irreversible cell injury

1. Необратимые клеточные
повреждения и их роль в
патологии
Up-to-date integrated approach

2. Nomenclature Committee on Cell
Death 2009-2015 (NCCD)
• Следует различать гибель клетки как
состояние и процесс.
• Основные критерии процесса:
o Генерализованная активация каспаз;
o Нарушение ΔΨm – митохондриального
транмембранного потенциала;
o Экспрессия фосфатидилсерина на наружной
поверхности клеточного липидного бислоя
(сигнал «eat me» для окружения).

3. Критерии гибели клетки как
состояния (NCCD)
• 1. Нарушение целостности клеточной
мембраны – морфологически проявляется
накоплением витальных красителей в
цитоплазме in vitro;
• 2. Клетка и ее ядро подвергаются на
отдельные фрагменты – тельца (напр.,
апоптотические тельца);
• 3. И/или разрушенная клетка (и ее фрагменты)
может быть поглощена соседними клетками in
vivo.

4. «Dead» cell vs «dying» cell
• Клетки, останавливающиеся в клеточном
цикле в фазе G0 (что можно наблюдать в
результате процесса, получившего
название – senescence, т.е. старение),
должны рассматриваться как живые. При
это понятие «replicative cell death»,
применяемое в радиобиологической
практике, лишь отражает потерю
клоногенного потенциала, но не гибель.

5. Принципы классификации
• NCCD рекомендует классифицировать
гибель клеток как процесс по следующим
параметрам:
• 1. Наиболее консервативные и
максимально изученные –
морфологические критерии. По ним
выделяют: - апоптотическую,
некротическую, аутофагическую и гибель
клетки, ассоциированную с митозом.

6. Принципы классификации
• 2. Энзимологические критерии:
определяют роль и участие различных
ферментов в каскадных путях реализации
программ клеточной гибели:
- нуклеазы;
- различные классы протеаз: каспазы,
кальпаины, катепсины, трансглутаминазы.

7. Принципы классификации
• 3. Функциональные аспекты:
- случайные или программируемые типы;
- физиологические (т.е., не сопровождающие
возникновение какого-либо заболевания)
или патологические.
• 4. Вовлечение иммунологических
механизмов: иммуногенные и
неиммуногенные.

8. Programmed cell death (PCD) –
типовой патологический процесс
• Тип 1 – апоптоз – активное программируемое событие, ведущее к
клеточному суициду (часто индивидуальному) за счет реализации
специальных внутриклеточных сигнальных путей, и направленное на
сохранение гомеостаза в целостном организме.
• Тип 2 – аутофагия – активный сигнальный путь гибели клетки,
ассоциированный с внешним стрессорным воздействием, направленный на
элиминацию возможных макромолекулярных негативных факторов для
целостного организма, и служащий, в ряде случаев, адаптивным способом
выживания клеток.
• Тип 3 – некроз – стохастическое пассивное событие, при котором гибель
клеток в живом организме обусловлена неблагоприятным воздействием
внешних факторов и/или микроокружения, к чему эти клетки не смогли
адаптироваться (зачастую, это реализация программы, центральное звено
которой представлено Cа2+ -индуцированной перегрузкой цитоплазмы с
активацией эндогенных фосфолипаз, нуклеаз (кальпаинов и лизосомальных
катепсинов), образованием АФК и разрушением клеточной мембраны с
выходом содержимого во внеклеточное пространство).
• Тип 4 – анойкиз – гибель клетки, потерявшей связь с внеклеточным
матриксом

9. Другие типы PCD, имеющие самостоятельное
или перекрестное значение
• Каспаза-независимая запрограммированная клеточная гибель
(некроптоз)
• Анойкиз
• Энтоз
• Этоз или NETоз
• Эриптоз
• Пироптоз
• Митотическая катастрофа
• Эксайтотоксическая гибель нейронов
• Валлеровская дегенерация нейронов
• Корнификация (кератинизация)
• Вакуолярная дегенерация
• Терминальная дифференцировка

10. Апоптоз
- от греч. απόπτωσις —
опадание листьев —
программируемая клеточная
смерть, регулируемый процесс
самоликвидации на клеточном
уровне, в результате которого
клетка фрагментируется на
отдельные апоптотические
тельца, ограниченные
плазматической мембраной.

