV-CAG-MCS-T2A- Зринь Зринь Кэг Кэ общий и сильный Зринь Зринь pAAV-CAG-MCS-T2A- Ма Черри Кэг Кэ общий и сильный Ма Черри pAAV-CAG-DIO-MCS- T2A-ZsGreen Кэг Кэ общий и сильный Зринь Зринь кре-зависимый выражение pAAV-CAG-DIO-MCS- T2A-mCherry Кег Ке общий и сильный Ма Черри выражение, зависящее от cre pAAV-hsyn-MCS-T2A- Зринь Зринь Хин Синь специфический для нейронов Зринь Зринь pAAV-hsyn-MCS-T2A- Ма Черри Хин Синь специфический для нейронов Ма Черри pAAV-CamkII-MCS-T2A- Зринь Зринь Кэм Ки специфический для нейронов Зринь Зринь pAAV-CamkII-MCS-T2A- Ма Черри Кэм Ки специфический для нейронов Ма Черри pAAV-GFAP-T2A-EGFP ГФАП специфичный для астроцитов EGFP понижающее регулирование pAAV-U6-MCS-CMV- Зринь Зринь U 6 общий и сильный Зринь Зринь pAAV-U6-CMV-mCherry U 6 общий и сильный Ма Черри чрезмерная экспрессия циркны pAAV-CMV-crRNA-EF1- Зринь Зринь СМВ общий и сильный Зринь Зринь нокаут, нокаут Паав-Грна-Сакас9 U 6 общий и сильный Нет ни одного
- 93. 8 таблица 3. списокинструментов оптогенетики в aav. ААВ плазмиды характеристики промотора и экспрессии флуоресцентная метка Зависим ый от крем оптогенетически й эффект pAAV-CAG-DIO-eNpHR3.0-EYFP Кэг Кэ (общее и сильное выражение) EYFP Да. подавление, подавление Paav-cag-dio-hchr2 (H134R)-mCherry Ма Черри Да. активация активации pAAV-CAG-DIO-ArchT-EYFP EYFP Да. подавление, подавление Paav-cag-dio-c1v1(t/t)-TS-mCherry Ма Черри Да. активация активации pAAV-CAG-DIO-Arch3.0-EYFP EYFP Да. подавление, подавление Paav-cag-dio-hcheta-eyfp EYFP Да. активация активации pAAV-CMV-DIO-eNpHR3.0-EYFP СМВ (общее и сильное выражение) EYFP Да. подавление, подавление pAAV-CMV-DIO-hChR2 (H134R)-mCherry Ма Черри Да. активация активации pAAV-CMV-DIO-ArchT-EYFP EYFP Да. подавление, подавление pAAV-CMV-DIO-C1V1(t/t)-TS-mCherry Ма Черри Да. активация активации pAAV-CMV-DIO-Arch3.0-EYFP EYFP Да. подавление, подавление pAAV-CMV-DIO-hCHETA-EYFP EYFP Да. активация активации pAAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFP Хин Синь (нейроноспецифическое давление) EYFP Нет. подавление, подавление pAAV-hSyn-hChR2 (H134R)-mCherry Ма Черри Нет. активация активации pAAV-hSyn-ArchT-EYFP EYFP Нет. подавление, подавление pAAV-hSyn-C1V1-(t/t)-TS-mCherry Ма Черри Нет. активация активации pAAV-hSyn-Arch3.0-EYFP EYFP Нет. подавление, подавление ПААВ-ХСИН-ДИО-ХЧЕТА-ЭЙФП EYFP Да. активация активации pAAV-GFAP-eNpHR3.0-EYFP ГФАП (специфическая экспрессия астроцитов) EYFP Нет. подавление, подавление pAAV-GFAP-hChR2 (H134R)-mCherry Ма Черри Нет. активация активации pAAV-GFAP-ArchT-EYFP EYFP Нет. подавление, подавление pAAV-GFAP-C1V1 (t/t)-TS-mCherry Ма Черри Нет. активация активации pAAV-GFAP-Arch3.0-EYFP EYFP Нет. подавление, подавление ПААВ-ГФАП-ХЧЕТА-ЭЙФП EYFP Нет. активация активации pAAV-CaMKII-eNpHR3.0-EYFP Кэм Ки (специфическая экспрессия нейронов) EYFP Нет. подавление, подавление pAAV-CaMKII-hChR2 (H134R)-mCherry Ма Черри Нет. активация активации pAAV-CaMKII-ArchT-EYFP EYFP Нет. подавление, подавление pAAV-CaMKII-C1V1 (t/t)-TS-mCherry Ма Черри Нет. активация активации pAAV-CaMKII-Arch3.0-EYFP EYFP Нет. подавление, подавление pAAV-CaMKII-hCHETA-EYFP EYFP Нет. активация активации
