Протокол Genemedi-AAV.pdf

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2. 1
Production protocol
Adeno-associated virus (AAV)
Introduction of AAV
Adeno-associated virus (AAV) is a small single strand DNA virus infecting human and some other primate species.
Currently, AAV has not known to cause disease and only induces very mild immune responses. As a member of the
family Parvoviridae, wild type AAV requires the assistance of adenovirus or herpesvirus to complete the duplication,
which is the reason why it’s called adeno-associated virus [1,2]. The wild-type AAV2 genome consists of the viral
rep and cap genes (encoding replication and capsid genes, respectively), flanked by inverted terminal repeats (ITRs)
that contain all the cis-acting elements necessary for replication and packaging. The genome of typical AAV2 is
about 4800bp, consisting of two upstream and downstream open read frames (ORFs) which are between two
inverted terminal repeats (ITR) comprising Rep and Cap. ITR is required for synthesis of complementary DNA
strand, while Rep and Cap can be translated into various proteins, including AAV virus cycle essential protein
Rep78, Rep68, Rep52, Rep40 and enveloped protein VP1, VP2, VP3, etc. [3].
The present recombinant AAV (rAAV) vectors are generated by replacing all of the viral genome between the ITRs
with a transcriptional cassette of less than 5 kilobases in length. The resulting construct is then co-expressed with
two other plasmids: 1) an AAV-RC plasmid that provides the Rep and Cap genes in trans (separate from the
ITR/Transgene cassette) and 2) an AAV helper plasmid that harbors the adenoviral helper genes. AAV-293 cells are
used as the packaging cell line since they provide the E1a protein in trans as well. By modifying the Rep and Cap
genes, scientists can control the serotypes to guide the recombinant AAV infection towards certain tissues.
This 3-plasmid co-transfection system liberates the need for adenovirus during AAV production, which greatly
simplifies the purification process.
To date, a total of 12 serotypes of AAV have been described with their own unique traits and tropisms [4].
Concerning high safety, low immunogenicity, long-term expression of exogenous genes, AAV is thought to be the
best gene delivery tool for gene function research in vivo.
Over the past decades, numerous AAV serotypes have been identified with variable tropism. To date, 12 AAV
serotypes and over 100 AAV variants have been isolated from adenovirus stocks or from human/nonhuman primate
tissues. Different AAV serotypes exhibit different tropisms, infecting different cell types and tissue types. So,
selecting the suitable AAV serotype is critical for gene delivery to target cells or tissues.
Due to the exhibition of natural tropism towards certain cell or tissue types, rAAV has garnered considerable
attention. Highly prevalent in humans and other primates, several AAV serotypes have been isolated. AAV2, AAV3,
AAV5, AAV6 were discovered in human cells, while AAV1, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11,
AAV12 in nonhuman primate samples [5,6]. Genome divergence among different serotypes is most concentrated on
hypervariable regions (HVRs) of virus capsid, which might determine their tissue tropisms. In addition to virus
capsid, tissue tropisms of AAV vectors are also influenced by cell surface receptors, cellular uptake, intracellular
processing, nuclear delivery of the vector genome, uncoating, and second strand DNA conversion [7].
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3. 2
In order to better improve the infection efficiency and specificity of AAV to target tissues, scientists have genetically
modified the viral capsid, and generated mosaic vectors to create chimeric AAV by swapping domain’s or amino-
acids between serotypes [8,9], which may allow researchers to specifically target cells with certain serotypes to
effectively transduce and express genes in a localized area [10].
Protocol Overview
A schematic overview of recombinant AAV production is shown in Figure 1. The first step is to clone the gene of
interest (GOI) into an appropriate plasmid vector. For most applications, the cDNA of interest is cloned into one of
the ITR/MCS containing vectors. The inverted terminal repeat (ITR) sequences present in these vectors provide all
of the cis-acting elements necessary for AAV replication and packaging.
The recombinant expression plasmid is co-transfected into the AAV-293 cells with pHelper (carrying adenovirus-
derived genes) and pAAV-RC (carrying AAV2 replication and capsid genes), which together supply all of the trans-
acting factors required for AAV replication and packaging in the AAV-293 cells. Recombinant AAV viral particles
are prepared from infected AAV-293 cells and may then be used to infect a variety of mammalian cells.
Upon infection of the host cell, the single-stranded virus must be converted into double-stranded in order for gene
expression. The AAV virus relies on cellular replication factors for synthesis of the complementary strand. This
conversion is a limiting step in recombinant gene expression and can be accelerated using adenovirus superinfection
or etoposides, such as camptothecin or sodium butyrate. Whereas these agents are toxic to the target cells and can
kill target cells if left on the cells, so the use of etoposides is only recommended for short-term use or in obtaining
viral titers. Typically, the AAV genome will form high molecular weight concatemers which are responsible for
stable gene expression in cells.
Figure 1. AAV packaging experiment flow chart.
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4. 3
Experimental Materials
Virus Packaging System
A three-plasmid system is used for packaging recombinant adeno-associated virus (rAAV), which includes an AAV
vector (pAAV) that can be cloned into engineering sequences for gene overexpression, RNA interference and
CRISPR/Cas9 gene knockouts, and packaging plasmid pAAV-RC and pHelper.
Bacterium Strain
E. coli strain DH5ɑ is used for amplification of shuttle and backbone vectors.
Packaging Cell Line
AAV-293 is the virus packaging cell line that can facilitate initial production, amplification and titration of rAAV.
Originated from the 293 cell line and established for plaque assays, this cell line was identified to be an easy-to-
handle transfection host.
The complete growth medium of AAV-293 is Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with
10% Fetal Bovine Serum (FBS) and 1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep). For a continuous culture, cells should
not exceed 70% confluence to maintain proper characteristics. Usually, starting from cell passage number one,
optimal results can be obtained within 30 passages. Once reached, it is best to start a new culture from another
frozen stock in case of any unexpected mutations and unhealthy growth. Therefore, banking your own AAV-293
frozen stocks is very important to ensure experimental integrity and continuity. Freezing cells at the logarithmic
phase will improve post-thaw viability.
Notices:
To maintain cells in a healthier condition and improve production efficiency of AAV, it is recommended to use our
Genemedi anti-mycoplasma reagent, CurePlasmaTM
.
Other Materials and Reagents
Gene of interest
LB broth
Agar and Agarose
Kanamycin
Ampicillin
70 and 100% ethanol
Sterile PBS
Iodixanol
Pluronic-F68
Chlorine bleach
DNA gel apparatus and power supplies
Class II Biosafety Cabinet
37℃ orbital shaker
GeneMedi

5. 4
37℃ bacteria incubator
37℃, 5% CO2 incubator
15- and 50-ml conical tubes
25- and 75-cm2
tissue culture flasks
Cell scrapers
Dry-ice/methanol bath
Liquid nitrogen tank
Low-speed swinging-bucket centrifuge
Microcentrifuge
Centrifuge tube (thick-wall polycarbonate tube with cap)
Packaging and Concentration of rAAV
Construction and Amplification of Plasmids
Constructed rAAV vector plasmids and the backbone vector should be amplified in DH5ɑ, and purified by Maxi-
Prep kit to remove endotoxins (note: QIAGEN Plasmid Maxi Kit is recommended). A concentration over 1 µg/µl
and the A260/A280 ratio range between 1.7-1.8 is required for virus packaging. Please be cautious that plasmids
quality would affect the transfection efficiency and titer of product viruses.
Note:
In order to construct vectors quickly and efficiently, it is strongly recommended to use Genemedi - ClonEasyTM
One
Step Cloning Kit（Cat. GM-GC-01/02/03）.
Transfection of Virus Plasmids into AAV-293 Packaging Cells
a. AAV-293 cells should be prepared at least a day ahead to reach a confluence of 50%-70% monolayer
morphology prior to transfection.
b. On the day of transfection, DMEM needs to be pre-warmed in 37℃ water bath and LipoGeneTM
transfection
reagent should be equilibrated to room temperature and tapped to mix before use.
c. To prepare viral plasmids for each reaction using a 10-cm dish according to the following table 1:
Table 1. Plasmid and transfection reagent required for transfection.
Component Amount
pAAV-RC 10 μg
pHelper 20 μg
pAAV-GOI 10 μg
LipoGeneTM
100 l
d. Mix plasmids with transfection reagent in DMEM and add drop-wise to pre-seeded AAV-293 cells. Incubate in
37℃, 5% CO2 and refresh with complete culture medium in 6 hours.
GeneMedi

6. 5
Note:
1. A detailed protocol of the transfection reagent can be referred to Genemedi LipoGeneTM
Transfection Reagent
User Manual.
2. Cells should be in a healthy growth state for use prior to transfection.
Collection of AAV
a. Around 72 hours after transfection, harvest the cells from the 10 cm plate with a cell scraper.
b. Spin the cells at 1,500g for 5 minutes to collect the cell pellet. Resuspend the cell pellet in 0.5ml lysis buffer (10
mM Tris-HCl (pH8.5), 150 mM NaCl). Freeze/thaw the cell pellet 3 times through a dry ice/ethanol bath and a
37°C water bath to obtain the crude lysate.
c. Spin down the crude lysate at 3,000g for 10 minutes. Collect the supernatant fraction, which contains harvested
rAAV. Keep the virus at -80℃.
Purification of AAV
a. Reagent Preparation:
1× PBS-MK buffer: Dissolve 52.6 mg of MgCl2, and 29.82 mg of KCl in 1× PBS in a final volume of 200 mL.
1 M NaCl/PBS-MK buffer: Dissolve 5.84 g of NaCl in 1× PBS-MK buffer in a final volume of 100 mL.
Note: The buffer should be sterilized by passing through a 0.22-μm filter and store at 4 ℃.
15% iodixanol: mix 4.5 mL of 60% iodixanol and 13.5 mL of 1 M NaCl/PBS-MK buffer;
25% iodixanol: mix 5 mL of 60% iodixanol and 7 mL of 1x PBS-MK buffer and 30 μL of phenol red;
40% iodixanol: mix 6.7 mL of 60% iodixanol and 3.3 mL of 1x PBS-MK buffer;
60% iodixanol: mix 10 mL of 60% iodixanol and 45 μL of phenol red.
b. Overlay each solution into a QuickSeal tube in the order (5 mL of 60% iodixanol; 5 mL of 40% iodixanol; 6 mL
of 25% iodixanol; 8 mL of 15% iodixanol) using a 10 mL syringe and an 18 g needle. Carefully add up to 5 mL
of clarified virus supernatant on top of the gradient. Use 1× PBS (or cell lysis buffer) to top off the tube. Seal
the QuickSeal tubes. Centrifuge at 350,000 g for 90 min in a T70i rotor at 10 ℃.
c. Carefully take the QuickSeal tubes out of the rotor and place them in a stable rack.
Note:
Take care to avoid bubbles during purification.
If more centrifugation time is needed, you can alternatively centrifuge for 2 h at 200,000 g at 18 ℃.
GeneMedi