11. Тельце Каунсильмена

12. Основные пути реализации
апоптоза
1. Внешний путь –
взаимодействие рецепторов
мембраны клетки со
специфическими лигандами
(TNFα, TRAIL, FasL).
2. Внутренний путь
(митохондрии – ключевое
звено).
3. Перфорин-гранзимовый путь
(опосредован CTL, которые
встраивают в клетку перфорин
для трансфера гранзима В
внутрь цитоплазмы и
киллинга).
4. р53-активируемый апоптоз
(повреждения ДНК).
5. Кальциевая сигнализация
при ER-stress induced apoptosis

13. ФАЗЫ АПОПТОЗА
1. Сигнальная фаза
А) рецептор-
зависимый
сигнальный путь с
участием рецепторов
гибели клетки;
Б)
митохондриальный
путь.
2. Эффекторная фаза
3. Деградационная
фаза

14. Рецептор-зависимый
сигнальный путь
Основные рецепторы:
- CD95 (также известный как Fas или
APO-1),
- TNFR1 (также называемый p55 или
CD120a),
- TRAIL (Tumor necrosis factor ligand
superfamily member 10; TNF-related
apoptosis-inducing ligand)
Дополнительные: CARI, DR3 (англ.
death receptor 3 — «рецептор
смерти 3»), DR4 и DR5.
начинается со
взаимодействия
специфических
внеклеточных лигандов с
рецепторами
суперсемейства TNF
клеточной гибели,
экспрессированными на
поверхности клеточной
мембраны.

15. Рецепторы и лиганды в
апоптозе
1. Рецепторы - трансмембранные белки,
характеризующиеся наличием общей
последовательности из 80 аминокислот в
цитоплазматическом домене смерти
(англ. death domain или кратко DD). Виды
доменов: DD, DED, CARD.
2. Внеклеточные участки рецепторов
смерти взаимодействуют с тримерами
лигандов (CD95L, TNF, Apo3L, Apo2L и т. п.).
3. Активированный таким образом
рецептор взаимодействует с
соответствующим внутриклеточным
адаптером (или адаптерами):
- для рецептора CD95 (Fas/APO-1)
адаптером является FADD (от англ. Fas-
associated DD-protein — «белок,
взаимодействующий с доменом смерти
Fas-рецептора»);
- для рецепторов TNFR1 и DR3 адаптером
является TRADD (от англ. TNFR1-associated
DD-protein — «белок, взаимодействующий
с доменом смерти TNFR1-рецептора»).

16. Взаимодействие адаптеров, эффекторов и доменов
смерти при апоптозе
• Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во
взаимодействие с эффекторами — с прокаспазами. В результате
цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор»
формируются агрегаты, в которых происходит активация
прокаспаз. Данные агрегаты именуются апоптосомами.
Примером апоптосомы может служить комплекс FasL-Fas-FADD-
прокаспаза-8, в котором активируется каспаза-8.
• DD (от англ. death domain — «домен смерти») участвует во
взаимодействии рецептора Fas с адаптером FADD и во
взаимодействии рецепторов TNFR1 или DR3 с адаптером TRADD.
Посредством домена DED (от англ. death-effector domain —
«домен эффектора смерти») осуществляется взаимодействие
адаптера FADD с прокаспазами −8 и −10. Домен CARD (от англ.
caspase activation and recruitment domain — «домен активации и
рекрутирования каспазы») участвует во взаимодействии адаптера
RAIDD с прокаспазой-2

17. Митохондриальный путь
активации апоптоза
реализуется в результате
выхода апоптогенных
белков из
межмембранного
пространства митохондрий
в цитоплазму клетки за
счет:
- разрыва
митохондриальной
мембраны,
- открытия
высокопроницаемых
каналов на внешней
мембране митохондрий.

