La presentazione realizzata da Sara Fais nel corso dell'evento finale del progetto cluster RealTimeCheckIVGamma, svoltosi online il 25 marzo 2021.

1. Sequenziamento 16 S rDNA
per l’identificazione dei patogeni
nei prodotti di IV gamma
Dott.ssa Sara Fais
Azienda Ospedaliera Universitaria di Cagliari
PROGETTO CLUSTER
RealTimeCheckIVGamma
25/03/2021

2. 1.Estrazione del DNA genomico
2.Amplificazione PCR del gene rRNA 16S
3.Ottenere la sequenza nucleotidica del gene rRNA
amplificato 16S
4.Confrontare la sequenza con le sequenze
nucleotidiche esistenti nei database
Workflow
Prelievo campione in azienda Tutorial

3. Fase pre-analitica in laboratorio
Valutazione integrità del
prodotto
Preparazione aliquota del
prodotto in grammi
Falcon
Foglia
Soluzione
Stabilizzante
Palline di vetro
Preparazione campione
Quantità nota di prodotto
Soluzione stabilizzante
Biglie
Eseguibile
anche in
azienda
Tutorial

4. Palline di vetro
Soluzione
Stabilizzante
Foglia
Falcon
Detergenti
(es. SDS)
enzimi
(proteinasi K)
Palline di vetro
Soluzione
Stabilizzante
Foglia
Falcon
fenolo
cloroformio
Alcol isoamilico
alcool etilico
Estrazione del DNA da prodotti vegetali
Palline di vetro
Palline di vetro
Sistema ricostruito in laboratorio a basso costo

5. PCR: Polymerase Chain Reaction

6. Verifica dell’avvenuta reazione (e possibile quantificazione), ad esempio
per elettroforesi su gel di agarosio
Prodotto di reazione
Marker (frammenti a lunghezza nota)
Purificazione del prodotto di PCR:
Valutazione dell’amplificato
Verificare la qualità del prodotto

7. 16S rRNA
Regione ipervariabile, la
sequenza caratterizza la
specie
Bersaglio utilizzato nel DNA

8. La sequenza del gene che codifica per il16s rRNA nei
microorganismi procarioti rappresenta un ottimo strumento
tassonomico
➢ È una sequenza universale tra i batteri
➢ Non è soggetta a trasmissione orizzontale
➢ Presenta regioni conservate universali che hanno la stessa sequenza in tutti i batteri
➢ Regioni semiconservate che hanno sequenza uguale in batteri appartenenti allo stesso
taxon
➢ Regioni variabili che hanno la stessa sequenza tra batteri appartenenti alla stessa specie

9. Le fasi del sequenziamento
Per il sequenziamento sono richiesti:
➢ un frammento di DNA denaturato,
➢ un solo oligonucleotide primer
➢ una DNA polimerasi,
➢ i quattro desossiribonucleotidi trifosfati (dATP,
dGTP, dCTP e dTTP),
➢ i quattro didesossiribonucleotidi trifosfati marcati
con sostanze fluorescenti

10. Elettroferogramma Analysis
5.2 AB)
Un programma
specifico opera il
BASECALLING
(converte i picchi in
A, T,G, C)
Sequenziatore automatico
Elettroforesi capillare

11. Questi programmi hanno molte funzioni, dopo un attenta analisi si può esportare
esportare la sequenza in un formato di testo leggero e leggibile da molti altri
programmi (es. programmi di allineamento): FORMATO FASTA
Copy FASTA formatted
I programmi appositi per la lettura dei cromatogrammi (es. Chromas; BioEdit)

12. >
CGTTAGAGGGGACGATTTCTACGTGCCTATGT
CCAATGCCACCGGCATTGTTAGGGACCCGTAC
GAGTATCCCCAGTACTACCTGGTGGCCCCGTG
GGCATACGCCTGCCTGGCAGCGTACATGTTCT
TCCTCATTCTCACCGGCTTCCCCGTCAACTTC
CTCACCCTGTACGTCACCATCGAGCACAAGAA
GCTGCGTACGCCTCTCAACTACATTCTGCTGA
ACCTCGCCATTTCCGACCTCTTCATGGTGTTC
GGCGGGTTCACCACGACGATGTACACCTCGTT
GCACGGCTACTTCGTGTTCGGACGCCTCGGCT
GCAACCTGGAAGGCTTCTTCGCGACCCTGGGC
GGTGAAATGGGGCTGTGGTCCCTGGTCGTGCT
GGCCTTCGAGAGGTGGATGGTGGTCTGTAAGC
CCGTGAGCAACTTCCGCTTCGGAGAGAACCAC
GCCATCATGGGCGTGGCCTTCACCTGGGTCAT
GGCCTGCTCCTGCGCCGTGCCTCCCCTGGTGG
GCTGGTCCCGTTACATCCCCGAGGGCATGCAG
TGCTCGTGCGGAGTCGACTACTACACCCGCGC
CCCCGGCTACAACAACGAGTCCTTCGTCATCT
ACATGTTCATCGTGCACTTCATCATTCCGCTC
ATCGTCATATTCTTCTGCTACGGCCGTCTTGT
Il segno >
contraddistingue
il FASTA ed è
obbligatorio
sequenza
FORMATO FASTA
Formato di testo leggibile da molti
programmi di allineamento

13. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) permette un confronto
rapido tra una sequenza query e il contenuto di un database

14. Sequenze depositate

15. Grazie per l’attenzione