7. 6
Make sure not to disturb the gradient before virus collection.
d. Pierce the QuickSeal tube slightly below the 60-40% interface with an 18 g needle attached to a 10 ml syringe.
The bevel of the needle should be up, facing the 40% iodixanol step. Collect up to 5 ml per tube, and avoid
collecting the proteinaceous material at the 40-25% interface.
Note:
Unless otherwise specified, all AAV viruses are purified with iodixanol gradient ultracentrifugation at 350,000g for
90 min in a T70i rotor at 10℃ to separate out contaminants from the impure AAV preparations. The 15% iodixanol
step helps destabilize ionic interactions between macromolecules with addition of 1M NaCl. The 40% and 25% steps
are used to remove contaminants with lower densities, including empty capsids, while the 60% step acts as a cushion
for genome-containing virions. After several steps of gradient ultracentrifugation, the virus particles will be
enriched.
Concentration of AAV (Ultrafiltration method)
It may be necessary to remove iodixanol (molecular weight: 1,550 Dalton) from the gradient fractions with filtration
or dialysis method either to concentrate the viral particles or avoid interfering with some add-on processes.
a. Pluronic-F68 Preparation:
0.1% Pluronic-F68: 49.5 ml PBS + 500 µl 10% Pluronic F68
0.01% Pluronic-F68: 45 ml PBS + 5 ml 0.1% Pluronic-F68
0.001% Pluronic-F68 with 200mM NaCl: 45 ml PBS + 5 ml 0.01% Pluronic-F68 + 200 mM NaCl
0.001% Pluronic-F68 (formulation buffer): 45 ml PBS + 5 ml 0.01% Pluronic-F68.
b. Balance the filter membrane with 15 ml of 0.1% Pluronic F68 and incubate for 10 min at room temperature.
c. Remove the 0.1% Pluronic F68 and add 15 ml of 0.01% Pluronic F68.
d. Centrifuge at 3000 rpm for 5 min at 4 ℃.
e. Discard the filtrates and add 15 ml of 0.001% Pluronic F68 with 200mM NaCl PBS.
f. Centrifuge at 3000 rpm for 5 min at 4 ℃.
g. Discard the filtrates and add virus purifications.
h. Centrifuge at 3500 rpm for 8 min at 4 ℃, discard the flow through.
i. Replenish more virus purifications and spin 3500 rpm for 4 min at 4°C, discard the filtrates. Repeat this step as
needed.
j. Utilize a P1000 to pipette up and down to wash off the filter wall to recover as much virus as possible.
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8. 7
k. Keep the concentrates at 4 ℃ for short term (less than one week), or in small aliquots and keep at -80 ℃ for long
term usage.
Note:
1. It is difficult to remove Iodixanol. Add more formulation buffer and virus purifications and pipet back and forth
a few times in order to mix the iodixanol settled at the bottom or wall of the column into the solution after each
centrifugation.
2. Concentrating to a minimum of 500 µl is recommended. If the concentrate volume is less than 500 µl, bring up
the volume with formulation buffer.
Quality Assurance of rAAV
AAV capsid contains VR1 82kDa, VR2 72kDa and VR3 62kDa, which can be detected using the method of
polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by silver staining or Coomassie blue staining. Pure AAV
should display only three major protein bands, such as the following virus purified in Genemedi shown in Figure 2.
We guarantee the purity of the AAV virus based on the specification that we give for different services.
Figure 2. Purity of purified AAV virus.
Titer Detection of rAAV
AAV titers are determined by real-time quantitative PCR using primers targeted the ITR. The amplicons are detected
using SYBR green technology. Titer values are then determined by comparison to a standard curve of a plasmid
sample of known concentration. An example of the Ct value of standard sample and sample to be tested is shown in
table 2, while the standard curve is displayed in figure 3.
GeneMedi

9. 8
Table 2. Ct value of standard and sample in a typical absolute quantification process.
Set the average Ct value of each group as Y-axis, the logarithm of corresponding group as X-axis. Substitute the
average Ct value of samples to be tested into formula, obtaining X = 7.45. Substitute the AAV virus titer calculation
formula: 10x
× 40000 vg/ml= 107.45
× 40000=1.1 × 1012
vg/ml.
Figure 3. Standard curve in absolute quantification.
Cell Infection Test of AAV
After AAV titer detection, the infection activity needs to be evaluated before animal experiments. Test the
expression of target gene by infecting cells, such as 293T, CHO. MOI will be controlled ranging from 104
to 105
(MOI is multiplicity of infection, namely the number of virus particle needed for infecting a cell). The detailed AAV
infection protocol can be found in the AAV User Manual.
Safe Use of AAV
1. AAV related experiments should be conducted in biosafety level 2 facilities (BL-2 level).
2. Please equip with lab coat, mask, gloves completely, and try your best to avoid exposing hand and arm.
3. Be careful of splashing virus suspension. If biosafety cabinet is contaminated with virus during operation, scrub
the table-board with solution comprising 70% alcohol and 1% SDS immediately. All tips, tubes, culture plates,
medium contacting virus must be soaked in chlorine-containing disinfectant before disposal.
4. If centrifuging is required, a centrifuge tube should be tightly sealed. Seal the tube with parafilm before
centrifuging if condition allowed.
Standard Copy Number (vg/ml) Ct value 1 Ct value 2 Ct value 3
Standard_1 1010
4.51 4.32 4.42
Standard_2 109
7.21 7.61 7.25
Standard_3 108
10.97 10.55 10.67
Standard_4 107
14.19 14.38 14.35
Standard_5 106
17.75 17.58 17.68
AAV Sample 12.78 12.65 12.81
GeneMedi

10. 9
5. AAV related animal experiments should also be conducted in BL-2 level.
6. AAV associated waste materials need to be specially collected and autoclaved before disposal.
7. Wash hands with sanitizer after experiment.
Storage and Dilution of AAV
Storage of AAV
Virus can be stored at 4°C for a short time (less than a week) before using after reception. Since AAV viruses are
sensitive to freeze-thawing and the titer drops with repeated freeze-thawing, aliquot viral stock should be stored at -
80°C freezer immediately upon arrival for long-term usage. While virus titer redetection is suggested before using if
the AAV viruses have been stored for more than 12 months.
Dilution of AAV
Dissolve virus in ice water if virus dilution is required. After dissolving, mix the virus with medium, sterile PBS or
normal saline solution, keeping at 4°C (using within a week).
Precautions
· Avoid AAV exposure to environmental extremes (pH, chelating agents like EDTA, temperature, organic solvents,
protein denaturants, strong detergents, etc.)
· Avoid introducing air into the AAV samples during vortex, blowing bubbles or similar operations, which may
result in protein denaturation.
· Avoid repeated freezing and thawing.
· Avoid exposing to “regular” plastics (especially polystyrene or hydrophobic plastics) for prolonged periods in
liquid phase. Most AAV viruses are very sticky and loss can occur if exposed to regular plastics, including tubes,
cell culture plates, pipette tips, if not frozen. It is best to store AAV in siliconized or low protein binding tubes.
Pluronic F-68 used at 0.01%-0.1% in the formulation buffer will minimize sticking if regular plastics are used.
· Avoid diluting AAV into low salt solution. Some AAV serotypes, such as AAV2, aggregates in low salt solution,
which will be non-infectious.
GeneMedi

11. 10
References
1. Atchison RW, BC Casto and WM Hammon. (1965). Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science 149:754-6.
2. Hoggan MD, NR Blacklow and WP Rowe. (1966). Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations: physical, biological, and
immunological characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A 55:1467-74.
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sialic acid- and heparan sulfate proteoglycan-independent transduction activity. J Virol 82:1399-406.
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human tissues. J Virol 78:6381-8.
6. Vandenberghe LH, JM Wilson and G Gao. (2009). Tailoring the AAV vector capsid for gene therapy. Gene Ther 16:311-9.
7. Wu Z, A Asokan and RJ Samulski. (2006). Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol Ther 14:316-27.
8. Hauck B, L Chen and W Xiao. (2003). Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Mol Ther 7:419-25.
9. Rabinowitz JE, DE Bowles, SM Faust, JG Ledford, SE Cunningham and RJ Samulski. (2004). Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-
associated virus serotypes functionally defines subgroups. J Virol 78:4421-32.
10. Choi VW, DM McCarty and RJ Samulski. (2005). AAV hybrid serotypes: improved vectors for gene delivery. Curr Gene Ther 5:299-310.
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12. About GeneMedi
GeneMedi specializes in creating superior antibody, protein, and vector-based
bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions.
At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field
of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of
unparalleled expertise in the following areas:
Innovative Antigen Design and Robust Assay Development
Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens
and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical
and research settings.
Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUSTM for accelerated
antibody discovery and LIBRATM for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize
molecules with optimal stability and functionality.
Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXTTM platform is our answer to the industry's
need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking
gene therapy approaches.
High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale
production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent
quality controls.
Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on
AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification
techniques to guarantee vector efficacy and integrity
Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for
comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic
accuracy.
Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic
antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions
can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry.
Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability
Scalable Production and Uncompromising Quality
Comprehensive Solutions for Diverse Application Needs
GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics
and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner.
Website: https://www.genemedi.net
Contact Email: support@genemedi.net | sales@genemedi.net

13. 1
生産プロトコル
アデノ関連ウイルス（AAV）
AAV の導入
アデノ関連ウイルス（AAV）は、ヒトおよび他の霊長類種に感染する小さな単鎖 DNA ウイルスです。現
在、AAV は病気を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫反応しか誘発しません。野生型 AAV
はパルボウイルス科の一員として、複製を完了するにはアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの支援が必
要であり、これがアデノ関連ウイルスと呼ばれる理由です[1,2]。野生型 AAV2 ゲノムは、ウイルスの rep 遺
伝子と cap 遺伝子（複製遺伝子とカプシド遺伝子をそれぞれコードする）で構成され、複製とパッケージ化
に必要なすべてのシス作用元素を含む反転末端繰り返し（ITRs）で囲まれています。典型的な AAV2 のゲノ
ムは約 4800bp で、Rep と Cap を含む 2 つの反転端子リピート(ITR)の間にある 2 つの上流および下流の
オープンリードフレーム(orf)で構成されます。補完的な DNA 鎖の合成には ITR が必要ですが、Rep と Cap
は AAV ウイルスサイクル必須タンパク質 Rep78、Rep68、Rep52、Rep40、および包囲タンパク質
VP1、VP2、VP3 などを含むさまざまなタンパク質に翻訳することができます[3]。
本組換え AAV（rAAV）ベクターは、ITR 間のすべてのウイルスゲノムを長さ 5 キロベース未満の転写カセッ
トに置き換えることによって生成されます。次に、得られた構築物は、他の 2 つのプラスミドと共同発現さ
れます。1)トランスで Rep および Cap 遺伝子を提供する AAV-RC プラスミド(ITR/Transgene カセットとは
別の)、および 2)アデノウイルスを保持する AAV ヘルパープラスミド。ヘルパー遺伝子。AAV-293 細胞は、
トランスにおいても E1a タンパク質を提供するため、包装細胞株として使用されています。Rep 遺伝子と
Cap 遺伝子を修正することで、科学者は血清型を制御して組換え AAV 感染を特定の組織に誘導することがで
きます。この 3 プラスミド共トランスフェクションシステムは、AAV 生産中のアデノウイルスの必要性を解
放し、精製プロセスを大幅に簡素化します。
これまでに、合計 12 の AAV 血清型が、独自の特徴と熱帯性を備えて記述されています[4]。高安全性、低免
疫原性、外因性遺伝子の長期発現に関して、AAV は in vivo 遺伝子機能研究のための最良の遺伝子送達ツール
であると考えられています。
過去数十年にわたって、多数の AAV 血清型が可変トロピズムで同定されてきました。これまでに、アデノウ
イルス株またはヒト/非ヒト霊長類組織から 12 の AAV 血清型と 100 以上の AAV 変異体が分離されていま
す。さまざまな AAV 血清型は異なる熱帯性を示し、さまざまな細胞タイプや組織タイプに感染します。した
がって、適切な AAV 血清型を選択することは、標的細胞または組織への遺伝子送達に不可欠です。
特定の細胞または組織タイプに対する自然な熱帯性が示されたため、rAAV はかなりの注目を集めています。
ヒ ト や 他 の 霊 長 類 に 非 常 に 蔓 延 し て お り 、 い く つ か の AAV 血 清 型 が 分 離 さ れ て い ま
す 。 AAV2 、 AAV3 、 AAV5 、 AAV6 は ヒ ト 細 胞 で 発 見 さ
れ、AAV1、AAV4、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12 は非ヒト霊長類サンプルで発見され
ました[5,6]。さまざまな血清型間のゲノムの発散は、ウイルスカプシドの超可変領域（HVRs）に最も集中
しており、それが組織の熱帯性を決定する可能性があります。ウイルスカプシドに加えて、AAV ベクターの
組織トロピズムは、細胞表面受容体、細胞の取り込み、細胞内処理、ベクターゲノムの核送達、コーティン
グ解除、および第 2 鎖 DNA 変換の影響も受けます[7]。