18. Митохондриальный путь
апоптоза
А. Взаимодействие специфических
лигандов – сигналов выживания
клеток с их рецепторами –
индуцирует активность
антиапоптотических факторв
(bcl2), что играет ключевую роль в
поддержании структурной
целостности митохондрий и
воспрепятствованию выхода
содержимого в цитоплазму.
В. Отсутствие необходимых
сигналов выживания – активация
проапоптотических факторов –
выход цитохрома с из
митохондрий в цитоплазму –
активация каспаз и гибель клетки.

19. Митохондриальный путь
апоптоза
1. В норме Cyt c, Smac/diablo and
apoptosis inducing factor (AIF)
расположены на внутренней мембране
митохондрий или в межмембранном
пространстве. Олигомерный комплекс
Bak/Bax с антиапоптотическим фактором
Bcl-2- на наружной мембране.
2. В ходе активации
(фосфорилирования) BH3-компонентов
Bcl-2, происходит их встраивание между
Bak/Bax, что совобождает Bak/Bax
белки, и приводит к формированию
поры – MAC – в наружной
митохондриальной мембране.
3. Проапоптотические белки Cyt c,
Smac/diablo, AIF и другие покидают
клетку через MAC-пору.
4. Оказавшись в цитоплазме, эти белки
активируют прокаспазы, запуская
каскадный механизм апоптоза.

20. Особенности митохондриального пути
• В цитоплазму высвобождаются: цитохром c; прокаспазы −2, −3 и −9; AIF
(от англ. apoptosis inducing factor — «фактор индуцирующий апоптоз»).
• Цитохром c в цитоплазме клетки участвует в формировании апоптосомы
вместе с белком Apaf-1 (от англ. apoptosis protease activating factor-1 —
«фактор активации протеаз апоптоза»). Предварительно, Apaf-1
претерпевает конформационные изменения в результате реакции,
протекающей с затратой энергии АТФ. Так открывается доступ CARD-
домена Apaf-1 для прокаспазы-9.
• Происходит олигомеризация 7 субъединиц трансформированного белка
Apaf-1 с участием цитохрома c и прокаспазы-9. Так образуется
апоптосома, активирующая каспазу-9. Зрелая каспаза-9 связывает и
активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3.
Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий
флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим
независимо от каспаз.

21. Другие пути активации апоптоза
• Активация прокаспазы-12, локализованной в эндоплазматическом
ретикулуме (ER-stress-induced apoptosis).
• Атака инфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами,
которые, помимо активации Fas-рецептора, способны секретировать
перфорин вблизи мембраны заражённой клетки. Перфорин,
полимеризуясь, образует трансмембранные каналы, через которые
внутрь клетки поступают лимфотоксин-альфа и смесь сериновых протеаз
(гранзимов). Далее гранзим B активирует каспазу-3 и запускается
каспазный каскад.
• Высвобождение лизосомальных протеаз — катепсинов. К примеру,
каспаза-8 вызывает выход из лизосом активного катепсина B, который
затем расщепляет регуляторный белок Bid. В результате образуется
активный белок t-Bid, активирующий в свою очередь проапоптозный
белок Bax.

22. CTL-индуцированный
апоптоз
1. Гранзимы и перфорин
синтезируются преимущественно CTLs
и натуральными киллерами (NK).
После связывания ЦТЛ с клеткой-
мишенью, перфорин встраивается в ее
мембрану с образованием
межклеточного канала, через который
переносится гранзим в клетку-мишень.
2. Гранзимы осуществляют протеолиз
Bid с образованием его активной
формы, tBid, которая транслоцируется
в митохондрию и активирует
внутренний сингнальный каскад
апоптоза. Также происходит активация
прокаспазы 3.
3. Гранзимы также разрушают
комплекс CAD и его ингибитора, ICAD.
Это стимулирует выход ДНКазы (CAD)
и обусловливает каспаза-независимый
путь апоптоза. CAD–ICAD комплекс
разрушается посредством caspase-3.
!CAD = caspase-activated DNase; CTL =
cytotoxic T lymphocyte; ICAD = inhibitor
of CAD, BID – BH3-interacting death
activator

