ABC transporter functions as a pacemaker
for sequenstration of plant glucosides in
leaf beetles
ハムシにおける、植物グルコシド隔離のペースメーカーと
してのABCトランスポーターの機能
Presented by
ラットとジャンハムを飼ってる
ハムスター, @gonta_seed
2017/12/22
C. Populi
Dec. 2013 published by eLIFE
CpMRP
Motivation & Self-introduction
某カエル氏に誘われて…
#今年読んだ好きな論文2017 に
エントリー
Hey You!
参加しちゃいなYo!
ラットとジャンハムを飼ってるハムスター
(通称:はむすた, @gonta_seed)
動物、とくにネズミ類をこよなく愛する博士課程
学生。昆虫を題材に分子生物学と生化学をかじって
いる。ツイッタはかなりの割合で愛しの息子「こー
すけ」 (ファンシーラット♂, 1歳, 通称:こすけ) に
浸食されている。なお、かなりの昆虫好きでもある。
こすけなのでぃぃす!
よろしくなのでぃぃす!
この論文を選んだ/好きな理由
ABCトランスポーターの
昆虫における役割を知るために
読んだ論文
昆虫と宿主植物の関係に興味があったから
昆虫が好きだから (昆虫系研究室所属)
自分の研究内容に昆虫のABCトランスポーターが
登場するから(う゛っ…身バレする…)
Motivation
ABCトランスポーターとは?
ヒトのABCCサブファミリーに属するABC
トランスポーターは広範囲の基質 (薬、
cyclicな核酸、様々な化合物、グルタチオ
ン複合体) を認識する、広いスペクトルを
持つ。節足動物 (昆虫) におけるABCCト
ランスポーターとの相同性も高く、その
機能も似ていると考えられている。
ATP-binding cassetteを持つ
輸送体膜タンパク質 (transporter)
⇒ ATPの力を利用して動く
Introduction
Dermauw and Leeuwen, 2014
ヒトではがん細胞で抗がん剤を排出
昆虫では体内に入り込んだ農薬の排出
に関わるなどが有名
本日の主人公…
Chrysomela populi
ドロノキハムシ (ちゃん♥)
• 甲虫目 (鞘翅目)、ハムシ科
• ヤナギ科 (ポプラ、ヤナギ属など) の葉を食害
• 成虫は体長約10 mm、鞘翅は赤色
• 成虫世代で越冬する、成虫の生存期間は長い
• 年2回発生 (@北海道)
※1:北海道立総合研究機構林業試験場HPをもとに作成
Introduction
草食性の昆虫に食べられないように…
植物も防御戦略を発達させている
Phytochemical (ファイトケミカル):
植物に含まれる化学物質
ポリフェノール、カロテノイド、テルペン類などが有名
Salicin:サリシン
例:ヤナギに含まれるβ-グリコシド
⇒ 抗炎症作用がある
配糖体 (glycoside)
糖以外の物質と糖が結合した物質。
なお糖以外の部分をアグリコンという。
植物は配糖体の形で
防御物質を持つことが多い※2:構造式はJIAHERBより
Introduction
(ピンセットでつついていぢめると…)
「反転腺は背部に9対ある袋状の器官であり、通常は体内に収まっているが、
頭部を有柄針などで刺激すると反転して分泌液を押し出すようになっており、
針を除くと再び体内に分泌液を吸い込みながら戻り、次の刺激 (外敵の攻撃)
に備える。」
1962年 化学と生物 P.565-P.568 PDF版
防御物質は食草のヤナギ由来?
Introduction
C. populi の幼虫を刺激すると…
防御物質、サリチルアルデヒド
を含むと判明 (Wain et al., 1943)
https://www.jstage.jst.go.jp/article/kagakutoseibutsu1962/18/8/18_8_565/_pdf
背中の防御腺 (反転腺)から分泌液が
出てくる
Salicin:サリシン
Purpose & Aim
食べられないために植物が作りだした毒を
逆に利用して自分自身を守ることに使う昆虫
⇒ 毒の利用の仕組み解明に挑む
先に結論を言ってしまうと…
今回の論文は、「ドロノキハムシは、
食草であるヤナギの有害な化合物 (サリ
シン) を防御腺に移動させるために、
ABCトランスポーターを使う」ことを
明らかにした
(草食性の昆虫において、植物の二次代謝産物の標的器官への隔離にABC
トランスポーターが関わることを示した最初の論文のようです)
⇒Here We GO!!!