14. 2
標的組織に対する AAV の感染効率と特異性をよりよく向上させるために、科学者たちはウイルスカプシ
ドを遺伝子組み換え、血清型間でドメインまたはアミノ酸を交換することによってキメラ AAV を作成
するモザイクベクターを生成しました[8,9]。これにより、研究者が特定の血清型を持つ細胞を特異的に
標的にして、局在領域で遺伝子を効果的に伝達および発現することができる可能性があります[10]。
プロトコルの概要
組換え AAV 生産の概略的な概要を図 1 に示します。最初のステップは、関心遺伝子（GOI）を適切なプ
ラスミドベクターにクローンすることです。ほとんどのアプリケーションでは、興味のある cDNA は、
ベクトルを含む ITR/MCS のいずれかにクローンされます。これらのベクトルに存在する反転端子繰り
返し(ITR)配列は、AAV 複製とパッケージ化に必要なすべての cis 作用要素を提供します。
組換え発現プラスミドは、AAV-293 細胞にフェルパー（アデノウイルス由来遺伝子を運ぶ）と pAAV-
RC（AAV2 複製およびカプシド遺伝子を運ぶ）と共にトランスフェクションされ、AAV-293 細胞にお
ける AAV 複製およびパッケージに必要なすべてのトランス作用因子を提供します。組換え AAV ウイル
ス粒子は、感染した AAV-293 細胞から調製され、その後、様々な哺乳類細胞を感染させるために使用
され得る。
宿主細胞が感染すると、遺伝子発現のために単鎖ウイルスを二鎖に変換する必要があります。AAV ウイ
ルスは、相補鎖の合成のために細胞複製因子に依存しています。この転換は、組換え遺伝子発現の制限
ステップであり、アデノウイルス重複感染やカンプトテシンや酪酸ナトリウムなどのエトポシドを用い
て促進することができる。これらの薬剤は標的細胞に有毒であり、細胞上に残すと標的細胞を殺す可能
性があるため、エトポシドの使用は短期的な使用またはウイルス価を得るためにのみ推奨されます。通
常、AAV ゲノムは、細胞内の安定した遺伝子発現の原因となる高分子量のコンテマーを形成します。
図 1。AAV パッケージ実験フローチャート。

15. 3
実験材料
ウイルス包装システム
遺伝子過剰発現、RNA 干渉、CRISPR/Cas9 遺伝子ノックアウトのためのエンジニアリング配列にクローン
可能な AAV ベクター（pAAV）、およびパッケージプラスミド pAAV-RC およびフェルパーを含む組換えア
デノ関連ウイルス（rAAV）のパッケージに 3 プラスミドシステムが使用されます。
細菌株
E.coli 株 dh 5 ɑs はシャトルおよびバックボーンベクターの増幅に使用されます。
包装細胞株
AAV-293 は、rAAV の初期生産、増幅および滴定を容易にすることができるウイルス包装細胞株です。293
細胞株に由来し、プラークアッセイのために確立されたこの細胞株は、扱いやすいトランスフェクション宿
主であることが同定されました。
AAV-293 の完全な成長培地は、10%胎児ウシ血清(FBS)と 1%ペニシリンストレプトマイシン(Pen-Strep)
を補充した Dulbecco の修飾イーグル培地(DMEM)です。連続培養の場合、細胞は適切な特性を維持するた
めに 70%の合流を超えてはいけません。通常、セル通路番号 1 から始めて、30 通路内で最適な結果を得る
ことができます。到達したら、予期せぬ変異や不健康な成長が発生した場合に備えて、別の冷凍株から新し
い文化を開始するのが最善です。したがって、実験の完全性と継続性を確保するためには、独自の AAV-293
凍結株をバンキングすることが非常に重要です。対数相で細胞を凍結することで、解凍後の生存性が向上し
ます。
通知：
細胞をより健康的な状態に維持し、AAV の生産効率を向上させるために、当社のゲネメディ抗マイコプラズ
マ試薬であるキュレプラスマットを使用することをお勧めします。
その他の材料および試薬
関心のある遺伝
子ポンドスープ
寒天及びアガ
ロースカナマイ
シンアンピシリ
ン
70 および 100%エ
タノール滅菌 PBS
ヨージキスノール
プロロニック
F68 塩素漂白
剤
DNA ゲル装置および電源クラス II バイ
オセーフティキャビネット
37℃軌道シェーカー

16. 4
37℃細菌インキュベーター
37℃、5%CO2 インキュベー
ター
15、50ml 円錐チューブ
25 cm2 および 75 cm2 の組織培養フラ
スコセルスクレーパー
ドライアイス/メタノー
ル浴液体窒素タンク
低速スイングバケット遠心分離機マイク
ロ遠心分離機
遠心管（キャップ付き厚壁ポリカーボネート管）
rAAV の包装と濃度
プラスミドの構築と増幅
構築された rAAV ベクタープラスミドとバックボーンベクターは dh 5 ɑs で増幅し、エンドトキシンを除去するために maxi-
prep キットで精製する必要があります(注：キアーゲンプラスミド Maxi キットが推奨されます)。ウイルスパッケージには、
濃度が 1 μ g/μ l を超え、A260/A280 比が 1.7~1.8 の範囲が必要です。プラスミドの品質が製品ウイルスのトランスフェク
ション効率と価に影響を与えることに注意してください。
注意：
ベクターを迅速かつ効率的に構築するためには、genemedi-cloneasytm ワンステップクローニングキット(cat.gm-gc-
01/02/03)を使用することを強くお勧めします。
ウイルスプラスミドの AAV-293 包装細胞へのトランスフェクション
a. AAV-293 細胞は、トランスフェクション前に 50%~70%の単層形態の合流に達するために、少なくとも 1 日前に準備す
る必要があります。
b. トランスフェクションの日には、DMEM を 37℃の水浴で予め温める必要があり、リポゲネットトランスフェクション試
薬を室温に均衡させ、使用前にタップして混合する必要があります。
ンに必要なプラスミドおよびトランスフェクション試薬
c. 下記表 1 に記載の 10cm の皿を用いて、各反応のウイルスプラスミドを調製する。トランスフェクショ
。
d. DMEM中でプラスミドとトランスフェクション試薬を混合し、あらかじめ播種したAAV-293細胞に滴下して加えます。37、5% COの条件
下で培養し、6時間後に完全培地に交換します。
成分 額

17. 5
注意：
1. 前記トランスフェクション試薬の詳細なプロトコルは、ゲネメディリポゲネットトランスフェクション
試薬使用マニュアルを参照することができる。
2. 細胞は、トランスフェクション前に使用するために健康な成長状態である必要があります。
AAV の収集
a. トランスフェクション後約 72 時間後、10cm プレートから細胞スクレーパーで細胞を収穫します。
b. 細胞を 1,500g で 5 分間回転させて細胞ペレットを採取します。細胞ペレットを 0.5ml 溶解緩衝液(10
mM Tris-HCl(pH8.5)、150 mM NaCl)に再懸濁させます。上記細胞ペレットをドライアイス/エタノー
ル浴および 37℃水浴で 3 回凍結・解凍して粗溶解液を得ることを特徴とする。
c. 粗溶解液を 3,000 g で 10 分間回転させます。収穫された rAAV を含む上清分画を収集します。ウイルス
を-80℃に保ちます。
AAV の精製
a. 試薬調製物：
1 × PBS-MK バッファ：最終容積 200ml で 1 × PBS に mgcl2 52.6mg、kcl 29.82mg を溶解させ
る。NaCl/PBS-MK バッファ 1m：nacl 5.84g を 1 × PBS-MK バッファに溶解し、最終容積 100ml。
注：バッファは 0.22 μ m のフィルターを通過して滅菌し、4℃で保管する必要があります。
15%ヨージキスノール：60%ヨージキスノール 4.5ml と 1m nacl/PBS-MK 緩衝液 13.5ml を混合しま
す。
25%ヨージキスノール：60%ヨージキスノール 5ml と PBS-MK 緩衝液 1x 7ml とフェノールレッ
ド 30 μ l を混合します。40%ヨージキスノール：60%ヨージキスノール 6.7ml と PBS-MK 緩衝
液 1x 3.3ml を混合します。
60%ヨージキスノール：60%ヨージキスノール 10ml とフェノールレッド 45 μ l を混合する。
b. 10ml の注射器と 18g の針を使用して、各溶液をクイックシールチューブに順に重ねます(60%ヨージキ
スノール 5ml、40%ヨージキスノール 5ml、25%ヨージキスノール 6ml、15%ヨージキスノール
8ml)。勾配の上に最大 5ml の明確なウイルス上清を慎重に追加します。1 × PBS(または細胞溶解バッ
ファ)を使用してチューブをトップオフします。クイックシールチューブをシールします。10℃の T70i
ローター内で 350,000 g で 90 分間遠心分離。
c. クイックシールチューブをローターから慎重に取り出し、安定したラックに置きます。
注意：
精製中に気泡を避けるように注意してください。
より多くの遠心分離時間が必要な場合は、18℃で 200,000 g で 2 時間遠心分離することもできます。

18. 6
ウイルス収集前に勾配を乱さないようにしてください。
d.10ml の注射器に取り付けられた 18g の針で、60~40%界面のわずか下のクイックシールチューブを突き刺します。針の斜
めは、40%ヨージキスノールステップに 対向して上にある必要があります。 チューブあたり最大 5ml を採取
し、40~25%界面でタンパク質性物質を採取しないようにします。
注意：
特に明記されていない限り、すべての AAV ウイルスは、10℃の T70i ローター内で 350,000 g で 90 分間ヨージキスノール勾
配超遠心分離で精製され、不純物の AAV 製剤から汚染物質を分離します。15%ヨージキスノール工程は、1M NaCl を添加する
と、高分子間のイオン相互作用を不安定化させるのに役立ちます。40%と 25%のステップは、空のカプシドを含む密度の低い
汚染物質を除去するために使用され、60%のステップはゲノムを含むウイリオンのクッションとして機能します。グラデー
ション超遠心分離の数段階の後、ウイルス粒子は濃縮されます。
AAV 濃度（超濾過法）
ウイルス粒子を濃縮するか、いくつかの追加プロセスを妨害しないように、濾過または透析法で勾配画分からヨージキサノー
ル(分子量：1,550 ダルトン)を除去する必要がある場合があります。
a. Pluronic-F68 製剤：
0.1%プラロニック-F68：49.5ml pbs 500µl 10%プラロニック F68
0.01%プロロニック-F68：45ml pbs 5ml 0.1%プロロニック-F68
200mM NaCl 付き 0.001%Pluronic-F68：45ml pbs+5ml 0.01%Pluronic-F68+200mm nacl
0.001%Pluronic-F68（処方緩衝液）：45ml pbs+5ml 0.01%Pluronic-F68。
b. フィルター膜を 0.1%プラロン f68 15ml でバランスさせ、室温で 10 分間インキュベートします。
c. 0.1%プラロニック F68 を除去し、0.01%プラロニック F68 を 15ml 加えます。
d. 遠心分離機は、4℃で 3000 rpm で 5 分間。
e. 濾液を廃棄し、0.001%プラロン f68 15ml を 200mM NaCl PBS で加えます。
f. 遠心分離機は、4℃で 3000 rpm で 5 分間。
g. 濾液を廃棄し、ウイルス精製物を追加します。
h. 遠心分離機は 3500 rpm で 4℃で 8 分間、流れを破棄します。
i. より多くのウイルス浄化を補充し、4°C で 4 分間 3500 rpm スピンし、濾液を廃棄します。必要に応じてこのステップを
繰り返します。
j. P1000 を使用して上下にピペットしてフィルター壁を洗い流し、できるだけ多くのウイルスを回復します。