23. Эффекторная фаза апоптоза
• Каспазы представляют собой цистеиновые протеазы, которые
расщепляют аминокислотные последовательности после остатка
аспарагиновой кислоты (аспартата).
• Каспазы образуются за счёт активации прокаспаз (молекулярная масса
32—56 кДа), в составе которых выделяют 3 домена: регуляторный N-
концевой домен (продомен), большую (17—21 кДа) и малую (10—13
кДа) субъединицы.
• Активация происходит путём протеолитического процессинга: все три
домена расщепляются, отделяется продомен, а оставшиеся большая и
малая субъединицы ассоциируются, образуя гетеродимер. Два
гетеродимера в дальнейшем формируют тетрамер — полноценную
каспазу с двумя каталитическими участками.

24. Значение апоптоза в
биологических системах
1. Элиминация клеточных клонов
в ходе эмбрионального
развития, морфо- и
органогенеза.
2. Гибель клеток, выполнивших
свою функцию при иммунном
ответе.
3. Дегенерация нейронов (напр.,
дефект Zn2+2+/Сu2+- зависимой
СОД при БАС).
4. Ликвидация аутореактивных
клонов Т-лимфоцитов.
5. Гормонозависимые
инволютивные процессы (фаза
десквамации в менструальном
цикле).
6. Трансфекции (вирусные).
7. Опухолевый рост.

25. Принципы
морфологической
диагностики апоптоза
1) рутинное свето-
микроскопическое исследование с
использованием обычных методов
фиксации и окрашивания или
способов, селективно выявляющих
пикнотизированный хроматин;
2) флюоресцентно-
микроскопическое исследование с
использованием флюорохромов,
включая и проточную
цитофотометрию;
3) электронно-микроскопические
методы;
4) выявление олигонуклеосомной
деградации ДНК in situ;
5) иммуногистохимическое
выявление белков-маркеров,
участвующих в запуске АСК.

26. Критерии структурных
изменений при апоптозе
• Наиболее надежным критерием наличия
апоптоза является обнаружение каспаза-
зависимой олигонуклеосомной деградации
хроматина при сохранении целостности
мембранных структур клеток
• Абсолютно специфических признаков
апоптоза нет, для повышения достоверности
получаемых данных прибегают к
использованию нескольких методических
приемов, основанных на различных подходах
1. Световая микроскопия: маргинация
хроматина, неровность контуров ядра,
пикноз (конденсация) хроматина,
изменение окрашивания цитоплазмы
(базофилия на ранних стадиях, эозинофилия
– апоптозные тельца); вакуолизация
цитоплазмы (дилатация ГЭР); изменение
контуров и фрагментация клеток с
распадом.
2. Флюоресцентная микроскопия:
неспецифическое окрашивание
конденсированного хроматина с
использованием флюорохромов к ДНК,
аннексина V.
3. Электронная микроскопия: утрата
микроворсинок и десмосом; блеббинг;
отсутствие набухания митохондрий;
концентрация рибосом в кристаллы;
субмембранные скопления параллельно
ориентированных филаментов; ядерные
осмиофильные комплексы из факторов
транскрипции; дилация ЭР; поры ядерной
мембраны.
4. TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl
transferase dUTP nick end labeling).
5. ИГХ: каспаза 3, p53, bcl2, bax.