- 94. 9 таблица 4. списокинструментов химической генетики в aav. ААВ плазмиды характеристики промотора и экспрессии флуоресцен тная метка Завис имый от крем оптогенетичес кий эффект pAAV-CAG-DIO-DTR-2A-GFP Кэг Кэ (общее и сильное выражение) EGFP Да. pAAV-hSyn-DTR-2A-GFP Хин Синь (специфическая экспрессия нейронов) GFP Нет. pAAV-CaMKII-DTR-2A-GFP Кэм Ки (специфическая экспрессия нейронов EGFP Нет. pAAV-CAG-DIO-hM3D (Gq)- Ма Черри Кэг Кэ (общее и сильное выражение) Ма Черри Да. Gq-DREADD pAAV-CAG-DIO-hM4D(Gi)- Ма Черри Кег Ке (общее и сильное выражение) Ма Черри Да. Ги Дреадд pAAV-hSyn-DIO-hM3D (Gq)- Ма Черри Хин Синь (специфическая экспрессия нейронов) Ма Черри Да. Gq-DREADD pAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)- Ма Черри Хин Синь (специфическая экспрессия нейронов) Ма Черри Да. Ги Дреадд pAAV-hSyn-hM3D (Gq)- mCherry Хин Синь (специфическая экспрессия нейронов) Ма Черри Нет. Gq-DREADD pAAV-hSyn-hM4D(Gi)- mCherry hSyn (специфическая экспрессия нейронов) Ма Черри Нет. Ги Дреадд pAAV-CaMKII-hM3D (Gq)- Ма Черри Кэм Ки (специфическая экспрессия нейронов) Ма Черри Нет. Gq-DREADD pAAV-CaMKII-hM4D(Gi)- Ма Черри Кэм Ки (специфическая экспрессия нейронов) Ма Черри Нет. Ги Дреадд
- 95. 10 таблица 5. списокинструментов мониторинга автофагического потока с AAV тип типа ААВ плазмиды характеристики промотора и экспрессии флуоресцентная метка двойная этикетка pAAV-mRFP-GFP-LC3 Общее и сильное выражение cmv mRFP + GFP одна этикетка pAAV-GFP-LC3 Общее и сильное выражение cmv GFP общий экспериментальный порядок производства aav Схематический обзор производства рекомбинантных AAV показан на рисунке 2. первым шагом является клонирование интересующего гена (GOI) в соответствующий плазмидный вектор. для большинства приложений интересующая КДНК клонируется в один из ITR/MCS, содержащих векторы (таблица 2). последовательности перевернутого терминального повторения (ITR), присутствующие в этих векторах, обеспечивают все элементы цис-действия, необходимые для репликации и упаковки aav. рекомбинантная экспрессионная плазмида ко-трансфицируется в клетки aav-293 с фелпером (несущим гены, происходящие от аденовируса) и paav-rc (несущим репликацию aav2 и гены капсида), которые вместе обеспечивают все факторы транс-действия, необходимые для репликации aav-293. и упаковка в клетках aav- 293. Рекомбинантные вирусные частицы AAV получают из инфицированных клеток AAV-293, а затем могут использоваться для заражения различных клеток млекопитающих. при заражении клетки-хозяина одноцепочечный вирус должен быть преобразован в двуцепочечный для экспрессии гена. вирус AAV опирается на факторы клеточной репликации для синтеза дополнительной цепи. эта конверсия является ограничивающим шагом в экспрессии рекомбинантных генов и может быть ускорена с помощью аденовирусной суперинфекции или этопозидов, таких как камптотецин или бутират натрия. тогда как эти агенты токсичны для клеток-мишеней и могут убить клеток-мишени, если их оставят на клетках, поэтому использование этопозидов рекомендуется только для краткосрочного использования или при получении вирусных титров. обычно геном aav образует высокомолекулярные конкатемеры, которые отвечают за стабильную экспрессию генов в клетках.
- 96. 11 рисунок 2. Блок-схемаэксперимента по упаковке aav. экспериментальные материалы Система aav содержит плазмиду с интересующим геном (GOI), то есть paav-GOI, упаковочную плазмиду paav-rc и phelper. · информацию о паав-гое можно ознакомиться в таблице 2–5, а профили плазмидной карты можно ознакомиться на сайте www.genemedi.net. · штамм бактерий: штамм кишечной палочки stbl3 используется для амплификации векторов aav и упаковки плазмид. · линия ячеек: ячейка упаковки aav aav-293; среда: дмем с пенициллин-стрептомицином и 10% фбс. для обеспечения стабильности и непрерывности эксперимента лучше заморозить достаточное количество ячеек aav-293 на логарифмической фазе в качестве резервного банка ячеек. уведомления: если клеточная линия загрязнена микоплазмой, чтобы достичь лучшего состояния культивированных клеток, мы рекомендуем использовать антимикоплазменный реагент генемеди куреплазматм.