19. 7
k.濃縮物を 4℃で短期(1 週間未満)、または小さなアリコットで保ち、長期使用のために-80℃で保ちま
す。
注意：
1. ヨージキスノールを除去することは困難です。各遠心分離後にカラムの底または壁に沈着したヨー
ジキスノールを溶液に混合するために、より多くの処方緩衝液とウイルス精製を加え、数回前後に
ピペットします。
2. 最低 500 μ l まで濃縮することをお勧めします。濃縮物の体積が 500 μ l 未満の場合は、製剤緩衝液
で体積を上げます。
rAAV の品質保証
AAV カプシドには VR1 82kDa、VR2 72kDa、VR3 62kDa が含まれており、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ページ）の後に銀染色またはクーマシーブルー染色の方法で検出することができます。Pure
AAV は、図 2 に示すゲネメディで精製された次のウイルスなど、3 つの主要なタンパク質バンドのみを
表示する必要があります。当社は、さまざまなサービスに対して提供する仕様に基づいて、AAV ウイル
スの純度を保証します。
図 2。精製された AAV ウイルスの純度。
rAAV の価測定
AAV 価は、ITR をターゲットにしたプライマーを使用してリアルタイム定量 PCR によって決定されま
す。アンプリコンは SYBR グリーンテクノロジーを使用して検出されます。次に、公知濃度のプラスミ
ド試料の標準曲線と比較して滴定値を求めることを特徴とする。標準試料及び試験対象試料の Ct 値の例
を表 2 に示し、標準曲線を図 3 に示す。

20. 8
表 2。典型的な絶対定量化プロセスにおける標準とサンプルの Ct 値。
標準 コピー番号(vg/ml) Ct 値 1 Ct 値 2 Ct 値 3
標準_1 1010 4.51 4.32 4.42
標準_2 109
7.21 7.61 7.25
標準_3 108
10.97 10.55 10.67
標準_4 107
14.19 14.38 14.35
標準_5 106
17.75 17.58 17.68
AAV サンプル 12.78 12.65 12.81
各グループの平均 Ct 値を Y 軸とし、対応するグループの対数を X 軸とする。試験対象サンプルの平均 Ct 値を式に置き換
え、X=7.45 を取得します。AAV ウイルス価計算式：10x × 40000 vg/ml=107.45 × 40000=1.1 × 1012 vg/ml に代えま
す。
図 3。絶対定量化における標準曲線。
AAV の細胞感染試験
AAV 価検出後、動物実験の前に感染活性を評価する必要があります。293T、CHO などの細胞に感染することによって標的遺
伝子の発現をテストします。モイは 104~105 の範囲で制御されます（モイは感染の多数、すなわち細胞を感染させるために
必要なウイルス粒子の数です）。詳細な AAV 感染プロトコルは AAV ユーザーマニュアルにあります。
AAV の安全な使用
1. AAV 関連実験は、生物安全レベル 2 施設（BL-2 レベル）で実施する必要があります。
2. ラボコート、マスク、手袋を完全に装備し、手と腕を露出させないよう最善を尽くしてください。
3. ウイルス懸濁液を飛ばすのに注意してください。運転中にバイオセーフティキャビネットがウイルスに汚染された場合は、
すぐに 70%アルコールと 1%SDS を含む溶液でテーブルボードをこすります。すべてのチップ、チューブ、培養プレート、ウ
イルスに接触する培地は、廃棄する前に塩素含有消毒液に浸す必要があります。
4. 遠心分離が必要な場合は、遠心チューブを密閉する必要があります。条件が許容されている場合は、遠心分離する前にパラ
フィルムでチューブをシールします。

21. 9
5. AAV 関連の動物実験も BL-2 レベルで実施する必要があります。
6. AAV 関連廃棄物は、処分前に特別に収集しオートクレーブする必要があります。
7. 実験後は消毒剤で手を洗います。
AAV の保存と希釈
AAV の保管
ウイルスは 4°C で短時間（1 週間未満）保存し、受信後に使用することができます。AAV ウイルスは凍
結解凍に敏感であり、凍結解凍を繰り返すと価数が低下するため、アリコットウイルス在庫は到着直後
に-80°C 冷凍庫で保管して長期使用する必要があります。一方、AAV ウイルスが 12 か月以上保存され
ている場合は、使用前にウイルス価の再検出が推奨されます。
AAV の希釈
ウイルス希釈が必要な場合は、ウイルスを氷の水に溶かします。溶解後、ウイルスを培地、無菌 PBS ま
たは生理食塩水と混合し、4°C に保ちます(1 週間以内に使用します)。
注意事項
· 環境の極端な状況(pH、EDTA などのキレート剤、温度、有機溶剤、タンパク質変性剤、強力な洗剤な
ど)への AAV 曝露を避ける。
· 渦、泡の吹き込み、または同様の操作中に AAV サンプルに空気を導入することを避け、タンパク質
の変性を引き起こす可能性があります。
· 繰り返しの凍結と解凍を避けてください。
· 「通常の」プラスチック(特にポリスチレンまたは疎水性プラスチック)に液相で長期間曝露しないよ
うにしてください。ほとんどの AAV ウイルスは非常に粘着性があり、冷凍しないとチューブ、細胞培
養プレート、ピペット先端などの通常のプラスチックにさらされると損失が発生する可能性がありま
す。AAV をシリコン化または低タンパク質結合チューブに保存するのが最善です。プラロニック F-68
を配合緩衝液で 0.01%~0.1%で使用すると、通常のプラスチックを使用すると、付着が最小限に抑え
られます。
· AAV を低塩溶液に希釈しないようにしてください。AAV2 などのいくつかの AAV 血清型は、低塩溶
液に凝集し、非感染性になります。

22. 10
9
参照
1. アチソン RW、BC カストと WM ハモン。(1965).アデノウイルス関連の欠陥ウイルス粒子。科学 149：754-6。
2. ホッガン MD、NR ブラックロウ、WP ロウ。(1966).さまざまなアデノウイルス製剤に含まれる小さな DNA ウイルスの研究：物理的、生物
学的、および免疫学的特性。Proc Natl Acad Sci U S A 55：1467-74。
3. ワイツマン MD と RM リンデン。(2011).アデノ関連ウイルス生物学。メソッド Mol Biol 807：1-23。
4. Schmidt M、A Voutetakis、S Afione、C Zheng、D Mandikian、JA Chiorini。(2008).アデノ関連ウイルスタイプ 12(AAV12)：シアル
酸およびヘパラン硫酸プロテオグリカンに依存しない伝達活性を持つ新しい AAV 血清型。J Virol 82：1399-406。
5. Gao G、LH Vandenberghe、MR Alvira、Y Lu、R Calcedo、X Zhou、JM Wilson。(2004).アデノ関連ウイルスのクラードはヒトの組織
に広く拡散しています。J Virol 78：6381-8。
6. ヴァンデンバーゲ LH、JM ウィルソン、G ガオ。(2009).遺伝子治療用に AAV ベクターカプシドを調整します。遺伝子 16：311-9。
7. ウズ、アソカンと RJ サムルスキー。(2006).アデノ関連ウイルス血清型：ヒト遺伝子治療のためのベクターツールキット。Mol Ther 14：
316-27。
8. ハウク・ブ、ル・チェン、W・シャオ。(2003).キメラ組換え AAV ベクターの生成と特性評価。モルサー 7：419-25。
9. ラビノウィッツ・ジェ、デ・ボウルズ、SM ファウスト、JG レッドフォード、セ・カニンガム、RJ・サムルスキー。(2004).ウイリオンの
クロスドレッシング：アデノ関連ウイルス血清型のトランスカプシデーションは機能的にサブグループを定義します。J Virol 78：4421-32。
10. チョイ・VW、DM・マッカティ、RJ・サムルスキー。(2005).AAV ハイブリッド血清型：遺伝子送達のための改良されたベクター。Curr
Gene Ther 5：299-310。
連絡先情報
ジェネメディバイオテクノロジー。株式会社。
aav の詳細については、www.genemedi.net/i/aav-packaging をご覧ください。
genemedi 製品の詳細および PDF 形式のマニュアルをダウンロードするには、当社の web サイト：
www.genemedi.net をご覧ください。
追加情報または技術支援については、お電話またはメールでお問い合わせください。
世界中で：86-21-
50478399 ファックス：
86-21-50478399
電子メール：support@genemedi.net
©2018 ジェネメディバイオテクノロジー。株式会社全著作権所有。

23. About GeneMedi
GeneMedi specializes in creating superior antibody, protein, and vector-based
bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions.
At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field
of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of
unparalleled expertise in the following areas:
Innovative Antigen Design and Robust Assay Development
Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens
and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical
and research settings.
Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUSTM for accelerated
antibody discovery and LIBRATM for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize
molecules with optimal stability and functionality.
Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXTTM platform is our answer to the industry's
need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking
gene therapy approaches.
High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale
production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent
quality controls.
Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on
AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification
techniques to guarantee vector efficacy and integrity
Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for
comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic
accuracy.
Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic
antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions
can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry.
Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability
Scalable Production and Uncompromising Quality
Comprehensive Solutions for Diverse Application Needs
GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics
and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner.
Website: https://www.genemedi.net
Contact Email: support@genemedi.net | sales@genemedi.net