27. Аутофагия
• это процесс, при котором внутренние компоненты клетки доставляются
внутрь её лизосом и подвергаются в них деградации
• Основными стимулами к усилению процессов аутофагии в клетках могут
служить: нехватка питательных веществ; наличие в цитоплазме
повреждённых органелл; наличие в цитоплазме частично
денатурировавших белков и их агрегатов.
• Три типа аутофагии:
- микроаутофагия (макромолекулы и обломки клеточных мембран
просто захватываются лизосомой),
- макроаутофагия (участок цитоплазмы (часто содержащий какие-либо
органоиды) окружается мембранным компартментом, похожим на
цистерну эндоплазматической сети. В результате этот участок отделяется
от остальной цитоплазмы двумя мембранами. Такие двухмембранные
органеллы, окружающие удаляемые органеллы и цитоплазму,
называются аутофагосомы. Аутофагосомы соединяются с лизосомами,
образуя аутофаголизосомы, в которых органеллы и остальное
содержимое аутофагосом перевариваются),
- шаперон-индуцированная (направленный транспорт частично
денатурировавших белков из цитоплазмы сквозь мембрану лизосомы в
ее полость, где они перевариваются)

28. Аутофагия – способ
выживания клетки
• Цитокины, активирующие фагоцитоз
(TNFb), также способны вызывать
аутофагию
• Морфологически ви-зуализируется с
помощью электронной микроскопии
(образование многочисленных
везикул и вакуолей, содержащих
лизируемые компоненты клетки).
Ядро при этом процессе не содержит
конденсированного хроматина и
разрывов в ДНК, определяемых
TUNEL-методом
• Может выступать не только как
вариант реализации танатогенного
сигнала, но и, наоборот, как
программа выживания клетки.
Показано, что если вслед за
активацией апоптоза в клетке будет
запущен процесс аутофагии, то
происходит отмена
программируемой гибели

29. Аутофагия: общие
механизмы
В присутствии питательных веществ
и факторов роста MTOR
активируется, что приводит к
торможению аутофагии.
Депривация факторов роста и
других сигналов или воздействие
рапамицина, приводит к
ингибированию MTOR и активации
комплекса, который индуцирует
образование аутофагосом.
Образующаяся везикула
(аутофагосома) является местом
сборки PI3KC3 комплекса.
Образование PI3P приводит к
модификации microtubule-
associated protein light chain 3 (LC3-
II). Bcl-2, способен ингибировать
аутофагию через прямое
связывание Beclin-1.

30. Анойкиз, или гибель в
отсутствии сигналов
микроокружения
форма запрограммированной гибели
клеток, индуцированная отсоединением
мембраносвязанных клеток от
окружающего внеклеточного матрикса
(ECM)
Механизм: аналогия с апоптозом; белок
TrkB – рецептор; лиганд -
нейротрофический фактор головного
мозга (BDNF). TrkB может сделать
опухолевые клетки устойчивыми к anoikis
путем активации фосфатидилинозитол-3-
киназного (PI3K) сигнального каскада. В
плоскоклеточном раке устойчивость к
анойкизу может быть вызвана активацией
фактором роста гепатоцитов (HGF)
внеклеточных рецепторов сигнальных
киназ (ERK) и PI3K.
Реализация: эндотелий в условиях
формирования атеросклеротических
бляшек; метастазирование опухолевых
клеток

31. Энтоз, или «клеточный
каннибализм»
проявляется проникновением одной
живой клетки в цитоплазму другой
Механизм: энтотические структуры, также
называемые «клетки-в-клетках»,
образуются за счет потери межклеточных
соединений, и сводится к Rho-зависимому
процессу, включающему полимеризацию
актина и миозина II в проникающей
клетке. Межклеточные соединения
связывают клетки вместе за счет белка
кадгерина трансмембранных белковых
комплексов, входящих в цитоскелет
соседствующих клеток
Особенности: Entos отличается от
апоптоза тем, что энтотическая гибель
отдельных клеток является следствием
внутриклеточного проникновения с
сохранением жизнеспособности
вторгшейся клетки и возможностью
дальнейшей миграции, а не фагоцитоза.
Реализация: шигеллезы; анеуплоидная
трансформация опухолевых клеток.

