apbb

1. ANALIZELE PROBELOR
BIOLOGICE
- BIOANALIZA -
Prof.dr.ing. Gabriel-Lucian RADU

2. Capitolul Continuturi
C1. Principiile si aplicatiile bioanalizei
Metode de prelevare a probelor biologice si
prelucrarea in vederea analizei
C2.
C3. Metode si tehnici de separare
C4. Metode spectrometrice de analizăă
C5. Metode electroanalitice
C6. Metode imunochimice de analizăă
C7. Biosenzori cu aplicatii îîn bioanalizăă
C9 Standardizarea procesului de analizăă
14 cursuri
C8. Procedee de analizăă complexăă

3. TITULARI DISCIPLINA
Prof.dr.ing. Gabriel-Lucian RADU
S.l.Dr. Emanuela CRACIUN
EVALUARE
Studenţii vor fi evaluaţi în mod continuu, atât în cursul semestrului, cât şi la
final, alocându-se următoarele ponderi în notarea finală:
Activitate la curs (răspuns la întrebări, implicare
în activitatea din cadrul cursului, teme de casă) 10% din nota finală
Performanţa în activităţile aplicative 40% din nota finală
Examen 50% din nota finală
•Activităţile evaluate şi ponderea:
10% activitatea pe parcurs, 40% evaluare laborator, 50% examen
b) Cerinţele minimale pentru promovare:
Parcurgerea tuturor lucrărilor de laborator;
Obţinerea a 50% din punctajul total;
Obţinerea a 50% din examenul final.
c) Calculul notei finale:
Calculul notei finale prin rotunjirea punctajului final total.

4. Domenii de aplicabilitate
monitorizarea calitatii vietii si mediului
valorificarea deseurilor
industria chimico-farmaceutica
biologie-biotehnologie
medicina
aparare

5. INSTRUMENTUL BIOANALITIC
ideal
selectiv
specific
reproductibil
utilizare simpla
compact
rapid
ieftin
fiabil

6. Alegerea
metodei si instrumentului
metoda
proba
instrument
*starea de agregare
*omogenitatea
*istoria probei
*securitatea
*sensibilitatea
*mediu (t, p, etc.)
*acceptabilitatea

8. TEHNICA
METODA
PROCEDEU
PROTOCOL
SPECIFICITATEA
•• CALITATIVA
•• SEMI-CANTITATIVA
•• CANTITATIVA
INFORMATIA
ANALITICA
•• SCREENING
•• RUTINA
•• RECUNOASTERE
•• STANDARD
•• REFERINTA
•• PRIMARA
INCREDEREA

9. Clasificarea metodelor analitice în funcţie de
cantitatea de determinat
Marimea
aproximativa
Metoda
Macro 100 mg
Semi-micro 10 mg
Micro 1 mg
Ultra-micro 1 μg
Sub-micro 10-2μg

10. Tehnicile de analiză si principalele aplicatii
Calitativa si cantitativa pentru
majoritatea.
Caracteristicile radiaţţiilor ionizante
nucleare emise de analit
Analiza
radiochimica
Calitativa si cantitativa pentru
majoritatea.
Proprietatile electrice ale analitului
in solutie
Analiza
electrochimica
Caracterizarea compusilor
majoritari sau minoritari
singuri sau in amestec
Schimbăări fizice sau chimice îîn
analit atunci câând este îîncăălzit sau
răăcit
Analiza termica
Separarile cantitative si
calitative ale amestecurilor
Diferite proprietăăţţi fizico-chimice ale
analiţţilor separati
Cromatografia si
electroforeza
Calitativa sau structurala
pentru majoritatea majore îîn
jos pentru a urmăări
componentele nivel izotop
raporturi
Spectrometria de Masa analitului sau fragmente din ea
masa
Calitativa,cantitativa sau
structurala pentru
componentele majore
Lungimea de undăă şşi intensitatea
radiaţţiilor electromagnetice emise
sau absorbite de analit
Spectrometria
atomica si
moleculara
Cantitativa pentru componente
majore sau minore
Volumul soluţţiei reactivului standard
reacţţioneazăă cu analitul
Titrimetria
Cantitativa pentru componente
majore sau minore
Greutatea analitului pur sau compus
cu stoichiometrie cunoscuta
Gravimetria
Principalele domenii
de aplicare
Tehnica Proprietatea masurata