24. 1
생산 프로토콜
아데노 관련 바이러스(AAV)
aav 도입
아데노 관련 바이러스(AAV)는 인간과 다른 영장류 종에 감염되는 작은 단일 스란드 dna 바이러스이다. 현재
aav 는 질병을 유발한다는 것을 알지 못하고 매우 가벼운 면역 반응만 유발한다. 파르보바이러스의 일원으로서
야생형 aav 는 복제를 완료하기 위해 아데노바이러스나 헤르페스바이러스의 도움을 필요로 하는데 , 이것이 바
로 아데노 관련 바이러스라고 불리는 이유[1,2]이다. 야생형 aav2 게놈은 바이러스 rep 유전자와 cap 유전자
(각각 복제 유전자와 capside 유전자를 코딩)로 구성되어 있으며, 그 옆에는 복제 및 포장에 필요한 모든 cis
작용 원소를 포함하는 역말 반복(ITRs)이 있다. 전형적인 aav2 의 게놈은 약 4800bp 이며, 두 개의 상류 및 하
류 개방 읽기 프레임(ORFs)으로 구성되어 있으며, 두 개의 반전 단말기 반복(ITR) 사이에 rep 와 cap 를 포함
한다. 상호 보완 dna 스란드의 합성은 itr 가 필요하며, rep 와 cap 는 aav 바이러스 주기의 필수 단백질
rep78, Rep68, Rep52, rep40 및 포위된 단백질 vp1, VP2, VP3 등을 포함한 다양한 단백질로 번역될 수 있
다. [3]
현재의 재조합 aav(rAAV) 벡터는 itrs 사이의 모든 바이러스 게놈을 길이가 5 킬로베이스 미만의 전사 카세트
로 대체함으로써 생성된다. 그 후 결과된 구조물은 다른 두 개의 플라즈미드와 공동으로 발현된다: 1) 트랜스에
서 rep 유전자와 cap 유전자를 제공하는 aav-rc 플라즈미드(itr/transgene 카세트와 별도)와 2) 아데노바이
러스 유전자를 보관하는 aav 유전자 플라즈미드. aav-293 세포는 트랜스에서도 e1a 단백질을 제공하기 때문
에 포장 세포라인으로 사용됩니다. rep 유전자와 cap 유전자를 수정함으로써 과학자들은 재조합 aav 감염을
특정 조직으로 유도하기 위해 혈청 유형을 제어할 수 있다. 이 3 플라즈드 공동 전염 시스템은 aav 생산 과정에
서 아데노바이러스의 필요성을 해방시켜 정화 과정을 크게 단순화한다.
지금까지 12 개의 aav 의 혈청 유형이 그것들의 독특한 특징과 열대성을 가지고 묘사되었다[4]. 높은 안전성,
낮은 면역 원성, 장기적인 외생 유전자의 발현에 관하여 aav 는 체내 유전자 기능 연구에 가장 좋은 유전자 전
달 도구로 여겨진다.
지난 수십 년 동안 많은 aav 혈청형이 변동적인 열대성을 가지고 있다는 것을 확인했다. 지금까지 12 개의 aav
혈청형과 100 개가 넘는 aav 변종이 아데노바이러스 주식이나 인간/비인간 영장류 조직에서 분리되었다. 서로
다른 aav 혈청형은 서로 다른 열대성을 나타내며 서로 다른 세포 유형과 조직 유형에 감염된다. 따라서 적절한
aav 혈청형을 선택하는 것은 표적 세포나 조직에 유전자를 전달하는 데 매우 중요하다.
raav 는 특정 세포나 조직 유형에 대한 자연 열대성의 전시로 인해 상당한 관심을 받았다 . 인간과 다른 영장류
에서 매우 유행하며, 몇 가지 aav 혈청형이 분리되었다. AAV2, AAV3, AAV5, aav6 은 인간 세포에서 발견되
었고, aav1, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, aav12 는 비인간 영장류 샘플에서 발견되었다
[5,6]. 서로 다른 혈청형 간의 게놈 분산은 바이러스 캡시드의 초변수 영역(HVRs)에 가장 집중되어 있으며, 이
는 그 조직의 열대성을 결정할 수 있다. 바이러스 카피드 외에도 aav 매개체의 조직 열대성은 세포 표면 수용
체, 세포 흡수, 세포 내 가공, 매개체 게놈의 핵 전달, 코팅 해제, 두 번째 사슬 DNA 전환에 의해 영향을 받는다.

25. 2
표적 조직에 대한 aav 의 감염 효율성과 특이성을 더 잘 향상시키기 위해, 과학자들은 바이러스 캡시드를 유전
자적으로 개조하고, 혈청형 사이에 도메인이나 아미노산을 교환함으로써 모자이크 매개체를 생성하여 접합성
aav 를 만들 수 있으며, 이는 연구자들이 특정 혈청형 세포를 특별히 표적하여 유전자를 효과적으로 전환하고
발현할 수 있게 할 수 있을 것이다.
프로토콜 개요
재조합 aav 생산에 대한 구조적 개요는 그림 1 과 같다. 첫 번째 단계는 관심 유전자(GOI)를 적절한 질체 매개
체로 복제하는 것이다. 대부분의 응용 프로그램의 경우 관심 있는 cdna 는 벡터를 포함하는 itr/mcs 중 하나로
복제됩니다. 이러한 벡터에 존재하는 반전 단말기 반복(ITR) 서열은 aav 복제 및 포장에 필요한 모든 cis 작용
요소를 제공한다.
재조합 발현 질립은 aav-293 세포에 아데노바이러스 유전 유전자를 가진 phelper 와 aav-rc(aav2 복제 및
capsid 유전자를 가진 paav-rc)와 함께 전염되어 aav-293 세포에서 aav 의 복제 및 포장에 필요한 모든 트랜
스작용 인자를 공급한다. 재조합 aav 바이러스 입자는 감염된 aav-293 세포에서 제조되어 다양한 포유류 세
포를 감염시키는 데 사용될 수 있다.
숙주 세포가 감염되면, 유전자 발현을 위해 단일 바이러스는 이중 바이러스로 전환되어야 한다. aav 바이러스
는 상호 보완 사슬을 합성하기 위해 세포 복제 인자에 의존한다. 이러한 전환은 재조합 유전자 발현의 제한적인
단계이며, 아데노바이러스 중복 감염이나 캠프테신이나 부티산나트륨과 같은 에토포시드를 사용하여 가속화될
수 있다. 그러나 이러한 약제들은 표적 세포에 독성이 있으며, 세포에 남기면 표적 세포를 죽일 수 있기 때문에
에토포시드의 사용은 단기간 사용이나 바이러스 적사를 얻을 때 권장된다. 일반적으로 aav 게놈은 세포의 안정
적인 유전자 발현을 위한 고분자량의 concatemer 를 형성한다.
그림 1. aav 포장 실험 흐름도.

26. 3
실험 재료
바이러스 포장 시스템
유전자 과발현, rna 간섭 및 crispr/cas9 유전자 토너먼트를 위한 엔지니어링 서열로 복제할 수 있는 aav 벡터(pAAV)를 포함한 재조합 선체 관
련 바이러스(rAAV)를 포장하는 데 사용되는 세 질자 체계와 질자 pAAV-rc 및 phelper 를 포장한다.
박테리아 주
E. 대장주 dh5 는 셔틀과 핵심 벡터의 증폭에 사용된다.
포장 세포 라인
aav-293 은 raav 의 초기 생산, 증폭 및 적정을 용이하게 할 수 있는 바이러스 포장 세포라인이다. 293 세포계에서 유래하여 플라크 측정을 위해
만들어진 이 세포계는 처리하기 쉬운 전염 숙주로 확인되었다.
aav-293 의 완전한 성장 배양기는 Dulbecco 의 변형 독수리 배양기(DMEM)로, 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트레프토마이신
(Pen-Strep)을 보충한다. 지속적인 배양의 경우, 세포는 적절한 특성을 유지하기 위해 70%의 합류를 초과해서는 안 된다. 일반적으로 세포 통행
번호부터 시작하면 30 개의 통행 이내에 최적의 결과를 얻을 수 있다. 일단 도달하면 예상치 못한 돌연변이와 불건강한 성장이 발생할 경우 다른
냉동 주식에서 새로운 문화를 시작하는 것이 가장 좋다. 따라서 자신의 aav-293 동결 주식을 은행하는 것은 실험의 무결성과 연속성을 보장하는
데 매우 중요하다. 대수 단계의 세포를 얼어붙이면 해동 후의 생존력이 향상된다.
알림:
세포를 건강한 상태로 유지하고 aav 의 생산 효율을 향상시키기 위해, 우리의 genemedi 항 mycoplasma 시약 CurePlasmaTM 를 사용하는 것
이 좋습니다.
기타 재료 및 시약
관심 유전자 파운드 수
프
석가와 석가로스 카나
마이신 암피실린
70 및 100% 에탄올 무균
pbs 요오디톡올
플루로닉-f68 염소
표백제
dna 젤기구 및 전원 공급 장치 II 등급 생물안전장
37℃ 궤도 흔들기

27. 4
37℃ 박테리아 인큐베이터
37℃, 5% CO2 인큐베이터
15ml 및 50ml 원추관
25cm2 및 75cm2 조직 배양 병리 세포 스
크래퍼
건아이스/메탄올 목욕 액
질소 탱크
저속 흔들리기 원심기 마이크로원심기
원심분리관 (뚜껑이 있는 두벽 폴리카보네이트 튜브)
raav 포장 및 농도
플라스미드의 구축 및 증폭
구성된 raav 매개체 플라스미드와 핵심 매개체는 dh5ɑ 에서 증폭되어야 하며, maxi-prep 키트로 정화하여 내독소를 제거해야
한다(주의: qiagen 플라스미드 maxi 키트가 권장된다). 바이러스 포장은 농도가 1μg/μl 이상이고 a260/a280 비율 범위가 1.7-
1.8 사이에 있어야 한다. 플라스미드의 품질이 제품 바이러스의 전염 효율과 적사에 영향을 줄 수 있다는 점에 주의하십시오.
참고:
벡터를 빠르고 효율적으로 구축하기 위해 genemedi-cloneasytm 1 단계 복제 키트(cat.gm-gc-01/02/03)를 사용하는 것이 강
력하다.
바이러스 플라스미드를 aav-293 포장세포로 전염시키다
a. aav-293 세포는 전염되기 전에 50%-70%의 단층 형태의 합류점에 도달하기 위해 적어도 하루 전에 준비되어야 한다.
b. 전염당일, dmem 은 37℃의 물욕에서 사전에 따뜻하게 해야 하며, lipogenetm 전염제 시약은 실온에 균형을 맞추고 사용
하기 전에 섞어야 한다.
c. 다음 표 1 에 따라 10cm 의 접시를 사용하여 각 반응에 대해 바이러스 플라스미드를 제조한다: 표 1. 전염
에 필요한 플라스미드 및 전염시약
d. DMEM에서 플라스미드와 트랜스펙션 시약을 혼합한 후, 미리 접종한 AAV-293 세포에 방울 단위로 첨가하십시오. 37, 5%
CO 조건에서 배양하고 6시간 후에는 완전 배양 배지로 갈아주십시오.
구성 요소 금액

28. 5
참고:
1. 상기 전염 시약의 상세한 프로토콜은 genemedi lipogenetm 전염 시약 사용자 설명서를 참조할 수 있다.
2. 세포는 전염되기 전에 사용하기 위해 건강한 성장 상태에 있어야 한다.
aav 수집
a. 전염 후 약 72 시간 후에 세포 스크레이퍼로 10cm 판에서 세포를 수확한다.
b. 세포 펠릿을 수집하기 위해 5 분 동안 1,500 g 에서 세포를 회전합니다. 세포 알갱이를 0.5ml 분해 완충기(10mm tris-
hcl(pH8.5), 150mm nacl)에 다시 부유시킨다. 세포 펠릿을 드라이 아이스/에탄올 욕조와 37 ° c 수욕조를 통해 3 회 동
결/해동시키고 조분해액을 얻는다.
c. 조분해액을 3,000g 로 10 분 동안 회전하세요. 수확한 raav 를 포함한 상청액 부분을 수집합니다. 바이러스를 -80℃로 유지
하세요.
aav 정화
a. 시약 제제:
1×pbs-mk 완충기: mgcl2 의 52.6mg 와 kcl 의 29.82mg 를 200ml 의 최종 부피로 1×pbs 에 용해시킨다. 1m 의
nacl/pbs-mk 완충기: 100ml 의 최종 부피로 1×pbs-mk 완충기에 nacl 의 5.84g 를 용해시킵니다.
참고: 완충기는 0.22-μm 필터를 통해 살균되고 4℃에서 저장해야 한다.
15% 요오디탄올: 60% 요오디탄올 4.5ml 과 nacl/pbs-mk 완충량 13.5ml 을 혼합한다;
25% 요오디탄올: 60% 요오디탄올 5ml 과 1x pbs-mk 완충량 7ml 과 30μl 의 페놀레드 혼합; 40% 요오디탄올:
60% 요오디탄올 6.7ml 과 1x pbs-mk 완충량 3.3ml 을 혼합한다;
60% 요오디탄올: 60% 요오디탄올 10 밀리리터와 페놀레드 45 μl 을 섞으십시오.
b. 10ml 주사기와 18g 의 바늘을 사용하여 각 용액을 60% 요오디탄올 5ml, 40% 요오디탄올 5ml, 25% 요오디탄올 6ml,
15% 요오디탄올 8ml 순서대로 빠른 밀봉 튜브에 겹쳐라. 그라데이션 위에 최대 5 밀리리터의 명확한 바이러스 상청액을 조
심스럽게 추가하세요. 1×PBS(또는 세포 분해 완충기)를 사용하여 튜브를 위에 올립니다. 빠른 밀봉 튜브를 밀봉하다. 10℃
에서 t70i 로터에서 90 분 동안 350,000 g 에서 원심분리기.
c. 조심스럽게 로터에서 빠른 밀봉관을 꺼내 안정된 선반에 놓으세요.
참고:
정화 과정에서 거품을 피하도록 조심하세요.
더 많은 원심분리 시간이 필요하다면, 18℃에서 200,000 g 에서 2h 동안 원심분리할 수 있습니다.