32. Митотическая катастрофа
• форма запрограммированной гибели клеток, является событием, при котором
клетка разрушается во время митоза.
• Механизм: происходит в результате аберрантных сегрегаций хромосом в начале
митоза, или в результате повреждения ДНК позже. Термин «митотическая
катастрофа» используется для объяснения механизма гибели клеток в фазе
митотического деления, т.е. последовательность событий, которые ведут к
преждевременному или неуместному вступлению клеток в митоз, что может быть
вызвано химическими или физическими факторами. Это может быть вызвано с
агентами, влияющими на стабильность микротрубочек, различными
противоопухолевыми препаратами, а также нарушениями митоза, вызванными
дефектами контрольно-пропускных пунктов клеточного цикла.
• Реализация: основная форма клеточной гибели, индуцированной ионизирующим
излучением.

33. Эриптоз – специализированный путь элиминации
стареющих эритроцитов
• форма запрограммированной гибели клеток, специфически реализующаяся в
эритроцитах
• Механизм: вызван повышенным цитозольным содержанием Ca2 + и/или
повышением активности церамидов и характеризуется уплощением клетки и
фосфатидилсериновой инверсией на поверхности клеточной мембраны (в норме
фосфатидилсерин, фосфатидилхолин ассоциированы с внутренней частью
липидного бислоя мембран клеток, а фосфатидилэтаноламин – с наружной).
Оксид азота NO участвует в регуляции эриптоза, эффект частично имитирует роль
цГМФ, параллельно с изменениями нитрозилирования белков и деятельности
тиоредоксина (Тиоредоксин и глутаредоксин, наряду с глутатионзависимым
превращением рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды способны
восстанавливать дисульфидные связи в белках, способствуя формированию у них
правильной третичной структуры).
• Реализация: эритроциты.

34. Этозис (NETоз) и
«хроматиновые ловушки»
1. Нейтрофилы распознают
патогены (PAMP), после чего -
2. Активируется NADP-оксидаза,
последняя способствует
образованию АФК.
3. В результате разрушаются
мембраны внутриклеточных
гранул и происходит дисперсия
внутриклеточного хроматина.
4. Нетотическая активность
приводит к выходу хроматиновых
ловушек из цитоплазмы, которые
содержат антимикробные
клеточные продукты.
5. Эти ловушки захватывают и
уничтожают патогены.

35. Пироптоз: участие
факторов врожденного
иммунитета
является одной из форм запрограммированной
клеточной смерти, связанной с антимикробным
ответом во время воспаления.
Особенности: в отличие от апоптоза, pyroptosis
требует участия каспазы-1, и впервые был
отмечен при изучении сальмонелла-
инфицированных макрофагов. В отличие от
апоптоза, инициируется PAMPs и цитокинами,
которые активируют синтез и секрецию
провоспалительных медиаторов
иммуннокомпетентными клетками.
Механизм: инициирование pyroptosis было
связано со связыванием белковых компонентов
жгутиков (флагеллина) сальмонелл и шигелл (и
аналогичных PAMPs в других патогенных
микроорганизмах) с NOD-подобными
рецепторами (NLRS). Эти рецепторы - TLR, но
реагируют на интрацитоплазматические
антигены, а не внеклеточные антигены. Каспаза-1
активируется во время pyroptosis большим
супрамолекулярным комплексом, который
называется pyroptosome (также известный как
инфламмосома). Только одна большая
pyroptosoma формируется в каждом макрофаге в
течение нескольких минут после инфицирования.
Реализация: микробоассоциированный
иммунный ответ в макрофагальных и дендритных
клетках

36. Сравнительная характеристика некоторых типов клеточной гибели
Морфология Апоптоз Пироптоз Некроз
1. Лизис клетки - + +
2. Набухание клетки - + +
3. Образование пор - + +
4.Блеббинг клеточной
мембраны
+ - -
5. ДНК-фрагментация + + +
Механизмы
1. Каспаза 1 - + -
2. Каспаза 3 + - -
3. Цитохром с -
высвобождение
+ - -
Исходы
1. Воспаление - + +
2. Программированная
гибель клетки
+ + +/-