- 97. 12 векторная конструкция aav передупаковкой aav представляющий интерес ген должен быть конструирован в вектор итросодержащих плазмид, как указано в таблице 2. Genemedi также предоставляет различные векторы aav с альтернативными промоторами и флуоресцентными маркировками. Также возможна настройка вектора с тканеспецифическим промотором или условно-зависимым регуляторным элементом (например, кре-зависимым флекс/дио, тет- оном). В то же время у genemedi есть множество предварительно сделанных векторов aav с некоторыми генетическими инструментами в запасе, такими как оптогенетика, dradds и обнаружение аутофагического потока, указанного LC3, и т. д. (более подробную информацию см. в таблице 2–5). Примечание: Для быстрого и эффективного построения векторов настоятельно рекомендуется использовать комплект одноступенчатого клонирования genemedi-cloneasytm (Cat. GM-GC-01/02/03. упаковка aav размножают клетки aav-293 в dmem с 10% fbs и 1% пен/стреп. за день до трансфекции разложите клетки в тарелку диаметром 10 см таким образом, чтобы на следующий день клетки достигли 70–80% слияния. в день трансфекции установите 3-плазмидную ко-трансфекцию в качестве таблицы 6. таблица 6. Плазмиды и трансфекционные реагенты, необходимые для трансфекции стандартной тарелки размером 10 см при производстве AAV. компонент, компонент сумма суммы ПААВ-РК 10 мкг Фелпер 20 мкг Паав-Гой 10 мкг липогенетм 100 мкл Дмем необходимо предварительно нагреть до 37 с водяной ванной. Реагент для трансфекции липогенетма ℃ должен быть нагрет до комнатной температуры перед использованием и аккуратно перемешивать перед использованием. замените среду для трансфекции тарелки 10 см на свежую среду после 6 часов трансфекции. Примечание: 1. Реагент для трансфекции липогенетма получен от генмеди, пожалуйста, обратитесь к руководству по липогенетму во время трансфекции. 2. перед трансфекцией клетки должны находиться в хорошем состоянии. 3. Пожалуйста, оснастите одноразовые перчатки и поведите на уровне bl-2.
- 98. 13 сбор и очисткааав Примерно через 72 часа после трансфекции собирайте клетки с пластины диаметром 10 см с помощью скребка для клеток. вращайте клетки в 1500 г в течение 5 минут, чтобы собрать клеточные гранулы. повторное суспензирование клеточной гранулы в 0,5 мл буфера для лиза (10 мм трис-гкл (ph8,5), 150 мм накл). заморозить/разморозить клеточную гранулу 3 раза в ванне сухого льда/этанола и водяной ванне 37 ° C для получения сырого лизиста. Поверните сырой лизит в 3000 г в течение 10 минут. соберите фракцию супернатанта, которая содержит собранный раав. Держите вирус в -80 ° C. если не указано иное, все вирусы AAV очищаются ультрацентрифугированием с градиентом йодиксанола при 350 000 г в течение 90 минут в роторе t70i при 10 , чтобы выделить загрязнители из нечистых ℃ препаратов AAV. 15% этап йодиксанола помогает дестабилизировать ионные взаимодействия между макромолекулами с добавлением 1 м nacl. Шаги 40% и 25% используются для удаления загрязняющих веществ более низкой плотности, включая пустые капсиды. 60-процентный шаг действует как подушка для геномсодержащих вирусов. преп с полными (содержащими геном) частицами будет обогащен после нескольких этапов градиентной ультрацентрифугирования. Капсид AAV содержит vr1 82 кда, vr2 72 кда и vr3 62 кда, которые можно обнаружить методом полиакриламидного геля электрофореза (страница), последующего окрашиванием серебра или окрашиванием синего кумасси. чистый aav должен показывать только три основные белковые полосы, такие как следующий вирус, очищенный в генемеди, показанный на рис. 3. мы гарантируем чистоту вируса aav на основе спецификаций, которые мы предоставляем для различных услуг. рисунок 3. чистота очищенного вируса AAV. обнаружение титра aav Вирусы aav титрируются количественным PCR в реальном времени с использованием праймеров, нацеленных на ITR. ампликоны обнаруживаются с использованием зеленой технологии sybr. Затем значения титров определяются путем сравнения со стандартной кривой образца плазмиды известной концентрации. Пример значения ct стандартного образца и образца, подлежащего испытанию, приведен в таблице 7, а стандартная кривая показана на рисунке 4.
- 99. 14 таблица 7. Значениеct стандарта и образца в типичном процессе абсолютного количественного определения. Стандартный стандарт номер копии (вг/мл) Значение ct 1 Значение ct 2 Значение ct 3 Стандарт _1 1010 4.51 4.32 4.42 Стандарт _2 109 7.21 7.61 7.25 Стандарт _3 108 10.97 10.55 10.67 Стандарт_4 107 14.19 14.38 14.35 Стандарт _ 5 106 17.75 17.58 17.68 образец aav 12.78 12.65 12.81 рисунок 4. стандартная кривая в абсолютном количественном определении. Установите среднее значение ct каждой группы в качестве оси y, логарифм соответствующей группы в качестве оси x. замените среднее значение ct образцов, подлежащих испытанию, на формулу, получив x = 7,45. Замените формулу расчета титра вируса aav: 10x × 40000 вг/мл = 107,45 × 40000 = 1,1 × 1012 вг/мл. Тест на клеточную инфекцию aav после обнаружения титра aav активность инфекции должна быть оценена перед экспериментами на животных. проверяйте экспрессию гена-мишени, заражая клетки, такие как 293 т, CHO. Мой будет контролироваться в диапазоне от 104 до 105 (мой — это множество инфекций, то есть количество частиц вируса, необходимого для заражения клетки).