(昆虫の中には毒をイチから自前で作る頑張り屋さんもいる。
ex.) モノテルペン合成経路を持つなど)
緑:モノテルペンのイリドイド
合成経路を持つ自己合成グループ
橙:偏性隔離 (利用) を行うグループ
灰:ブチル化エステルの生合成を進化
させた混合代謝を行う半合成グループ
…系統樹もおおよそグループごとに
分かれている
Results & Discussion
①反転腺で高発現するABCトランスポーターを同定:CpMRP
防御腺で他の箇所の7000倍以上のタンパク質
発現を確認
※() 内は脊椎動物における相当器官を示す
CpMRPは
ABCトランスポーター
の特異的特徴を持つ
・2つのTMD、2つの
NBD
・WalkerA, B box
・ABC signature motif
ヒト多剤耐性関連タン
パク質MRP4と61%の
相同性をもつ
※P-グリコプロテイン(P糖タンパク質, MRP4):
消化管粘膜、腎尿細管上皮細胞、脳血管内皮細胞などで異物、薬物など
を細胞外へ排出するABCトランスポーターファミリーの一つ
(日本薬学会HP 薬学用語解説http://www.pharm.or.jp/dictionary/wiki.cgi?P-gp)
Results & Discussion
①反転腺で高発現するABCトランスポーターを同定:CpMRP
虫全体を使って免疫染色
(抗体を用いてCpMRPが幼虫のどの部分に発現しているかを調べた)
⇒ 幼虫の背中の防御腺にある細胞に局在 (そこだけに強く発現) することが
明らかになった
緑:CpMRP
青:核
Results & Discussion
②CpMRPは防御腺に局在している
スケールバー:50 µm
緑:CpMRP
青:核
赤:細胞内膜
が染められている
免疫染色 (前スライドで染まったところを
もう少し詳しく見てみたよ)
Results & Discussion
③CpMRPは防御腺の分泌腺細胞に局在している
分泌腺細胞の細胞内膜の内側に網模様状に存在する!
2光子顕微鏡
(良い顕微鏡)
で撮影した後、
3D再構成!
小胞体かな?
2光子顕微鏡
1分子に2個の光子を同時に当
てることにより、光子密度の高
い焦点位置だけが励起される
→ 高解像度の画像が得られる、
高い3次元分解能が実現できる
近赤外光を励起に用
いることで、散乱し
にくく、生体深部の
観察ができる
(数百μm~1mm)
多重同時染色も可能
※3:OLYMPUS HPを元に作成
はむすたは、顕微鏡が好きです。
観察するのも、画像を見るのも、話を聞くのも♥
ちょっと紹介Appendix
③-2 CpMRPは防御腺の分泌腺細胞の小胞体膜表面に局在
Results & Discussion
緑:エステラーゼ活性有
青:核
赤:細胞内膜
網模様状になっているものはエステラーゼ活性を持つ
By MesserWoland および Szczepan1990 - 投稿者自身による作品 (Inkscape 作成), CC 表示-継承
3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=1279365
やっぱり
小胞体っぽい!!
⑧が滑面小胞体
※小胞体は中に酵素を
含んだ液胞である
ヤナギに含まれる
サリシンが…
小胞体内で
サリチルアルデヒドに
なるのかも?
