大仁科技大學藥學系五年級 藥物劑型設計，文獻翻譯報告 老狼

1. 藥物劑型設計報告
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29 陳政勳 32 林峰傑
34 徐同頡 38 白凱傑
39 許勝喻 42 黃盟順
44 劉家昌 48 游朝宇

2. 由immunoliposomes作為目標，高效率的細胞
內投予5-fluorodeoxyuridine到結腸癌細胞

3. 1. Introduction
 在國外，結腸直腸癌是第二個或第三個最常見的惡性腫瘤，
而女性的乳癌、男性的肺癌和前列腺癌則在這之前。
 胃腸道的原發腫瘤通常能有效地藉由手術除去。
 50-60%的病人在未來的5年內發生了癌細胞轉移。
 大部分是在肝臟轉移。
 化學療法使用Fluoropyrimidines：
 5-FU或
 5-Fluoro-2-deoxyuridine（FUdR）
 併用
 Leucovorin或
 Methotrexate或
 Interferon
 目的是增加患者的存活率。

4. 作用
作用主要有兩種方式：
 第一，作為細胞毒素的核苷酸，併入DNA或RNA，使分子受損；
 第二，通過抑制Thymidylate synthase，關鍵在DNA合成酵素。
使用5-FU或FUdR治療有限，嚴重的毒性會迅速
在組織中堆積，例如，在骨髓和胃腸道。
在臨床前及臨床研究中，肝動脈輸注FUdR減少
全身毒性，造成更多的存活率，這表示局部藥物
應用可以提供很好的前景。
實施有專一性的藥物給藥系統可提供了重要的改
進，在當前癌症治療限制了有毒的副作用，並允
許更高的特異性，使藥物更能接近腫瘤目標細胞。

5. 結構
脂質體，（磷）脂質雙層結構分隔包圍著液體，
在臨床前及臨床研究已顯示有潛力的載體為抗癌
藥物。
親水性藥物可被包裹在內，親水性和疏水性藥物
可進入脂質雙層。
含有脂質體Cytostatic drug的專一目標是腫瘤細
胞，實現為腫瘤細胞指派專一單株抗體。
準備這些抗體脂質體結合物的幾種不同的方法，
稱作immunoliposomes。
原則上，可以區分成三種類型的
immunoliposomes。

6. Fig. 1.
 Schematic representation of the three basically different types of
immunoliposomes:
 (A) conventional immunoliposome with the antibody attached in a random
orientation;
 (B) PEG-liposome with antibodies attached to the liposomal bilayer in a random
orientation;
 (C) PEG-liposome with antibodies attached at the terminal end of the PEG-
chain in a site-specific manner, rendering the antibody molecules with their
antigen-binding site exposed and protruding from the liposome.

7.  B和C脂質體和A不同，poly(ethylene glycol) (PEG) 存在在脂質體表面，抑制單核
細胞吞噬系統，進而增加循環時間。
 A和B 所代表的immuno-liposomes這些抗體再加上在一個隨機方向大多涉及硫代
醚鍵（thio-ether bond）
 PEG-chains的存在（Type B）部分阻礙抗體和抗原的耦合。
 基於這些原因，替代策略是讓附著在抗體兩端的PEG-
chains發展。
 在這位置，抗體可以附加在一個任意取向或專門通過Fc-
portion。
 後者使大多數抗體正確的和抗原結合，並防止識別 Fc-
receptors。
 連結針對配位子（ligands）對脂質體liposomes不僅增
加對特定細胞的鍵結，也可讓抗癌藥在細胞內給予。

8. 內在途徑是經由（胞吞）攝取細胞脂質體。
另一種方法為高效免疫脂質體介質的細胞內給藥：
脂溶性前驅藥從脂質雙層轉移到細胞膜。
這種做法並沒有得到重視，只是偶爾的成果得到
適合藥品的傳送，但沒有明確的證據證明這個機
制。
在這裡，我們研究了FUdR傳送機制，結合在
immunoliposomes作為脂溶性dipalmitoylated
前驅藥（FUdR-dP），到大腸癌細胞。

9. FUdR用在這個親脂性藥的形式，以加強結合脂
質體，允許合拼在脂質體雙層。
FUdR-dP結合immunoliposomes的三種類型在
Fig. 1.描述。
評估CC531腫瘤細胞和immunoliposomes關係，
體外的藥效和機轉。

10. 2.2. Liposome preparation
MPB-liposomes由eggPC組成, Chol和MPB-PE
（23:16:1 molar ratio）。
MPB-PEG-liposomes包含4 mol% PEG-DSPE。
Hz-PEG-liposomes包含2.5 mol% Hz-PEG-
DSPE和1.5 mol% mPEG-DSPE。
使用擠壓機透過50 nm的聚碳酸酯過濾藉由重複
擠出微脂粒。
總微脂粒脂質濃度計算說明膽固醇相當於微脂粒。
由分析儀產生的體積分佈曲線來測出微脂粒直徑。