- 100. рекомендуемый протокол трансдукцииклеток in vitro: 1. разморозить вирус AAV на льду. 2. 15 начать трансдукцию клеток при мои 104 и 106 вг/клетка, когда клетки находятся в хорошем состоянии и готовы к трансдукции. 3. инкубировать клетки вирусосодержащей средой в течение не менее 6-12 часов. обмен вирусосодержащими средами во время заражения необходим только через 12 часов. Экспрессия генов-мишеней может занять 3-7 дней. 4. если упакованный aav, кодирующий белок флуоресцентной маркировки, эффективность вирусной инфекции можно наблюдать с помощью флуоресцентного микроскопа через 24, 48, 72 и 96 часов после трансдукции. Примечание: Инфекция aav зависит от типа клеток и серотипа, и эффективность трансдукции некоторых часто используемых клеточных линий перечислена в таблице 8. Как правило, aav обладает слабой способностью заражать клеточные линии по сравнению с лентивирусом и аденовирусом, поэтому его не рекомендуют для экспериментов in vitro. таблица 8. Сравнение эффективности трансдукции между различными серотипами AAV. клеточная линия AAV 1 AAV 2 AAV 3 AAV 4 AAV 5 AAV 6 AAV 8 AAV 9 AAV-DJ ААВ-ДЖ/8 Х-7 13 100 2.5 0 0.1 10 0.7 0 500 0.2 Хек 293 25 100 2.5 0.1 0.1 5 0.7 0.1 500 0.3 Хера. 3 100 2 0.1 6.7 1 0.2 0.1 667 0.2 Хепг 2 3 100 16.7 0.3 1.7 5 0.3 Во втором плане 1250 0.5 Гепер 1А 20 100 0.2 1 0.1 1 0.2 0 400 0.1 911 17 100 11 0.2 0.1 17 0.1 Во втором плане 500 0 Чо Чо 100 100 14 1.4 333 50 10 1 25000 5 Потому что 33 100 33 3.3 5 14 2 0.5 500 0.3 Мо Во 10 100 20 0.3 6.7 10 1 0.2 2857 1 них 3 т 3 10 100 2.9 2.9 0.3 10 0.3 Во втором плане 500 0.1 A 549 14 100 20 Во втором плане 0.5 10 0.5 0.1 1000 0.1 HT1180 20 100 10 0.1 0.3 33 0.5 0.1 333 0.2 моноциты 1111 100 Во втором плане Во втором плане 125 1429 Во втором плане Во втором плане 100 Во втором плане незрелый постоянный ток 2500 100 Во втором плане Во втором плане 222 2857 Во втором плане Во втором плане 200 Во втором плане зрелый постоянный ток 2222 100 Во втором плане Во втором плане 333 3333 НД. Во втором плане 100 Во втором плане
- 101. 16 эксперимент на животныхс AAV Для нормальных тканей или органов, таких как сердце, печень, почки, молочная железа, поджелудочная железа, яичники, мозг, глаза, скелетные мышцы, жировая ткань и т. д., genemedi систематически организует соответствующие оптимальные серотипы AAV, методы доставки генов и объем инъекций для инфекции тканей мышей и крыс, которые перечислены в таблице 9. таблица 9. Способы доставки генов aav в конкретные органы. инфекционный орган рекомендуемый серотип маршрут впрыска Животное животное Объем впрыска (мкл) сердце, сердце AAV 9 множество точек на месте крыса, крыса 10-15/балл, 3-5 баллов Мышь 10-15/балл, 3-5 баллов хвостовая вена крыса, крыса 250 (вес тела 200 г) Мышь 100 печень, печень Aav8 или aav9 хвостовая вена крыса, крыса 200 (вес тела 200 г) Мышь 100 весь мозг AAV-PHP.eB хвостовая вена крыса, крыса 200 (вес тела 200 г) Мышь 100 боковой желудочек AAV 9 стереотактический крыса, крыса 1-5 Мышь 1-5 ткань мозга AAV 9 стереотактический крыса, крыса 2-3 Мышь 1-2 жирный жир AAV 9 внутрибрюшинный - внутрибрюшинный жир крыса, крыса 300 Мышь 150-200 В. на местевпрыскивание -подкожный жир крыса, крыса 10-15/балл, 3-5 баллов Мышь 10-15/балл, 3-5 баллов скелетная мышца Aav1 или aav9 инъекция на месте крыса, крыса 10-15/балл, 3-5 баллов Мышь 10-15/балл, 3-5 баллов глаза AAV2, aav10 или aav-dj инъекция стекловидной камеры крыса, крыса 3-5 Мышь 1-3 инъекция субретинального пространства крыса, крыса 1-2 Мышь 1-2 легочное AAV 6 внутритрахеальная инъекция крыса, крыса 100 (вес 200 г) Мышь 50-75 почка Aav2 или aav9 почечная тазовая инъекция крыса, крыса 10-15/балл, 3-5 баллов Мышь 10-15/балл, 3-5 баллов кишечник, кишка Aav1 или aav5 клизма крыса, крыса 200 (вес 200 г) Мышь 100