29. 6
바이러스를 수집하기 전에 그라데이션을 방해하지 않도록 해야 합니다.
d. 10ml 주사기에 부착된 18g 의 바늘로 60-40% 인터페이스 아래의 빠른 밀봉 튜브를 뚫어라. 바늘의
기울기는 40% 요오드 옥살올 계단을 향해 위로 올라가야 한다. 튜브당 최대 5ml 을 수집하고 40-
25% 계면에서 단백질 물질을 수집하지 않습니다.
참고:
별도의 규정이 없는 한, 모든 aav 바이러스는 10℃의 t70i 로터에서 350,000 g 에서 90 분 동안 요오드
록탄올 그라데이션 초원심으로 정화되어 불순한 aav 제제물에서 오염물질을 분리한다. 15% 요오드 옥살
올 단계는 1m 의 nacl 을 첨가하여 대분자 간의 이온 상호작용을 불안정시키는 데 도움이 된다. 40%와
25%의 단계는 빈 캡시드를 포함한 밀도가 낮은 오염물질을 제거하는 데 사용되며, 60%의 단계는 게놈을
함유한 바이러스에 대한 패션으로 작용한다. 그라데이션 초원심의 몇 단계를 거친 후에 바이러스 입자는
풍부해진다.
aav 농도(초여과법)
바이러스 입자를 농축하거나 일부 추가 과정을 방해하지 않도록 여과나 투석 방법으로 그라데이션 분수에
서 요오디탄올(분자량: 1,550 달톤)을 제거해야 할 수 있다.
a. pluronic-f68 제조:
0.1% Pluronic-F68: 49.5ml pbs + 500µl 10% Pluronic-F68
0.01% 플러로니크-f68: 45ml pbs + 5ml 0.1% 플러로니크-f68
200mm nacl 을 포함한 0.001% Pluronic-F68: 45ml pbs + 5ml 0.01% Pluronic-F68 +
200mm nacl 0.001% Pluronic-F68 (배합 완충기): 45ml pbs + 5ml 0.01% Pluronic-
F68.
b. 필터막을 15ml 의 0.1% 플루론 f68 으로 균형을 맞추고 실온에서 10 분 동안 부화시킨다.
c. 0.1%의 Pluronic F68 을 제거하고 0.01%의 Pluronic F68 을 15ml 을 첨가합니다.
d. 4℃에서 5 분 동안 3000 rpm 에서 원심분리기.
e. 여과액을 버리고 200mm nacl pbs 0.001% pluronic f68 15ml 을 추가합니다.
f. 4℃에서 5 분 동안 3000 rpm 에서 원심분리기.
g. 여과액을 버리고 바이러스 정화물을 추가하세요.
h. 4℃에서 8 분 동안 3500 rpm 에서 원심분리기는 흐름을 통해 버리십시오.
i. 더 많은 바이러스 정화를 보충하고 4 ° C 에서 4 분 동안 3500 rpm 를 회전, 여과물을 버리십시오. 필
요에 따라 이 단계를 반복합니다.
j. 가능한 한 많은 바이러스를 회복하기 위해 필터 벽을 씻어내기 위해 p1000 을 이용합니다.

30. 7
k. 단기간 (1 주일 미만)에 4℃에서 농축물을 유지하거나 작은 aliquots 에서 장기간 사용을 위해 -80℃에
서 유지하십시오.
참고:
1. 요오드산올을 제거하는 것은 어렵다. 각 원심분리가 진행되면 기둥의 바닥이나 벽에 침착한 요오디탄
올을 용액에 혼합하기 위해 더 많은 배합완충과 바이러스 정화를 추가하고 몇 번이나 앞뒤로 피펫을
추가한다.
2. 최소 500 µl 까지 집중하는 것이 권장됩니다. 정광물 부피가 500μl 미만인 경우, 배합완충을 사용하여
부피를 가져옵니다.
raav 품질 보증
aav capsid 는 vr1 82kda, vr2 72kda, vr3 62kda 를 함유하고 있으며, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
(페이지)을 이용하여 은염색이나 쿠마시 블루 염색을 통해 검출할 수 있다. 순수 aav 는 그림 2 와 같은
genemedi 에서 순화된 다음 바이러스와 같은 세 가지 주요 단백질 밴드만 표시해야 한다. 우리는 다양한
서비스에 제공하는 규격에 따라 aav 바이러스의 순도를 보장합니다.
그림 2. 정화된 aav 바이러스의 순도
raav 적사 검사
aav 적사는 itr 을 대상으로 하는 프라이머를 사용하여 실시간 정량 pcr 로 결정된다. 증폭기는 sybr 녹색
기술을 사용하여 검출됩니다. 그런 다음 알려진 농도의 플라즈미드 샘플의 표준 곡선과 비교하여 적사 값
을 결정한다. 표준 샘플과 테스트할 샘플의 ct 값의 예는 표 2 에 나와 있고 표준 곡선은 그림 3 에 나와 있
다.

31. 8
표 2. 표준 및 샘플의 ct 값은 전형적인 절대 정량화 과정에서.
표준 복사 번호(vg/ml) ct 값 1 ct 값 2 ct 값 3
표준 _1 1010 4.51 4.32 4.42
표준 _2 109
7.21 7.61 7.25
표준 _3 108
10.97 10.55 10.67
표준 _4 107
14.19 14.38 14.35
표준 _5 106
17.75 17.58 17.68
aav 샘플 12.78 12.65 12.81
각 그룹의 평균 ct 값을 y 축으로 설정하고, 해당 그룹의 대수를 x 축으로 설정합니다. 테스트할 샘플의 평균 ct 값을 공식으로 대
체하여 x=7.45 를 얻습니다. aav 바이러스 적사 계산 공식을 대체하십시오: 10x×40000 vg/ml = 107.45×40000 =
1.1×1012 vg/ml.
그림 3. 절대 계량화의 표준 곡선.
aav 세포 감염 테스트
aav 적사 검사 후, 동물 실험 전에 감염 활성도를 평가해야 한다. 293t, CHO 와 같은 세포에 감염되어 표적 유전자의 발현을 검
사한다. moi 는 104 에서 105 의 범위를 통제할 것입니다 (moi 는 감염의 다중성, 즉 세포를 감염시키는 데 필요한 바이러스 입자
의 수입니다). 상세한 aav 감염 프로토콜은 aav 사용자 설명서에서 확인할 수 있습니다.
aav 의 안전한 사용
1. aav 관련 실험은 생물 안전 2 급 시설(bl-2 급) 내에서 진행되어야 한다.
2. 실험실 코트, 마스크, 장갑을 완전히 갖추고 손과 팔을 노출하지 않도록 최선을 다해 주십시오.
3. 바이러스 현액을 뿌리지 않도록 조심하세요. 만약 생물 안전 캐비닛이 작동 중에 바이러스에 오염되면, 즉시 70% 알코올과
1% sds 를 포함한 용액으로 탁자 보드를 닦아라. 모든 첨단, 튜브, 배양판, 바이러스와 접촉하는 매질은 폐기하기 전에 염소를 함
유한 소독액에 담그어야 한다.
4. 원심분리가 필요하다면 원심분리기 튜브를 단단히 밀봉해야 한다. 조건이 허용되면 원심분리하기 전에 파라필름으로 튜브를
밀봉합니다.

32. 9
5. aav 관련 동물 실험도 bl-2 수준에서 진행해야 한다.
6. aav 관련 폐기물은 처리하기 전에 특별히 수집하고 오토클레이션해야 한다.
7. 실험 후 세정제로 손을 씻어라.
aav 의 저장 및 희석
aav 저장
바이러스는 수신 후에 사용하기 전에 짧은 시간 (일주일 미만)에 4 ° c 에서 저장될 수 있습니다. aav 바이
러스는 얼음-해동에 민감하며, 얼음-해동이 반복되면 적량이 떨어지기 때문에, 알리코트 바이러스 재고는
도착하면 즉시 -80°C 냉동고에 보관되어 장기간 사용해야 한다. 만약 aav 바이러스가 12 개월 이상 저장
되어 있다면, 사용하기 전에 바이러스 적정을 재검사하는 것이 좋습니다.
aav 희석
바이러스 희석이 필요하다면 바이러스를 얼음물에 용해시킨다. 용해한 후, 바이러스를 중간, 무균 pbs 또
는 생리식염수 용액과 섞어, 4°C 에서 유지하십시오 (일주일 이내에 사용하십시오).
주의사항
· aav 가 환경의 극단적인 환경(pH, edta 와 같은 킬레이트제, 온도, 유기용매, 단백질 변성제, 강한 세제
등)에 노출되는 것을 피합니다.
· 소용돌이, 거품 불기 또는 유사한 작업 중에 aav 샘플에 공기를 도입하는 것을 피하십시오. 이는 단백
질 변성을 초래할 수 있다.
· 반복적인 냉동과 해동을 피하세요.
· 액상에서 장기간 '일반적' 플라스틱(특히 폴리스티렌이나 소수성 플라스틱)에 노출되지 않도록 하십시
오. 대부분의 aav 바이러스는 매우 끈적끈적하며, 파이프, 세포 배양 판, 피켓 끝을 포함한 일반적인 플라
스틱에 노출되면 손실이 발생할 수 있다. 냉동하지 않으면 Aav 를 실리콘화되거나 낮은 단백질 결합관에
저장하는 것이 좋다. Pluronic f-68 은 0.01%-0.1%의 배합 완충기에서 사용되는 일반적인 플라스틱을
사용하는 경우 점착을 최소화합니다.
· Aav 를 저염용액으로 희석시키는 것을 피하세요. Aav2 와 같은 일부 aav 혈청형은 저염용액에 집결되
어 전염성이 없다.