タンパク質は生体内で、DNA (遺伝子) ⇒ mRNA ⇒ タンパク質合成 (リ
ボソーム etc.) という流れで合成される
☆RNAiは狙ったタンパク質のmRNAを破壊し、タンパク質
合成量を格段に減らす (ノックダウンする) 手法
Results & Discussion
④RNAiによりCpMRPを失ったドロノキハムシちゃんは…
CpMRPをRNAiでノックダウンしても (次スライド図C参照)、
幼虫の成長は阻害されなかった (写真が可愛い)
⇒ 成長に必須のタンパク質じゃないらしい
CpMRPをRNAiでノックダウン
Results & Discussion
④RNAiによりCpMRPを失ったドロノキハムシちゃんは…
RNAiによりCpMRP合成量は激減 (図のC)
激減すると分泌液が出なくなった! (図のBお
よび右の写真)
RNAiによるノックダウン
でCpMRPが消えていく…
(TAT)
Results & Discussion
④RNAiによりCpMRPを失ったドロノキハムシちゃんは…
CpMRPをRNAiでノックダウン (5日目から効果が)
Results & Discussion
⑤CpMRPはサリシンを認識して排出できる
カエル (!!) の卵にCpMRPを発現させておき、
サリシンなどの基質を卵に打ち込み、CpMRPによって
卵から排出されたかをHPLCで測定 (卵外液を調べた)
サリシンが排出される (図A)
しかも濃度依存的に排出が促進される (図B)
⇒ CpMRPはサリシンのトランスポーターである
CpMRPの役割は低親和性のグルコシドトランスポーターで、
広いグルコシドスペクトラムを持つ と推測できる
Results & Discussion
⑤-2 CpMRPはグルコシドっぽいのを認識してゆるく排出する
①サリシンの他に…
②8-ヒドロキシゲラニオル-O-グルコシド
(P. cochleariaeのモノテルペン経路で見つかったイリドイドの前駆体)
③フェニルエチル-S-グルコシド
(C. lapponicaの分泌腺から得られる、O-グルコシドをまねた基質)
⑤チオサリシンと④チオサリシンのアナログ
さすがにガラクトースは無理
(グルコースへの特異性はある)
Results & Discussion
⑥CpMRPは分泌腺細胞内において、小胞へサリシンを選択的
に取り込むために使われている
今回見つけたのはここ!
小胞体への輸送をCpMRPが
担っている
血リンパ (体液) 分泌細胞 貯留槽 (防御腺)⇒ ⇒
結論
• CpMRPはABCトランスポーターに特徴的な構造を
有し、ヒトABCC4 (MRP4) との相同性が60%
→ ABCトランスポーターである
• CpMRPは分泌腺細胞に局在するが、分泌腺細胞の
基底膜上ではなく、細胞内の小胞膜上に局在する
• CpMRPは低親和性のグルコシドトランスポーターで、
広いグルコシドスペクトラムを持つ
• CpMRPはサリシンの防御腺への隔離における
重要なペースメーカーとしての役割を持つ
Conclusion
Conclusion
異分野の方向けにもっとざっくりまとめると…
ドロノキハムシ
ちゃんが…
激おこぷんぷん丸٩(๑`^´๑)۶
するには…
このタンパク質が
必要です!
By Alpsdake - 投稿者自身による作品, CC 表示-継承 3.0,
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=15807206
虫好きなはむすたとしては、アゲハ類の幼虫の
肉角の仕組みも、同じ感じなのかなぁと
ワクワクしている所です♥ (今度調べようっと)
٩(๑`^´๑)۶
参考文献
※1:北海道立総合研究機構林業試験場
HPhttp://www.hfri.pref.hokkaido.jp/zukan/konchu
/00data/kochu/hamusi/doronoki/note.html
※2:JIAHERB HP
http://www.jiaherb.com/jhzh/Product_jp.asp?c=1
&id=146
※3:OLYMPUS HP
http://bioimaging.jp/topics/008/
Thank you
for
Listening!
&
Watching!