- 102. как передовой ибезопасный инструмент доставки генов in vivo, aav оказался наиболее превосходным вектором генной терапии. как сделать инъекцию вируса в конкретные органы? четыре вида способов доставки гена aav полностью описаны следующим образом. инъекция хвостовой вены Места заражения: сердце, печень и весь мозг (AAV-PHP.eB) 1. Поместите мышь в устройство для инъекции хвостовой вены (если такого устройства нет, вы можете модифицировать центрифугую трубку 50 мл. Все устройство должно быть вентиляционным и фиксированным). 2. дезинфицируйте хвост мыши 70% спиртом. будьте осторожны, чтобы хвост был теплым, кровеносные сосуды сокращаются, если будет слишком холодно. 3. Держите хвост мыши большим пальцем левого указательного пальца, аккуратно выпрямите его, затем переместите указательный пальц вперед и слегка согните хвост. Вы можете вставить иглу в изгибаемое место и ввести аав (27-30 г инсулиновой иглы, 100 мкл/мышь). 4. Медленно вводите, держите 5-10 секунд, чтобы предотвратить обратный поток вируса. 5. вытащите иглу, затем нажмите на место инъекции пальцами или сухим стерильным хлопковым шариком или марлей в течение нескольких секунд. рисунок 5. диаграмма инъекции хвостовой вены. инъекция воротной вены печени (локальная доставка аав в печень) Места инфекции: печень 1. подкожно вводить смесь ксилазина/кетамин (10 мг/кг, 100 мг/кг) (ксилазина/кетамин, сигма-альдрих x1251, K2753) для анестезии мыши. 2. Нанесите мазь на глаза мыши (Oculentum simplex, Teva Pharmachemie), чтобы глаза не высыхали. 3. регулируйте живот мыши вверх, побрите волосы между вторыми ребрами и областью между четвертыми сосками. Этот шаг может быть оперирован на 1 день впереди без анестезии. 4. Неоднократно дезинфицируйте место депиляции. затем резьте 3 см от ребер до области четвертого соска скальпелем. будьте осторожны, чтобы не повредить другие ткани, такие как молочные железы, кишечник, печень и т. Д. 17
- 103. 18 5. тщательно вытаскиватьвнутренние органы, такие как толстая кишка и тонкая кишка, стерильным ватным тампоном. и аккуратно накройте их марлей, чтобы избежать прикосновения, пока не будет видна воротная вена печени. 6. заранее всосать вирус в шприц объемом 32 г, медленно вставить иглу в воротную вену печени под углом менее 5 градусов и на расстоянии примерно 1 см ниже печени. вставьте 3-5 мм вдоль воротной вены печени (если трудно видеть воротную вену, ее можно идентифицировать с помощью анатомического зеркала). 7. медленно вводить вирус. После завершения инъекции продержитесь в течение 3-5 с, а затем распределите иглу и аккуратно нажмите ее ватным тампоном на некоторое время. затем покройте воротную вену печени гемостатическим хлопком и аккуратно нажмите ватным тампоном в течение 5 минут, чтобы помочь остановить кровотечение. Убедитесь, что гемостаз завершен, иначе продолжайте нажимать на рану. 8. удалите гемостатический хлопок (если ткань плотно прикреплена к гемостатическому хлопку, ее можно увлажнить стерильным PBS). 9. осторожно положите орган обратно в живот мыши. шить рану с помощью линии 4-0, примерно 10-15 игл. 10. ввести 100 мкл бупивакаина (5 мг/мл) в место раны, чтобы облегчить боль. гидратация проводилась путем подкожной инъекции 500 мкл стерильных ПБС с помощью инсулиновой иглы объемом 26 г. вся операция заняла около 30 минут. 11. необходимо поддерживать тело мыши достаточно теплым (например, 37-градусная нагревательная лампа, термостат и т. д.), чтобы облегчить восстановление после завершения эксперимента. стереотактическое позиционирование мозга место заражения: мозг 1. подкожная инъекция смеси ксилазина/кетамин (10 мг/кг, 100 мг/кг) (ксилазина/кетамин, сигма-альдрих x1251, K2753) для анестезии мыши. 2. побрите волосы между головой мыши и ухом, а затем положите их на теплый поднос стереопозиционера. 3. ноль линейки между зубами и ушями. Нанесите мазь на глаза мыши (Oculentum simplex, Teva Pharmachemie), чтобы предотвратить сушку глаз. 4. закрепите верхние резцы мыши в прорезы фиксированной пластины, чтобы убедиться, что голова остается фиксированной. регулировать брегму и ламму на одной и той же сагиттальной линии и горизонтальной плоскости. убедитесь, что нос мыши находится в центре и стабильно. 5. используйте скальпель, чтобы очистить кожу головы мыши и соскобить поверхность скальпелем. Если кровь течет, высушите ее ватным тампоном, чтобы убедиться, что положение брегмы и ламбды ясно видно (плюс схема). 6. обнулите координаты брегмы (X, Y, Z = 0), гарантируя, что положение ламбды находится на том же уровне, что и брегма. 7. Установите координаты в соответствии с целевой областью мозга. как только координаты зафиксированы, отметьте череп, отверстие