11. 2.3. Coupling of antibodies to liposomes
 單一複製抗體CC52由一個sulfhydryl–maleimide耦合到
MPB-PE-包含的微脂粒（A + B型）。
 單一複製抗體CC52被耦合到Hz-PEG-DSPE-包含的微脂
粒（C型）通過hydrazone-連結在hydrazide部份之間在
這PEG-鏈的終點末端和在這抗體Fc-部位被氧化的碳水化
合物。
 Immunoliposomes通過測定蛋白質含量，磷脂質含量和
粒子大小
 相當數量抗體被結合到微脂粒
 70-160μg/μmol油脂為A型免疫微脂粒
 30-40μg/μmol 油脂為B型免疫微脂粒
 10-20μg/μmol 油脂為C型免疫微脂粒
 大小範圍從140到180 nm，90到120 nm和100到140 nm。

12. 2.4. Cell culture
CC531結腸腺癌是一個1,2-dimethylhydrazine
WAG/Rij-Rat誘發的結腸癌。
細胞被保持在75-cm2培養三角瓶，在與RPMI
1640培養基與25 mM Hepes，輔以10%加熱-去
活化胎牛血清（FCS），新鮮l-glutamine（2
mM）和青黴素/鏈黴素（100 U/ml和100 U/ml）
在37℃，5%二氧化碳的空氣中。

13. 2.5. In vitro proliferation assay
CC531每2000個密集細胞在96個培養媒介中。
不同量的各種試驗化合物，分別加入本細胞。
擴散以百分率表示3H-thymidine並與未經藥物治
療的細胞比較。
藥物濃度，造成50%的生長抑制（ IC50 ）分別計
算兩個最接近50%的值對抑制生長抑制曲線。

14. 2.6. Association of liposomes
with CC531 cells
要測定CC531細胞與微脂粒的結合，3小時內培
養細胞在有無FCS與成比例變化的3H-COE-
labeled CC52-liposomes的數量。
可經由冰冷的PBS洗滌培養皿的細胞來停止培養。
在一些新添加細胞的培養皿中，可用0.4 M NaOH
使細胞溶解，研究細胞與免疫微脂體結合釋放在
額外6小時期間。
利用BSA標準液來做蛋白質的分析，在細胞組成
的蛋白質正常數量下，細胞聯繫的或釋放的放射
性可藉由閃爍計數液的來計算測量。

15. 3.1. Association of different types of
immunoliposomes with CC531 cells
 Type A、B 和C immunoliposomes在Fig. 2.被提出作為功能
liposome濃度。
 結合的CC52抗體Type A脂質體（MPB-liposomes），結果顯著增
加的水平，協會與CC531細胞相比，脂質體與抗體無關的附帶條件，
顯示出特異的結合CC52脂質體向CC531細胞。
 CC52抗體在PEG-chains的末端（type C immunoliposomes, Hz-
PEG-liposomes）比type B immunoliposomes的產量2倍更高，表
示抗體在一個正確的方向，PEG-terminus便於抗原識別。
 在Fig. 3.它變得清晰，大約10% 增加的immunoliposomes 對腫瘤細
胞結合。
 在去除immunoliposomes 剩餘細胞有關的immunoliposomes 依然
是牢固地附有腫瘤細胞。

16. Fig. 2.

17. 3.2. Increased anti-tumor activity of
immunoliposomal FUdR-dP
CC52 抗體對FUdR-dP包含的脂肪空泡量有強烈
的抗腫瘤效果（CC531 結腸癌細胞）。
抗淋巴細胞作用的影響脂肪空泡量的大小未影響
和PEG在脂肪空泡量的表面。
潛伏期為72小時，游離的FUdR是可以有效禁止
腫瘤細胞成長。
更短的藥物曝光（24小時）減少了藥物效力但是
幾乎不影響immunoliposomal的效力。

18. 3.3. Uptake and metabolism of liposomes
and liposomal FUdR-dP
 為了再回收和退化，脂肪空泡量與細胞內自然分解的膽固醇酯類
（14C-COA），脂肪空泡量的退化是在C-14。
 為了immunoliposomal FUdR-dP during期間以CC531的細胞合併
在CC52-immunoliposomes 。
 C-14少於24小時潛伏期，顯示出脂肪空泡量的退化由腫瘤細胞開始。
 相反，immunoliposome 合併的FUdR-dP或代謝產物細胞迅速地發
佈以減退FUdR(-dP)的總水平與相關細胞。
 由執行三氯甲烷/甲醇提取，在媒介和細胞分數超過80%的媒介水溶，
90%的細胞由三氯甲烷溶解FUdR dp與脂肪空泡量。
 細胞的FUdR-dp濃度和水溶性代謝產物是可比較的。
 在24 h內由80%的細胞決定腫瘤細胞水解或代謝物被釋放入媒介。
 細胞內FUdR或FUdR的代謝物可加速水分解過程。