今年読んだ一番好きな論文2017

Editor's Notes

  • #2 各種用語の説明もところどころ入れるべきだろう(ややこしすぎるからね) グラフの説明は口頭でよいか?→カンペがいるな…いや、カンペなどいらぬ 結局この論文から何が分かるのかをはっきり伝えること、 この論文から得られるもの、考えることができることをしっかり述べること、 これが大事 Hoechst:ヘキスト
  • #5 Fig1. 全ABCトランスポーターの構造とABCトランスポーター(排出型)のトランスポートサイクルとしてのATPスイッチモデル A)全ABCトランスポーターの特徴的な構造2つのTMD(TMD1は青、TMD2は黄色)、6つの膜貫通型構造(TM)、2つのNBD(NBD1は赤、NBD2は緑) 長いMRPの場合、余分なTMDがN末端に存在する。ABCトランスポーターの半分構造は1つのTMDと1つのNBDをもち、ホモもしくはヘテロダイマーを形成し、機能的なユニットを構成する。 B)トランスポート機構は基質(紫)との結合から始まり、基質はTMDから成る高親和性のポケット に結合する。 次にコンフォメーションの変化がNBDに伝わる。ATPを媒介として結合し、NBDダイマーは近づいていく。近づいたNBDダイマーはTMDの重要なコンフォメーション変化を引き起こす。それはTMDが回って、外に向かって開くというもので、基質の転移が始まる。 ATPの加水分解はNBDダイマーの解離を起動し、より大きなTMDのコンフォメーション変化を起こすこととなる。最後にリン酸とADPを話、トランスポーターを再生するために、NBDダイマーコンフォメーションは開いた状態となる。 MRP:multidrug-resistance associated protein はABCCサブファミリー PグリコプロテインはABCBサブファミリー Multidrug-resistance protein:MDR Fig2.ABCサブファミリー間の系統学的関係性を描いた系統樹 異なるサブファミリーに属するABCタンパク質のNBDははML分析を用いて解析された。以前の研究に似て、ABCCサブファミリーのNBDのC末端はABCBサブファミリーのNBDと同じクラスに分類される。 サブファミリーの違い:遺伝子、配列順番、ちょっとした修飾、機能などによる
  • #6 ※1:北海道立総合研究機構林業試験場HPをもとに作成 http://www.hfri.pref.hokkaido.jp/zukan/konchu/00data/kochu/hamusi/doronoki/note.html 被害など  しばしば多発するが、地域的にみると被害は1~3年で終わっている(樹木害虫発生統計資料を参照)。過去には薬剤防除が行われた(文献1974)こともあるが、木が枯死した記録はないため、森林では防除の必要はないと考えられる。
  • #7 配糖体glycoside 糖以外の物質と糖が結合した物質、糖以外の部分をアグリコンという
  • #8 こ の袋状 のものは,単 なる貯蔵器官 と考 えられた ので,電 子顕微鏡で観察 した ところ数個 の巨大細胞 が体 の内側に見 られた.し か し,その構造的特徴 ならびに役割 につ いては現在検討中であ る.分 泌液 の生成はか な り早 く,孵 化後2日 目か ら出す ようにな り,ま た一 度失 った場合で も翌 日にはす ぐに回復す るが,そ の成分は水がほ とん どであ る.有 効成分の濃度は孵化後7日 目頃が最 も高い.
  • #10 Fig1. cpmrpの分泌腺組織特異的なトランスクリプトレベルとホモロジーな配列 (A):相対的に豊富なcpmrp(C. populi(橙))のトランスクリプトとそのホモロジーな配列(C. lapponica(灰), P. cochleariae(緑))、異なる幼虫の組織を選んで 供試虫は3-4匹 (B):最大節約法による(系統樹の)復元に基づく、それらの系統発生学的グループと、化学防御戦略 緑はものテルペン、イリドイド生成を自分自身で行うグループ 予測される質問 緑はモノテルペンのイリドイド自己合成を行うグループ オレンジは偏性隔離を行うグループ 灰色はブチル化エステルの生合成を進化させた、混合代謝を行う半合成グループ C. lapponica(ウズマキハムシ)
  • #11 ※P-グリコプロテイン(P糖タンパク質):  消化管粘膜、腎尿細管上皮細胞、脳血管内皮細胞などで異物、薬物などを細胞外へ排出するABCトランスポーターファミリーの一つ。P糖タンパク質をコードするヒト遺伝子はMDR1(ABCB1)と呼ばれる。 (日本薬学会HP 薬学用語解説http://www.pharm.or.jp/dictionary/wiki.cgi?P-gp)