- 104. 19 около 0,015 ммсверляется на отметке в течение 10 секунд. будьте осторожны, чтобы защитить ткань головного мозга от повреждения. 8. Отсосите aav в шприц и вставьте его в соответствии с ранее установленными координатами, затем медленно вводите вирус со скоростью 0,05-0,1 мкл/мин. обычно каждой мыши вводят в объем от 0,05 до 2 мкл. 9. храните его в течение 10 минут, после завершения инъекции, а затем медленно верните иглу. 10. если во время операции течет кровь, вовремя высушите кровь ватным тампоном. 11. последний шаг — шить кожу головы. необходимо поддерживать тело мыши достаточно теплым (например, 37-градусная нагревательная лампа, термостат и т. д.), чтобы облегчить восстановление после эксперимента. интратекальная инъекция место инфекции: спинной нерв 1. подкожная инъекция смеси ксилазина/кетамин (10 мг/кг, 100 мг/кг) (ксилазина/кетамин, сигма-альдрих x1251, K2753) для анестезии мыши. 2. Нанесите мазь на глаза мыши (Oculentum simplex, Teva Pharmachemie), чтобы глаза не высыхали. 3. удалите волосы примерно на 2 см2 кожи возле хвоста, чтобы увидеть, куда вставлена игла. 4. Положите мышь на специальную стойку и поместите центрифужную трубку объемом 15 мл в нижнюю часть тела, чтобы слегка изогнуть место вставки иглы. 5. всасывайте вирус в 25мкл гамилтона с помощью 30 граммов игл. 6. положите l6 (самый выдающийся) позвоночника и аккуратно нажмите на него пальцами, чтобы сделать его гладким. 7. Осторожно вставьте иглу в канавку между позвоночниками l5 и l6. обратите внимание, что хвост мыши слегка перевернулся, что указывает на то, что игла успешно вставлена в миелиновую оболочку. 8. После успешного вставления закрепите иглу одной рукой и медленно введите 5-10 мкл вируса другой рукой. Обратите внимание, что объем инъекции должен быть подходящим, небольшой объем увеличит экспериментальную ошибку, а большой объем увеличит интратекальное давление. 9. при необходимости повторите инъекцию через 24 часа. 10. После эксперимента необходимо поддерживать тело мыши достаточно теплым (например, 37-градусная нагревательная лампа, термостат и т. д.), чтобы облегчить восстановление. 11. как сообщалось ранее, лучше ввести 8 точек с 1 мкл на точку. выберите два поперечных сечения на разной глубине и 4 точки на линии поперечного сечения. схема показана на рисунке 6.
- 105. 20 рисунок 6. схемамноготочечной инъекции in situ. Кроме того, genemedi также организует видео инъекции нормальных тканей и органов, добро пожаловать на запрос. обычно потребуется не менее 3 недель, прежде чем ген-мишень может быть обнаружена in vivo с помощью замороженного сечения, парафинового сечения, qpcr или wb после инъекции вируса. Как правило, при инъекции тканей in situ, если aav помечен gfp или rfp, эффективность вирусной инфекции можно наблюдать с помощью флуоресцентного микроскопа в месте инъекции с 3–4 недель после инъекции. обмен делами случай 1. аав печеночная трансдукция рисунок 7. выбранные результаты трансдукции aav9-gfp в печени мыши. вирус и титр: AAV-pTBG-Luc, 1,4 × 1012 вг/мл животное: мышь, C57, 2 месяца Способ доставки генов: хвостовая вена, 100 мкл определение анализа: через 3 недели после инфекции, замороженное сечение, иммунофлуоресцентная микроскопия, вывод визуализации in vivo: внутривенная инъекция aav-ptbg-luc заражает только клетки печени и не заражает неспецифическую инфекцию.