33. 10
9
참조
1. 아치슨 rw, bc casto 와 wm hammon. (1965). 아데노바이러스와 관련된 결함 바이러스 입자 과학 149:754-6.
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역학적 특성. Proc natl acad si u s a 55:1467-74.
3. 와이츠만 md 와 rm linden. (2011). 아데노 관련 바이러스 생물학. 방법 mol biol 807:1-23.
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파란 프로테오글리칸과 무관한 전도 활성을 가진 새로운 aav 혈청형. J Virol 82:1399-406.
5. Gao G, LH Vandenberghe, MR Alvira, Y Lu, R Calcedo, x zhou, jm wilson. (2004). 아데노 관련 바이러스의 클라이드는 인체 조직에 널
리 퍼져 있다. J Virol 78:6381-8.
6. 반덴버그 lh, jm wilson, g gao. (2009). 유전자 치료를 위한 aav 매개체 캡시드를 맞추다. 유전자 16:311-9.
7. Wu Z, a asokan 과 rj samulski. (2006). 아데노 관련 바이러스 혈청형: 인간 유전자 치료를 위한 벡터 도구 키트. 14:316-27.
8. Hauck B, l 진과 w xiao. (2003). 접합 재조합 aav 매개체의 생성 및 특성 7:419-25.
9. 라비노위츠 je, 드 볼스, SM Faust, JG Ledford, se cunningham, rj samulski. (2004). 바이러스의 교차 착용: 아데노 관련 바이러스 혈청형
의 전환은 아군을 기능적으로 정의한다. J Virol 78:4421-32.
10. 조이 vw, dm 맥카티, rj samulski. (2005). aav 하이브리드 혈청형: 유전자 전달을 위한 개선된 매개체. curr 유전자 5:299-310.
연락처 정보
제네메디 바이오테크놀로지 Inc.
aav 에 대한 자세한 내용은 www.genemedi.net/i/aav-packaging 를 참조하십시오.
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34. About GeneMedi
GeneMedi specializes in creating superior antibody, protein, and vector-based
bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions.
At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field
of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of
unparalleled expertise in the following areas:
Innovative Antigen Design and Robust Assay Development
Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens
and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical
and research settings.
Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUSTM for accelerated
antibody discovery and LIBRATM for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize
molecules with optimal stability and functionality.
Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXTTM platform is our answer to the industry's
need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking
gene therapy approaches.
High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale
production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent
quality controls.
Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on
AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification
techniques to guarantee vector efficacy and integrity
Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for
comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic
accuracy.
Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic
antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions
can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry.
Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability
Scalable Production and Uncompromising Quality
Comprehensive Solutions for Diverse Application Needs
GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics
and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner.
Website: https://www.genemedi.net
Contact Email: support@genemedi.net | sales@genemedi.net

35. 1
производственный протокол
адено-ассоциированный вирус (аав)
введение aav
Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой одноцепочечный вирус ДНК, заражающий
человека и некоторые другие виды приматов. В настоящее время aav не знает, что вызывает заболевание и
вызывает только очень легкие иммунные ответы. как член семейства parvoviridae, aav дикого типа нуждается в
помощи аденовируса или герпесвируса для завершения дублирования, поэтому его называют
аденоассоциированным вирусом [1,2]. геном aav2 дикого типа состоит из генов вирусного репликации и капа
(кодирующих гены репликации и капсида соответственно), окруженных перевернутыми терминальными
повторениями (ITRs), которые содержат все элементы цис-действия, необходимые для репликации и упаковки.
геном типичного aav2 составляет около 4800 б.п., состоящего из двух открытых кадров чтения (orf) вверх и вниз
по течению, которые находятся между двумя перевернутыми терминальными повторениями (ITR), состоящими из
rep и cap. Itr необходим для синтеза дополнительной цепочки ДНК, в то время как rep и cap могут
трансформироваться в различные белки, включая незаменимый белок цикла вируса aav rep78, Rep68, Rep52, rep40
и оболоченный белок vp1, VP2, VP3 и т. д. [3].
Нынешние рекомбинантные векторы aav (rAAV) генерируются путем замены всего вирусного генома между itrs
транскрипционной кассетой длиной менее 5 килобазов. полученная конструкция затем экспрессируется совместно
с двумя другими плазмидами: 1) плазмидой aav-rc, которая обеспечивает гены rep и cap в трансе (отдельно от
кассеты itr/трансгена), и 2) плазмидой aav-вспомогательной, которая удерживает аденовирусные вспомогательные
гены. Клетки aav-293 используются в качестве линии упаковочных клеток, поскольку они также обеспечивают
белок e1a в трансе. модифицируя гены rep и cap, ученые могут контролировать серотипы, направляя
рекомбинантную AAV-инфекцию к определенным тканям. эта система ко-трансфекции 3-плазмиды освобождает
потребность в аденовирусе во время производства AAV, что значительно упрощает процесс очистки.
на сегодняшний день описано в общей сложности 12 серотипов aav со своими уникальными чертами и
тропизмами [4]. Что касается высокой безопасности, низкой иммуногенности, долгосрочной экспрессии
экзогенных генов, aav считается лучшим инструментом доставки генов для исследования функции генов in vivo.
За последние десятилетия многочисленные серотипы AAV были идентифицированы с переменным тропизмом. на
сегодняшний день 12 серотипов AAV и более 100 вариантов AAV были выделены из запасов аденовирусов или из
тканей приматов человека/нечеловека. разные серотипы aav проявляют разные тропизмы, заражая разные типы
клеток и типов тканей. поэтому выбор подходящего серотипа AAV имеет решающее значение для доставки генов
клеткам или тканям-мишеням.
благодаря проявлению естественного тропизма в отношении определенных типов клеток или тканей, raav привлек
значительное внимание. Чрезвычайно распространенным среди людей и других приматов, было выделено
несколько серотипов aav. AAV2, AAV3, AAV5, aav6 были обнаружены в клетках человека, а aav1, AAV4, AAV7,
AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, aav12 в образцах нечеловеческих приматов [5,6]. дивергенция генома между
различными серотипами наиболее сосредоточена на гиперпеременных областях (HVRs) капсида вируса, которые
могут определять их тканевые тропизмы. В дополнение к вирусному капсиду, на тропизмы тканей векторов aav
также влияют рецепторы поверхности клеток, поглощение клеток, внутриклеточная обработка, ядерная доставка
генома вектора, разъем покрытия и конверсия ДНК второй цепи [7].

36. 2
Чтобы лучше повысить эффективность инфекции и специфичность aav к мишеням тканей, ученые генетически
модифицировали вирусный капсид и генерировали мозаичные векторы для создания химерных aav путем обмена
доменами или аминокислотами между серотипами [8,9], что может позволить исследователям специально нацелить
клетки с определенными серотипами на эффективную трансдукцию и экспрессию генов в локализованной области [10].
обзор протокола
Схематический обзор производства рекомбинантных AAV показан на рисунке 1. первым шагом является клонирование
интересующего гена (GOI) в соответствующий плазмидный вектор. для большинства приложений интересующая КДНК
клонируется в один из ITR/MCS, содержащих векторы. последовательности перевернутого терминального повторения
(ITR), присутствующие в этих векторах, обеспечивают все элементы цис-действия, необходимые для репликации и
упаковки aav.
рекомбинантная экспрессионная плазмида ко-трансфекцируется в клетки aav-293 с фелпером (несущими гены,
происходящие от аденовируса) и paav-rc (несущими гены репликации aav2 и капсидов), которые вместе обеспечивают
все факторы транс-действия, необходимые для репликации aav-293. и упаковка в клетках aav-293. Рекомбинантные
вирусные частицы AAV получают из инфицированных клеток AAV-293, а затем могут быть использованы для
заражения различных клеток млекопитающих.
при заражении клетки-хозяина одноцепочечный вирус должен быть преобразован в двуцепочечный для экспрессии
гена. вирус AAV опирается на факторы клеточной репликации для синтеза дополнительной цепи. эта конверсия
является ограничивающим шагом в экспрессии рекомбинантных генов и может быть ускорена с помощью
аденовирусной суперинфекции или этопозидов, таких как камптотецин или бутират натрия. тогда как эти агенты
токсичны для клеток-мишеней и могут убить клеток-мишени, если их оставят на клетках, поэтому использование
этопозидов рекомендуется только для краткосрочного использования или при получении вирусных титров. обычно
геном aav образует высокомолекулярные конкатемеры, которые отвечают за стабильную экспрессию генов в клетках.
рисунок 1. Блок-схема эксперимента по упаковке aav.

37. 3
экспериментальные материалы
система упаковки вирусов
Трехплазмидная система используется для упаковки рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который
включает в себя вектор aav (pAAV), который можно клонировать в инженерные последовательности для
сверхэкспрессии генов, интерференции РНК и нокаутов генов crispr/cas9, а также упаковки плазмиды pAAV-rc и
фелпер.
бактериальный штамм
Штамм E. coli dh5ɑиспользуется для усиления челночных и магистральных векторов.
линия упаковочных ячеек
Aav-293-это линия упаковочных клеток вируса, которая может облегчить первоначальное производство, амплификацию
и титрование raav. Эта клеточная линия, возникшая из клеточной линии 293 и созданной для анализа бляшек, была
идентифицирована как простой в обращении хозяин трансфекции.
полной средой для роста aav-293 представляет собой модифицированную орлиную среду (дмем) дулбекко,
добавленную 10% сывороткой крови плода крупного рогатого скота (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина (пен-
стреп). для непрерывной культуры клетки не должны превышать 70% слияния для поддержания надлежащих
характеристик. обычно, начиная с клеточного прохода номер один, оптимальные результаты можно получить в течение
30 проходов. после достижения лучше начать новую культуру из другого замороженного запаса на случай каких-либо
неожиданных мутаций и нездорового роста. Таким образом, банкирование собственных замороженных акций aav-293
очень важно для обеспечения экспериментальной целостности и преемственности. замерзшие клетки на
логарифмической фазе повысят жизнеспособность после оттаивания.
уведомления:
Для поддержания клеток в более здоровом состоянии и повышения эффективности производства aav рекомендуется
использовать наш антимикоплазменный реагент генемеди куреплазматм.
другие материалы и реагенты
Интересный ген
фунт бульон
агар и агароза
канамицин
ампициллин
70 и 100%
этаноловый
стерильный pbs
йодиксанол
хлорный
отбеливатель
плюроник-ф68
Гелевые аппараты и источники питания
ДНК шкафы биобезопасности II класса
37 орбитальный шейкер
℃

38. 4
37 инкубатор бактерий 37
℃
, 5% co2 инкубатор
℃
Конические трубки 15 и 50 мл
Колбы для культивирования тканей
размером 25 и 75 см2 для скребок
клеток
резервуар для жидкого
азота для сухого
льда/метаноловой
ванны
низкоскоростная центрифуга с
качанием ковша микроцентрифуга
центрифужная труба (толстостенная поликарбонатная труба с крышкой)
упаковка и концентрация raav
построение и усиление плазмид
сконструированные плазмиды вектора raav и магистральный вектор должны быть амплифицированы в dh5 ɑи очищены
набором maxi-prep для удаления эндотоксинов (примечание: рекомендуется набор maxi плазмиды киагена). Для
упаковки вируса требуется концентрация более 1 мкг/мкл и диапазон соотношения a260/a280 от 1,7 до 1,8. пожалуйста,
будьте осторожны, что качество плазмид повлияет на эффективность трансфекции и титр вирусов продукта.
Примечание:
Для быстрого и эффективного построения векторов настоятельно рекомендуется использовать комплект
одноступенчатого клонирования genemedi-cloneasytm (Cat. GM-GC-01/02/03).
трансфекция вирусных плазмид в упаковочные клетки aav-293
a. Клетки aav-293 должны быть приготовлены как минимум за день до того, как они достигнут слияния монослойной
морфологии 50%-70% до трансфекции.
b. В день трансфекции DMEM необходимо предварительно подогреть в водяной ванне 37 , а реагент для
℃
трансфекции липогенетма должен быть сбалансирован до комнатной температуры и перемешит его перед
использованием.
d.
c. Для приготовления вирусных плазмид для каждой реакции с использованием 10-см чашки следуйте приведенной н
иже таблице 1:
смешайте плазмиды с трансфекционным реагентом в dmem и добавьте капли в предварительно посеянные клетки aav-
293. Инкубируйте при 37 , 5% CO2 и освежите полной средой в течение 6 часов.
℃