11. Proba Rezultate
bruta
Procesul bioanalitic
TEHNICA
M E T O D A
Procedura
Protocol
Prelucrarea
datelor
Operatii
preliminare
Masurarea si
trasabilitatea

12. REPREZENTAREA PROCESULUI ANALITIC GLOBAL
MODEL
PLAN
PROBA
ANALIZA
EVALUARE
Defineste scopul
Selecteaza procesul analitic,
numarul analizelor si centrele de
analiza pe baza scopurilor si
costurilor
Colecteaza probele, teste
preliminare
Efectueaza operatii de ajustarea
conditiilor, separarea intereferente,
efectueaza masurarile si
achizitioneaza datele
Selecteaza dintre date valoarea cea
mai buna, estimeaza siguranta
valorii, revizuieste si repeta daca este
necesar

13. Obținerea probei Strategia analitică
Pregătirea probei
Aplicarea metodei de analiză
Obținerea datelor legate de greutatea sau volumul probei
pregătite
Prepararea soluțiilor standard ale analitului sau a altor
substanțe care vor reacționa cu analitul
Standardizarea soluțiilor sau calibrarea echipamentului
Obținerea datelor experimentale
Prelucrarea datelor
Raportarea rezultatelor

14. Bazele măăsurăării instrumentale
Traductori, Procesoare de semnal, Afișatoare și Surse de Curent
Soluții standard
Soluții cu probe Traductor Procesoare
de semnal
Sursă de curent
Dispozitiv
de afișare
Traductor - convertește o proprietate a soluției în semnal electric
Procesoare de semnal - convertește semnalul într-o formă
utilizabilă
Dispozitiv de afișare - afișează semnalul într-o formă ce poate fi
înțeleasă de analist

15. Componentele de baza ale unui
instrument
GENERATOR
SEMNAL
Detector
Tranductor
Procesor
Semnal
Inregistrator
SURSA DE
CURENT
Semnal
analitic
Semnal
electric
mecanic
optic
Semnal
iesire
- semnal electric proporțional cu concentrația

16. Tendintele in domeniul dezvoltarii
instrumentelor bioanalitice
viitor multinivel
multimod
prezent
mod
dimensiune
multidimensional
complexitate
MULTIFUNCTIONAL
hardware
marimea (u.a.)
interfete electronice
software

17. Unitatea S.I. pentru exprimarea
concentratiilor
 Molaritatea: Numarul de moli dintr-o substanta
intr-un dm3de solutie
 Un mol: egal cu masa moleculara a
substantei
 Masa moleculara:
Da: daltoni
kDa: Kilodaltoni = 1000 Da
Mr: nici o unitate
Masa moleculara relativa
= Masa moleculara a unei substante in
raport cu 1/12 din masa atomica a 12C. 17

18. • Conversie mol, mmol si μmol in volume diferite
pentru a da diferite concentratii
•• Substantele biologice sunt frecvent prezente in
concentratii relativ scazute. In sistemele ““in vitro””
volumele solutiilor utilizate frecvent in scopuri
experimentale sunt, de asemenea, mici. Consecinta
este ca solutiile experimentale sunt, de obicei in mmol
dm -3, μμmol dm-3 si nmol dm-3 decat molar.