- 106. 21 случай 2. Aavсердечная трансдукция рисунок 8. выбранные результаты трансдукции aav9-gfp в сердце крысы (a, B, C) и сердце мыши (D). вирус и титр: AAV9-GFP, 1 × 1012 вг/мл животное: крыса, SD, 2 месяца (рисунок 8a,B,C); мышь, C57, 8 месяцев (рисунок 8d) Место заражения: сердце способ доставки генов: инъекция миокарда in situ, 10 мкл/сайт, всего 5 сайтов (рис. 8a,B,C); внутриорбитальная внутривенная инъекция (рис. 8d) определение анализа: через 3 недели после инфекции, замороженное сечение, иммунофлуоресцентная микроскопия. случай 3. аав легочная трансдукция рисунок 9. выбранные результаты трансдукции aav9-gfp в легких мыши. вирус и титр: AAV9-GFP, 1 × 1012 вг/мл животное: крыса, SD, 2 месяца Место заражения: легкие Способ доставки генов: инъекция трахеи, 10 мкл/сайт, всего 5 сайтов. определение анализа: через 3 недели после инфекции, замороженное сечение, иммунофлуоресцентная микроскопия. случай 4. Aav трансдукция мозга рисунок 10. выбранные результаты трансдукции aav9-gfp в мозге мыши. вирус и титр: AAV9-GFP, 1 × 1012 вг/мл
- 107. 22 животное: мышь, C57,2 месяца Место заражения: мозг Способ доставки генов: инъекция локализации мозга, 1 мкл определение анализа: через 3 недели после инфекции, замороженное сечение, иммунофлуоресцентная микроскопия. случай 5. аав трансдукция гиппокампа рисунок 11. выбранные результаты трансдукции aav2-gfp в гиппокампе мыши. вирус и титр: AAV9-GFAP-GFP, 1 × 1012 вг/мл животное: мышь, C57, 2 месяца Место заражения: гиппокамп Способ доставки генов: инъекция локализации мозга, 1 мкл определение анализа: через 3 недели после инфекции, полный монт, иммунофлуоресцентная микроскопия случай 6. аав трансдукция сетчатки рисунок 12. выбранные результаты трансдукции aav2-gfp в сетчатке мыши. вирус и титр: AAV2-GFP, 1 × 1012 вг/мл животное: мышь, C57, 2 месяца Место инфекции: сетчатка Способ доставки генов: инъекция под сетчатку, 3 мкл определение анализа: через 3 недели после инфекции, полный монт, иммунофлуоресцентная микроскопия
- 108. 23 случай 7. аавтрансдукция скелетных мышц рисунок 13. выбранные результаты трансдукции aav2-gfp в скелетных мышцах мыши. вирус и титр: AAV9-Luc, AAV9-GFP, 1 × 1012 вг/мл животное: мышь, C57, 2 месяца Место заражения: скелетные мышцы Способ доставки генов: инъекция мышц in situ, 10 мкл/сайт, всего 4 сайта. определение анализа: через 4 недели после инфекции, визуализация in vivo, замороженное сечение, иммунофлуоресцентная микроскопия. случай 8. аав почечная трансдукция рисунок 14. выбранные результаты трансдукции aav2-gfp в мышцах мыши. вирус и титр: AAV9-GFP, DJ-GFP, 1×1012 vg/мл животное: мышь, C57, 2 месяца Место инфекции: почка Способ доставки генов: многоточечная инъекция в почку 10 мкл/сайт, общее количество 6 точек определяет анализ: 3 недели после заражения, замороженное сечение, иммунофлуоресцентная микроскопия.
- 109. 24 случай 9. аавтрансдукция молочной железы рисунок 15. выбранные результаты трансдукции aav2-gfp в мышцах мыши. вирус и титр: AAV9-GFP, 1 × 1012 вг/мл животное: мышь, C57, 2 месяца Место инфекции: жировая подушка молочной железы Способ доставки генов: инъекция молочной железы, 10 мкл/сайт, всего 4 сайта определение анализа: через 3 недели после инфекции, замороженное сечение, иммунофлуоресцентная микроскопия. случай 10. аав опухолевая трансдукция рисунок 16. выбранные результаты трансдукции aav-dj/9-gfp в опухоли. вирус и титр: AAV-DJ/9-GFP, 1×1012 vg/мл Животное: обнаженная мышь, 2 месяца Место инфекции: подкожная трансплантация раковых клеток кишечника Способ доставки гена: инъекция опухоли, 10 мкл/место, всего 4 места. определение анализа: через 3 недели после инфекции, замороженное сечение, иммунофлуоресцентная микроскопия.