39. 5
Примечание:
1. Подробный протокол трансфекционного реагента можно ссылаться на руководство пользователя
трансфекционного реагента genemedi lipogenetm.
2. клетки должны находиться в здоровом состоянии роста для использования до трансфекции.
коллекция aav
a. примерно через 72 часа после трансфекции соберите клетки с 10-сантиметровой пластины с помощью
скребка для клеток.
b. вращайте клетки в 1500 г в течение 5 минут, чтобы собрать клеточные гранулы. повторное
суспензирование клеточной гранулы в 0,5 мл буфера для лиза (10 мм трис-гкл (ph8,5), 150 мм накл).
заморозить/разморозить клеточную гранулу 3 раза в ванне сухого льда/этанола и водяной ванне 37 ° C
для получения сырого лизиста.
c. Поверните сырой лизит в 3000 г в течение 10 минут. соберите фракцию супернатанта, которая содержит
собранный раав. Сохраняйте вирус при -80 .
℃
очистка аав
a. Препараты реагентов:
1 × pbs-mk буфер: растворите 52,6 мг mgcl2 и 29,82 мг ккл в 1 × pbs в конечном объеме 200 мл. 1 м
nacl/pbs-mk буфера: растворите 5,84 г nacl в 1×pbs-mk буфере в конечном объеме 100 мл.
Примечание: буфер следует стерилизовать через фильтр 0,22 мкм и хранить при 4 ° C.
15% йодиксанола: смешать 4,5 мл 60% йодиксанола и 13,5 мл 1 м nacl/pbs-mk буфера;
25% йодиксанола: смешать 5 мл 60% йодиксанола и 7 мл 1x pbs-mk буфера и 30 мкл фенол-
красного; 40% йодиксанола: смешивать 6,7 мл 60% йодиксанола и 3,3 мл 1x pbs-mk буфера;
60% йодиксанола: смешайте 10 мл 60% йодиксанола и 45 мкл фенол-красного.
b. накладывайте каждый раствор в трубку быстрого уплотнения в порядке (5 мл 60% йодиксанола; 5 мл
40% йодиксанола; 6 мл 25% йодиксанола; 8 мл 15% йодиксанола) с помощью шприца 10 мл и иглы 18 г.
тщательно добавьте до 5 мл осветленного супернатанта вируса сверху градиента. Используйте 1 × PBS
(или буфер лиза клеток), чтобы повернуть трубку. Запечатайте трубку быстрого уплотнения. центрифуга
при 350 000 г в течение 90 минут в роторе t70i при 10 .
℃
c. осторожно вынимите трубки быстрого уплотнения из ротора и поместите их в устойчивую стойку.
Примечание:
Будьте осторожны, чтобы избежать пузырьков во время очистки.
Если требуется больше времени центрифугирования, вы можете альтернативно центрифугировать в
течение 2 часов при 200 000 г при 18 .
℃

40. 6
Убедитесь, что не нарушайте градиент перед сбором вируса.
г. проколоть трубку быстрого уплотнения чуть ниже интерфейса 60-40% иглой 18 г, прикрепленной к
шприцу емкостью 10 мл. Наклон иглы должен быть вверх, обращен к ступени 40% йодиксанола. Собрать
до 5 мл на трубку и избегать сбора белкового материала на границе раздела 40-25%.
Примечание:
если не указано иное, все вирусы AAV очищаются ультрацентрифугированием с градиентом йодиксанола
при 350 000 г в течение 90 минут в роторе t70i при 10 , чтобы выделить загрязнители из нечистых
℃
препаратов AAV. 15% этап йодиксанола помогает дестабилизировать ионные взаимодействия между
макромолекулами с добавлением 1 м nacl. 40% и 25% шаги используются для удаления загрязняющих
веществ более низкой плотности, включая пустые капсиды, в то время как 60% шаг действует как
подушка для геномсодержащих вирусов. После нескольких этапов градиентной ультрацентрифугирования
частицы вируса будут обогащены.
концентрация aav (метод ультрафильтрации)
может потребоваться удалить йодиксанол (молекулярная масса: 1550 далтонов) из градиентных фракций
методом фильтрации или диализа, либо чтобы концентрировать вирусные частицы, либо избежать
вмешательства в некоторые дополнительные процессы.
a. Препараты pluronic-f68:
0,1% плюроник-f68: 49,5 мл pbs 500 мкл 10% плюроник-f68
0,01% плюроник-ф68: 45 мл pbs + 5 мл 0,1% плюроник-ф68
0,001% плюроник-ф68 с 200 мм nacl: 45 мл pbs + 5 мл 0,01% плюроник-ф68 + 200 мм nacl 0,001%
плюроник-ф68 (буфер для рецепта): 45 мл pbs + 5 мл 0,01% плюроник-ф68.
b. балансируйте фильтрующую мембрану 15 мл 0,1% плюронического f68 и инкубируйте в течение 10 минут
при комнатной температуре.
c. удалите 0,1% плюронического f68 и добавьте 15 мл 0,01% плюронического f68.
d. Центрофуга при 4 при 3000 об/мин в течение 5 минут.
℃
e. отбросьте фильтраты и добавьте 15 мл 0,001% плюронического f68 с 200 мм nacl pbs.
f. Центрофуга при 4 при 3000 об/мин в течение 5 минут.
℃
g. выбросьте фильтраты и добавьте очистки вируса.
h. Центрофуга при 4 при 3500 об/мин в течение 8 минут и отбросьте поток.
℃
i. Пополните больше очистки вируса и вращайте 3500 об/мин в течение 4 минут при 4°C, выбросьте
фильтраты. повторите этот шаг по мере необходимости.
j. Используйте p1000 для пипетки вверх и вниз, чтобы смыть стенку фильтра, чтобы восстановить как
можно больше вируса.

41. 7
К. Сохраняйте концентрат при 4 ° C в течение короткого периода времени (менее недели) или в небольших
аликвотах и сохраняйте при -80 ° C для длительного использования.
Примечание:
1. удалить йодиксанол сложно. добавьте больше буфера для формулы и очистки вируса и несколько раз
пипируйте туда-сюда, чтобы смешать йодиксанол, осаждающийся на дне или стенке колонны, в
раствор после каждой центрифугирования.
2. рекомендуется концентрировать до минимума 500 мкл. Если объем концентрата менее 500 мкл,
добавьте объем с буфером для формулы.
гарантии качества raav
Капсид AAV содержит vr1 82 кда, vr2 72 кда и vr3 62 кда, которые можно обнаружить методом
полиакриламидного геля электрофореза (страница), последующего окрашиванием серебра или
окрашиванием синего кумасси. чистый aav должен показывать только три основные белковые полосы, такие
как следующий вирус, очищенный в генемеди, показанный на рисунке 2. мы гарантируем чистоту вируса aav
на основе спецификаций, которые мы предоставляем для различных услуг.
рисунок 2. чистота очищенного вируса AAV.
обнаружение титра raav
Титры aav определяются количественным PCR в реальном времени с использованием праймеров,
нацеленных на ITR. ампликоны обнаруживаются с использованием зеленой технологии sybr. Затем значения
титров определяются путем сравнения со стандартной кривой образца плазмиды известной концентрации.
Пример значения ct стандартного образца и образца, подлежащего испытанию, приведен в таблице 2, а
стандартная кривая показана на рисунке 3.

42. 8
таблица 2. Значение ct стандарта и образца в типичном процессе абсолютного количественного определения.
Стандартный
стандарт
номер копии (вг/мл) Значение ct 1 Значение ct
2
Значение ct 3
Стандарт _1 1010 4.51 4.32 4.42
Стандарт _2 109
7.21 7.61 7.25
Стандарт _3 108
10.97 10.55 10.67
Стандарт_4 107
14.19 14.38 14.35
Стандарт _ 5 106
17.75 17.58 17.68
образец aav 12.78 12.65 12.81
Установите среднее значение ct каждой группы в качестве оси y, логарифм соответствующей группы в качестве
оси x. замените среднее значение ct образцов, подлежащих испытанию, на формулу, получив x = 7,45. Замените
формулу расчета титра вируса aav: 10x × 40000 вг/мл = 107,45 × 40000 = 1,1 × 1012 вг/мл.
рисунок 3. стандартная кривая в абсолютном количественном определении.
Тест на клеточную инфекцию aav
после обнаружения титра aav активность инфекции должна быть оценена перед экспериментами на животных.
проверяйте экспрессию гена-мишени, заражая клетки, такие как 293 т, CHO. Мой будет контролироваться в
диапазоне от 104 до 105 (мой — это множество инфекций, то есть количество частиц вируса, необходимого для
заражения клетки). Подробный протокол инфекции aav можно найти в руководстве пользователя aav.
безопасное использование aav
1. Соответствующие эксперименты AAV должны проводиться на объектах биобезопасности 2 класса (BL-2 класс).
2. пожалуйста, полностью оснастите лабораторное пальто, маску, перчатки и старайтесь избежать обнажения рук и
рук.
3. Будьте осторожны, чтобы брызгать вирусную суспензию. Если шкаф биобезопасности заражен вирусом во
время эксплуатации, немедленно вытерьте стол раствором, содержащим 70% спирта и 1% SDS. Перед
утилизацией все наконечники, трубки, культуральные пластины, контактные среды вируса должны быть
замочены хлорсодержащим дезинфицирующим раствором.
4. Если необходимо центрифугировать, трубка центрифуги должна быть плотно герметизирована. Если позволяют
условия, закройте трубку парапленкой перед центрифугом.

43. 9
5. Эксперименты на животных, связанные с aav, также должны проводиться на уровне bl-2.
6. Отходы, связанные с AAV, должны быть специально собраны и автоклавированы перед утилизацией.
7. После эксперимента мыть руки дезинфицирующим средством.
хранение и разбавление aav
хранение aav
Вирус может храниться при температуре 4 ° C в течение короткого времени (менее недели), прежде чем его
использовать после приема. Поскольку вирусы AAV чувствительны к замораживанию-оттаиванию, а титр
снижается при повторном замораживании-оттаивании, запасы вируса Aliquot должны храниться при
морозильной камере -80 ° C сразу по прибытии для длительного использования. в то время как перед
использованием рекомендуется повторное обнаружение титра вируса, если вирусы AAV хранятся более 12
месяцев.
разбавление аав
растворите вирус в ледяной воде, если необходимо разбавление вируса. После растворения смешайте вирус с
средой, стерильным PBS или физиологическим раствором при температуре 4 ° C (используйте в течение
недели).
меры предосторожности
· избегайте воздействия aav на экстремальные условия окружающей среды (pH, хелатирующие агенты,
такие как edta, температура, органические растворители, белковые денатуранты, сильные моющие средства и
т. д.)
· Избегайте ввода воздуха в образцы aav во время вихревых, пузырьковых пузырей или аналогичных
операций, что может привести к денатурации белка.
· Избегайте повторного замораживания и оттаивания.
· избегайте воздействия «обычных» пластиков (особенно полистирола или гидрофобных пластиков) в
течение длительного периода времени в жидкой фазе. большинство вирусов AAV очень липкие, и потеря
может возникнуть при воздействии обычного пластика, включая трубки, пластины для культивирования
клеток, кончики пипетки, если не замороженные. Лучше всего хранить aav в силиконизированных или
низкобелковых связывающих трубках. Плюроник f-68, используемый при 0,01%-0,1% в буфере для
формулы, минимизирует приклеивание при использовании обычного пластика.
· Избегайте разбавления aav в раствор с низким содержанием соли. некоторые серотипы AAV, такие как
AAV2, агрегируются в растворе с низким содержанием соли, который будет неинфекционным.

44. 10
9
Ссылка на
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физических, биологических и иммунологических характеристик. Proc Natl Acad Sci U S A 55:1467-74.
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45. About GeneMedi
GeneMedi specializes in creating superior antibody, protein, and vector-based
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At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field
of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of
unparalleled expertise in the following areas:
Innovative Antigen Design and Robust Assay Development
Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens
and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical
and research settings.
Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUSTM for accelerated
antibody discovery and LIBRATM for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize
molecules with optimal stability and functionality.
Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXTTM platform is our answer to the industry's
need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking
gene therapy approaches.
High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale
production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent
quality controls.
Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on
AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification
techniques to guarantee vector efficacy and integrity
Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for
comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic
accuracy.
Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic
antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions
can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry.
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