19. Raportul Semnal / Zgomot
Semnal = informatia despre analit care
este de interes pentru chimist
Zgomot = informatia externa care nu
este necesara deoarece degradeaza
acuratetea si precizia analizei si
micsoreaza cantitatea de analit care
poate fi detectat
S/Z = media/deviaţţia standard = x/s
S/Z = 1/ RSD
unde RSD => deviaţţia standard relativăă, s/x

20. Surse de zgomot
îîn analizele intrumentale
•• Zgomot chimic
•• rezultăă din variabile incontrolabile
care afecteazăă analiza chimicăă
•• Zgomot instrumental
•• Tipuri
•• Zgomot termic
•• Zgomot ţţintăă
•• Zgomot slab
•• Zgomot de mediu

21. Modalităăţţi pentru reducerea zgomotului
ÎÎmpăămâântare şşi protejare
Amplificatori diferiţţi
Filtrare
Modulare
““Tăăierea”” semnalului
Blocarea amplificatorilor
Metode Software
- S/Z intensitatea la n0.5, unde n este media masurarilor
- Adunarea intensitatii medii a semnalelor
Media semnalelor 1-3, 5-7,etc.
- Filtrare Digitala
- Metode de Corelare
- Adunarea intensitatii medii a semnalelor

22. Adunarea intensităţii medii a semnalelor

23. Se observă că scala
verticală este mai
mică decât numărul
scanărilor. Astfel,
zgomotul creşte în
valoare absolută
odată cu creşterea
numărului scanărilor.
Totusi, valoarea
relativă a semnalului
analitic creşte.
Efectul medierii semnalelor

24. Sursele de eroare in bioanaliza
100%
10%
1%
sampling analiza
propriu-zisa
prelucrarea
datelor
coeficient
de variatie
40% 20% 30%
timp

25. ERORI IN MASURARILE ANALITICE
Erori de masurare: Toate procesele de masurare sunt supuse erorilor
ce afecteaza datele numerice si care decurg dintr-o varietate de cauze.
Erori absolute si relative: O eroare absoluta este diferenta numerica
dintre o valoare masurata si o valoare reala sau o valoare acceptata. Eroarea
relativa este eroarea absoluta impartita la valoarea reala sau acceptata.
Erori determinate: Sunt cunoscute ca fiind erori sistematice, ele
aparand, in general, din surse determinate, identificabile, care duc la
varierea valorilor masurate de la valoarea reala la cea acceptata.
Erori nedeterminate: Sunt cunoscute si sub numele de erori aleatorii,
ele aparand dintr-o varietate de surse necontrolate si cauzeaza mici variatii
aleatorii in masuratorile cantitative cand masurarea este repetata de un
numar de ori.
Erori cumulate: Cand diferite masuratori sunt combinate pentru a
calcula un rezultat analitic global, erorile asociate acestor masurari
individuale contribuie la erori totale sau acumulate.

26. Sursele de erori (I)
Erorile de la reactivi
- Reactivii si solvenţţii sunt impuri.
- Depozitarea improprie de reactivi.
- Neglijarea datei de expirare a reactivului.
- Evaporarea reactivilor.
- Respectare gradelor si puritaţţilor diferite.
Erorile materialului de referinţă
- Impuritatea materialelor de referinţă.
- Erorile de la introducerea unor substanţe.
- Schimbările datoritã depozitãrii
necorespunzãtoare.
- Erorile în pregãtirea materialul de referintă.
- Utilizarea materialul de referintă expirat.

27. Sursele de erori (II)
Metodele generale ale erorilor
- Devierea de la procedura de analiza
- Neluarea in seama a limitei de detectie
- Neluarea in seama a spatiului de colectare
- Calcularea erorilor (diluari, amestecuri,
adaugari)
- Folosirea unor proceduri analitice incorecte
Erorile de calibrare
- Erorile ale masurarilor volumetrice
- Erorile de cantarire
- Reglarea inexacta a echipamentului

28. Sursele de erori (III)
Erorile de la echipament
Echipamentul nu este curat.
Intretinerea lui este neglijata.
Influenta temperaturii, electricitatii si influenta magnetica.
Erori îîn folosirea auto-pipetelor necalibrate, pipetele nu
sunt atasate in mod corect sau sunt contaminate.
Erori in folosirea pipetelor de sticla (se pot deterioara,
materiale de calitate mai slaba, ele pot fi contaminate
anterior).
Erorile la spectrometru (lungimea de undãã greşşita, lampãã de
intensitate insuficientãã, optica murdarăă, ignorarea efectului de
deviaţţie, îîn mod incorect zeroul configurat, introducerea probei
îîntr-o camera luminoasa).
Erorile cuvei (defecte ce nu sunt luate îîn consideraţţie,sticla
necorespunzããtoare de cuva, cantitate insuficienta, umedãã pe
exterioar, bulele de aer, contaminare).