- 110. 25 случай 11. трансдукцияaav in vitro фигура 17. выбранные результаты трансдукции aav in vitro вирус и титр: AAV1/6/8/Rh10/DJ/9-GFP, 1 × 1012 вг/мл клеток: HEK-293T MOI: MOI = 1 × 104 определение анализа: 36 часов после инфекции, иммунофлуоресцентная микроскопия Ссылка на 1. Ачисон РВ, до сих пор Касто и ВМ Хэммон. (1965). дефектные вирусные частицы, связанные с аденовирусом. наука 149:754–6. 2. Хогган МД, НР Блэклоу и ВП Роу. (1966). исследования мелких вирусов ДНК, обнаруженных в различных аденовирусных препаратах: физических, биологических и иммунологических характеристик. Proc Natl Acad Sci U S A 55:1467-74. 3. Вайцман МД и РМ Линден. (2011). биология аденоассоциированных вирусов. методы mol biol 807:1-23. 4. Schmidt M, A Voutetakis, S Afione, C Zheng, d mandikian и ja chiorini. (2008). Адено-ассоциированный вирус типа 12 (AAV12): новый серотип aav с протеогликано-независимой трансдукционной активностью сиаловой кислоты и гепаран сульфата. J Virol 82:1399–406. 5. Гао Г, ЛХ Ванденберге, г-н Альвира, Ю Лу, Р Кальседо, Х Чжоу и ДжМ Уилсон. (2004). клубки аденоассоциированных вирусов широко распространяются в тканях человека. J Вирол 78:6381–8. 6. Ванденберге ЛХ, Джем Уилсон и Г Гао. (2009). адаптация капсида вектора aav для генной терапии. ген тере 16:311-9. 7. Ву з, асокан и рж самульски. (2006). Серотипы аденоассоциированных вирусов: векторный инструментарий для генной терапии человека. моль тер 14:316–27. 8. Хаук б, л чэнь и в Сяо. (2003). генерация и характеристика химерных рекомбинантных аав-векторов. моль те 7:419–25. 9. Рабиновиц Дже, де Боулз, СМ Фауст, Джей Ледфорд, Се Каннингем и Р.Дж. Самульски. (2004). перекрестная перевязка вириона: транскасидация аденоассоциированных вирусных серотипов функционально определяет подгруппы. J Virol 78:4421–32. 10. Чой В.В., Д.М. Маккарти и Р.Дж. Самульски. (2005). Гибридные серотипы aav: улучшенные векторы для доставки генов. ген curr ther 5:299–310. 11. Дейтон РД, МС Греймс и РЛ Кляйн. (2018). более экспансивный перенос генов на крысу cns: aav php.eb вектор доза-ответ и сравнение с aav php.b. ген тер 25:392–400. 12. Du X, H Hao, Y Yang, S Huang, C Wang, S Gigout, R Ramli, X Li, E Jaworska, I Edwards, J Deuchars, Y Yanagawa, J Qi, B Guan, DB Jaffe, h Zhang и n gamper. (2017). локальная габаергическая сигнализация внутри сенсорных ганглий контролирует периферическую ноцицептивную передачу. J Clin Invest 127:1741-1756. 13. Фэн д, б ван, л ван, н Абрахам, к тао, л хуан, W Shi, y dong и y qu. (2017). Преишемическое лечение мелатонином облегчило острое повреждение нейронов после ишемического инсульта путем ингибирования стресс-зависимой аутофагии эндоплазматического ретикулума посредством сигнализации перка и ire1. J шишневая резерва 62. 14. Li C, W Sun, C Gu, Z Yang, N Quan, J Yang, Z Shi, l yu и h ma. (2018). нацеление на aldh2 для терапевтических вмешательств при хронической ишемической восприимчивости миокарда, связанной с болью. тераностика 8:1027–1041.
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- 112. 27 контактная информация генемеди биотехнология.Инк. Для получения дополнительной информации о aav посетите: www.genemedi.net/i/aav-packaging. Для получения дополнительной информации о продуктах genemedi и загрузки руководств в формате pdf посетите наш веб-сайт: www.genemedi.net Для получения дополнительной информации или технической помощи позвоните или напишите нам. по всему миру: 86-21- 50478399 факс: 86-21- 50478399 электронная почта: support@genemedi.net © 2018 genemedi биотехнологии. Инк. все права защищены. сопутствующие продукты 1. Упаковочная система AAV Подробности посетите: https://www.genemedi.net/i/aav-vector-system. 2. Аав обещание-орфтм: проверенные последовательностью клоны КДНК в векторах экспрессии aav и млекопитающих. Более подробная информация посетите: https://www.genemedi.net/i/virus-plasmid. 3. Индивидуальное производство aav Более подробную информацию посетите: https://www.genemedi.net/i/adeno-association-virus-aav-customized- production-service.
- 113. About GeneMedi GeneMedi specializesin creating superior antibody, protein, and vector-based bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions. At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of unparalleled expertise in the following areas: Innovative Antigen Design and Robust Assay Development Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical and research settings. Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUSTM for accelerated antibody discovery and LIBRATM for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize molecules with optimal stability and functionality. Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXTTM platform is our answer to the industry's need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking gene therapy approaches. High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent quality controls. Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification techniques to guarantee vector efficacy and integrity Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic accuracy. Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry. Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability Scalable Production and Uncompromising Quality Comprehensive Solutions for Diverse Application Needs GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner. Website: https://www.genemedi.net Contact Email: support@genemedi.net | sales@genemedi.net