  • #12 Fig3. sup1. C. Populi幼虫の全身凍結切片からCpMRPの局在を突き止める  2齢幼虫の全身の凍結切片 明視野と免疫染色蛍光画像の重ね合わせ 緑:CpMRP 青:核 黒い拡大枠は切り取った幼虫の向きを示している 赤い拡大枠は代表的な分泌腺細胞
  • #13 Fig3. C. populiの分泌腺細胞におけるCpMRPの局在 (A-E):免疫染色による結果 緑:CpMRPはBodipy染色(赤)された膜構造の内に限られており、明確な網模様を示した (D):核の上の様子 (E):3D積み重ね表記 球状 (F-G):小胞のエステラーゼ活性を見るための生細胞染色(CDCFDA、緑) 内包する酵素が異なる様々な小胞が存在する
  • #14 基底膜と基底膜陥入から蛍光が発せられていないことがはっきりわかった。 網目状になっていることもわかったし、3D復元モデルもできるほど高解像を有していた。
  • #16 Fig4.継時的なCpMRPノックダウン効果の違い (A-D):C. populi幼虫の成長 CpMRPノックダウンをdsRNAの注射によって行ったのだよ CpMRPのノックダウン効果は赤い線や枠で示してありますよ、コントロールのgfp-注射は黒ですよ 異なる成長ステージで調査しましたよ (A):幼虫の成長は阻害されませんでした (B):注射から10日後には分泌物を出せなくなりました (C):トランスクリプトレベルも落ちました (D):タンパク質レベルでも落ちました ※は有意差が出たものを示しています Bの黄色いのが分泌物出せなくなってるやつね
  • #17 Fig4.継時的なCpMRPノックダウン効果の違い (A-D):C. populi幼虫の成長 CpMRPノックダウンをdsRNAの注射によって行ったのだよ CpMRPのノックダウン効果は赤い線や枠で示してありますよ、コントロールのgfp-注射は黒ですよ 異なる成長ステージで調査しましたよ (A):幼虫の成長は阻害されませんでした (B):注射から10日後には分泌物を出せなくなりました (C):トランスクリプトレベルも落ちました (D):タンパク質レベルでも落ちました ※は有意差が出たものを示しています Bの黄色いのが分泌物出せなくなってるやつね
  • #18 Fig4.継時的なCpMRPノックダウン効果の違い (A-D):C. populi幼虫の成長 CpMRPノックダウンをdsRNAの注射によって行ったのだよ CpMRPのノックダウン効果は赤い線や枠で示してありますよ、コントロールのgfp-注射は黒ですよ 異なる成長ステージで調査しましたよ (A):幼虫の成長は阻害されませんでした (B):注射から10日後には分泌物を出せなくなりました (C):トランスクリプトレベルも落ちました (D):タンパク質レベルでも落ちました ※は有意差が出たものを示しています
  • #19 Fig5.アフリカツメガエルの卵母細胞におけるCpMRPのサリシントランスポート活性 (A-D):トランスポート活性は卵母細胞を浸けている溶媒中の(サリシンの)定量、HPLC-MS使用、cpmrp-RNAを打ち込んだものと、水を打ち込んだもの (A):CpMRP依存的サリシン流出の継時的な結果、5 nmolのサリシンを打ち込んだ後 赤:cpmrp RNA 黒:水(コントロール) (B):濃度依存的なCpMRP仲介型のサリシントランスポート(赤)、コントロール水 サリシンの打ち込む量を増やした (C):比較トランスポートアッセイ、混合基質 (D):サリシンとチオサリシンでの比較トランスポートアッセイ アスタリスクは統計的
  • #20 Fig5.アフリカツメガエルの卵母細胞におけるCpMRPのサリシントランスポート活性 (A-D):トランスポート活性は卵母細胞を浸けている溶媒中の(サリシンの)定量、HPLC-MS使用、cpmrp-RNAを打ち込んだものと、水を打ち込んだもの (A):CpMRP依存的サリシン流出の継時的な結果、5 nmolのサリシンを打ち込んだ後 赤:cpmrp RNA 黒:水(コントロール) (B):濃度依存的なCpMRP仲介型のサリシントランスポート(赤)、コントロール水 サリシンの打ち込む量を増やした (C):比較トランスポートアッセイ、混合基質 (D):サリシンとチオサリシンでの比較トランスポートアッセイ アスタリスクは統計的
  • #21 Fig6. CpMRPのペースメーカとしての機能と隔離モデル 図的な眺め、分泌腺細胞内で行われている隔離のモデルを描きました。 分泌腺細胞はFig2C.の赤字で書いた部分ですよ 異なる植物配糖体が血リンパを循環 CpMROは 未発見のサリシン選択的な(おそらく濃度勾配駆動型の)トランスポーター(原形質膜状にある、サリシンを細胞内小胞に持続的に蓄積する役割を持つ)の輸送効率を制御 エキソサイトーシス的な感じで貯留槽に運搬、蓄積され、貯留槽でサリシンからサリチルアルデヒドに変わる