19. 3.4. Effects of the inhibition of endocytosis and
lysosomal degradation on FUdR-dP hydrolysis
 為了進一步瞭解immunoliposomal prodrug 以細胞的互作用機制，
影響抑製劑的內吞和溶酶體退化對水解immunoliposomal fudr - dp
的研究。
 它變得明顯，從結果Fig. 5A 和 B中的位置水解過程中，是
intracellularly和水解需要胞吞和溶酶體活動。
 所有抑製劑的胞吞和溶酶體退化，導致大量的抑制水解
immunoliposomal FUdR-dP的長達24小時的潛伏期。
 觀察cytochalasin 40%成為超過80%的NH4Cl變化。在4 ℃觀察沒有
水解的抑制變化。
 FUdR-dP incorporated在Type B和C免疫也水解腫瘤細胞後，有一
個釋放在中期。 Fig. 5C號顯示時，也用這些pegylated
immunoliposomes水解FUdR-dP產生強烈的抑制作用，抑制溶酶體
退化。

20. Fig. 5.

21. 4. Discussion
 先進的Immunoliposomes專一結合CC531結腸癌細胞。
 Immunoliposomes與CC531細胞的結合位置和方向似乎受到PEG與
抗體分子對脂質體的表面的影響。
 PEG的出現對於體內的長釋型藥物傳遞系統是必要的。
 較低的抗體濃度相結合，與在場的PEG-molecules對type B
immunoliposomes，導致在一個較低的水平，type A
immunoliposomes與腫瘤細胞相比。
 type C immunoliposomes的CC52抗體在PEG-chain的末端結合
CC531細胞，即使在相對較低的抗體濃度。
 改善目標識別，可以有更多的抗體在一個正確的方向互動與細胞表面
抗原結合，以減少阻干擾的PEG-chains的這種相互作用。
 這些觀察表明重要的位置和方向的抗體分子的PEG-liposomes為對
象，以確定腫瘤細胞抗原。
 脂質體和腫瘤細胞，即通過抗體抗原相互作用，其結果主要增加運送
隨後的FUdR對腫瘤細胞的抗增殖活性。

22.  FudR以親脂性前驅藥的形式在immunoliposomes中被
吸收，需要水解才有效。
 之前的研究，很少或根本沒有水解脂質體FUdR-dP的血
清成分被觀察。
 與immunoliposomes 比較，前驅藥在24h之內，超過
80% 細胞有關的FUdR-dP由腫瘤細胞水解。
 10-20%細胞保留，FUdR它的代謝產物從被水解的FUdR-
dP獲得。
 這證明由FUdR-dP的水解，強烈抑制作用由宿主的抑制
劑的endocytosis和lysosomal退化。
 很顯然，結合後的免疫向腫瘤細胞的親脂性藥物的行為，
有別於脂質體本身以積極FUdR或FudR-代謝產物迅速內
在化和水解。

23.  活性藥物以immunoliposomal FUdR-dP的增加對抗增殖活性被觀察。
 基於所有觀察，我們的結論是，在immunoliposomes與腫瘤細胞
的交互作用中，脂溶性前驅藥FUdR-dP選擇性地轉移到細胞膜。
 FUdR-dP轉移到細胞膜後，由內部endocytic或pinocytic過程和水
解intralysosomally到FUdR。
 隨後，FUdR或FUdR-metabolites擴散到細胞質中，留
intracellularly或釋放到細胞外。
 在這兩種情況下，藥物才能發揮其細胞毒性作用：合併在DNA和
RNA，抑制Thymidylate synthase。
 藥物從腫瘤細胞擴散到周圍的細胞。
 構成了有利條件特別是有腫瘤細胞存在，且不表示針對細胞表面抗原，
造成細胞可能死亡，所謂的旁觀者效應。

24.  FUdR-dP含有免疫針對肺血管內皮細胞已用於治療肺轉移的小鼠乳腺
癌並證明了更高的效能比非針對性的脂質體。
 此外，藥物輸送機制，在這方面的做法可能涉及轉讓FUdR-dP從脂質
體或跨越內皮細胞。
 脂質體相關的親脂性衍生物methotrexate獨立的內在整個脂質體也被
報告。
 具體交互作用需要轉移發生，methotrexate的交互作用在細胞表面的
脂質雙層與葉酸受體。
 細胞內藥物緩釋用脂質體為對象的重點在於針對內部受體。
 系統內部的選擇性轉移方法，提出了一個重要的途徑，為細胞內給藥。
 使用這種概念可能不僅限於非內部化脂質體，而且為內部有針對性的
脂質體轉移的脂溶性物質endosomes或溶酶體可以提供一種手段，
以逃避溶酶體退化和實現細胞質給藥。
 該給藥系統在這裡，實現了高效率的給藥，並提供一個有效的途徑，
為交付FUdR到結腸癌細胞。

25.  一連串的親脂性（防癌）的藥品和親脂性衍生物的親水性
藥物的存在，選擇性轉移針對脂質體到目標細胞可能是可
行的。
 脂質體系統，也可以作為一個模型系統的發展新的（標
的），脂質體給藥系統中，利用脂質體雙分子團的親脂性
藥物或藥。
 目前，我們正專注於開發簡單的體外篩選方法，可以幫助
了解精確傳遞機制，並認為可用於開發脂質體為基礎的藥
物載體，為不同類型的親脂性（親）的藥物。
 此外，開發的系統將測試體內行為和對肝轉移的結腸癌抗
腫瘤療效。

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