29. Sursele de erori (IV)
Inregistrarea semnalelor si descrierea erorilor
- Domeniul incorect de raportare
- Erorile de citire
- Erorile de scriere
- Schimburile de informaţţii
Calculul erorilor.
- Erorile aritmetice, erorile de virgula,
unitati incorecte
- Erorile circulare
- Neluarea in calcul a valorilor volumului
de reactiv adaugat
- Erorile in factorul de diluare

30. VARIABILITATEA BIOLOGICA
Identificarea naturii variațției
biologice
Ce se îînțțelege prin termenul de
variațției biologicăă in contextul
biochimiei clinice?
O componentăă a diversităățții
măăsuratorilor biochimiei determinate
de fiziologia subiectelor observate.

32. Componentele
varianțței îîn
măăsurarile
bioanalitice
•• Varianțța analiticăă
•• Varianțțăă biologicăă la un subiect
•• Varianțțăă biologicăă îîntre subiecțți
Surse de
Variațție
Biologicăă
•• Ritmuri biologice(timpul)
•• Homeostazie
•• Vâârstăă
•• Sex
•• Etnie
•• Patologie
•• Stimuli

33. Cuantificarea variatiei biologice
•• Cum se face cuantificarea variatiei biologice?
Trebuie analizate componentele variantei:
σσ²total =σσ²analitic +σσ²individualăă +σσ²grup
σσ² analitic =Varianțța medie de teste identice îîn termen de varianțțăă
analiticăă
σσ² individualăă =Media biologicăă îîn varianțța subiecțților
σσ²grup=Varianțța valorilor mijlocii îîntre subiecțți. Varianțța in punctele de
setare homeostatice

35. Cuantificarea
variațției biologice
•• Cum se face experimentul?
–– Subiecti Cââțți?
–– Colectarea exemplarelor
Număăr?Frecvențța?
–– Analizarea exemplarelo
Diminuarea σσ²analitic ?
–– Analizarea datelor
Valori extreme?Statisticăă?
–– Aplicarea rezultatelor analizei

37. Variațția biologicăă șși utilizarea
intervalelor de referințțăă

38. Proceduri-Protocoale
•• Erorile analitice trebuie reduse câât mai mult.
•• Analiza idealăă:
•• Un singur tip de reactivi de testare
•• Un singur analizor șși sistem analitic
•• Număăr câât mai mic de serii
Condițțiile ar trebui sa reducăă variabilele pre-analitice.
•• Subiecțți săănăătoșși
•• Moduri normale de viațțăă
•• Făărăă droguri(alcool , tutun )
•• Flebotomie de la aceeașși persoanăă
•• Acelașși moment al zilei la intervale regulate
•• Stabilirea unor reguli pentru transportul
probelor, prelucrare șși păăstrare

40. Cantitate
Unități
Grup Medie CVI CVG Indicele de
individuali
tate
μμmol/L băărbat (7) 83.9 3.4 6.8 0.54
μμmol/L Femeie(8) 71.4 4.9 11.8 0.41
μμmol/L* toti (15) 83.9 4.1 14.1 0.29
μμmol/L ? ? 5.3 14.2 0.4
μμmol/L** N= 20
Barbat 7
Femeie 13
77 4.7 14.4 0.33

41. Creatinina
μmol/L
PPrroobbaabbiilliittaattee ((%%))
Creatinina
de start
96 μmol/L

42. •• Limite de referintăă superioare :
–– Barbat= 106 μμmol/L
–– Femeie= 80 μμmol/L
•• CV mai mare pentru băărbațți
decâât pentru femei