anti-HPA antibody & platelet antibody

1. Introduction Platelet antibody
detection
Speaker :張志昇
Date: 2014/08/24

2. PTR NAITP HIT DIT TTP ITP TRALI
Test or
investig
ation
CCI CBC, DC CBC,DC
Heparin history
Drug history DAT
BUN
CBC,DC
DAT BNP
CBC
X-ray
Serologi
cal test
PRA(class I)
ELISA(Pakplus)
SPRCA (capture-
P, MASPAT):anti-platelet
antibody
screening, and
cross matching
PIFA
Luminex PRA
class I
MAIPA
MPHA
Mother and fetus
PRA(class I/II)
ELISA(Pakplus)
SPRCA (capture-P,
MASPAT):anti-platelet
antibody
screening
PIFA
Luminex PRA
MAIPA
MPHA
Mother serum Vs.
Father/baby plat.
SPRCA, PIFA
cross matching
ELISA (PF4)
CAT (PF4)
R/O SPRCA
ELISA ( Pakplus)
T (PF4)
Serum + drug, or
eluent
SPRCA
( Capture-P,
MASPAT)
SPRCA ( AC)
FRET:ADMATS
-13
R/O SPRCA
ELISA
(Pakplus)
activity
ELISA
(Pakauto)
ELISA
(Pakplus)
SPRCA
( Capture-P,
MASPAT ):
auto antibody
and allo
antibody
PIFA (auto)
Flow cytometry
( auto)
Donor serum
( and/or patient
)
Luminux PRA
( class I/class
II/HNA)
ELISA PRA
(class I/II)
flowPRA (class
I/II)
Leuko-agglutinin
test
MAIGA
GIFA
Antigen HLA class I
typing
HPA typing
CD36 typing
Parent and fetus:
HLA class I/II
typing,
HPA typing
CD 36 typing

3. 臨床上檢測血小板特異性抗體的方法
Solid- phase red cell adherence assay (SPRCA)
Capture-P
MASPAT
MACE (Modified antigen capture ELISA )
MAIPA
PIFT

4. Solid- phase red cell adherence assay
(SPRCA)
This assay can detect HLA, ABO,
and platelet specific IgG
antibodies. But weak reactions
give immediate results.

5. Application of SPRCA
 Cross match (e.g. NAITP mother’s serum
+father’s platelet)
 +Chloroquine: differential of HLA/HPA
 +drug : drug-induced thrombocytopenia
 +auto cell: auto antibodies

6. PRP preparation (ITP)
檢體收集: 將含抗凝劑EDTA的全血在
400 RCF下室溫離心10分鐘, 收集上層
血漿部分。
病人 platelet count 檢體量
＜ 10 K 40 mL
11~20K 40mL
21~50K 30mL
51~150K 20mL
＞ 150K 10mL
• 若懷疑病人有自體抗
體，則病人須於最近
一週內未輸過血小板
濃厚液才可以抽血送
檢。
• 若病人於最近三週內
注射過IVIG，則不
適合此檢驗。

7. 1. Modified antigen capture ELISA (MACE)
-- MACE-1 and MACE-2
2. Platelet auto antibody test
ELISA Screening Test for Autoantibodies to Platelet Glycoproteins IIb/IIIa, Ib/IX
and Ia/IIa
-- PAKAUTO
3. Platelet antibody of GpIIb/ IIIa identification
ELISA Test for the Detection of Antibodies Specific to epitopes on the Platelet
Glycoprotein IIb/IIIa
--- PAK 1
4. Platelet antibody
ELISA Screening Test for the Detection of HLA Class I, Platelet and weaker
antibodies
--- PAKPLUS

8. HPA antibodies screening
material
標
示
內容物體積說明
HPA、HLA class I ELISA
strip
1 set 2x8 一條
Plate Sealers 4 PC
WB Wash buffer 1 btl
SD Specimen Diluent 2 mL 稀釋檢體用
AH Anti-Human IgG/A/M
Conjugate
10 μL 使用前以SD稀釋
PN PNPP Substrate 1 btl 避光玻璃瓶
H2O dd Water 1 mL
SB Substrate Buffer 2 mL 稀釋基質液用
ST Stop Solution 2 mL
擦手紙一 包

9. Procedure of Pakplus
1. 在所有well中加入300 μL WB 置於室溫5~10分鐘
2. 稀釋檢體，100 μL血清加入300 μL SD
3. 將反應盤中的清洗液倒掉，在吸水紙巾上拍乾
4. 加入50 μL稀釋好的檢體到A~G wells；請勿加入H
(blank)
5. 貼好封膜，放入37℃乾式培養箱，反應40分鐘
6. 配製二級抗體，10 μL AH 加入1 mL SD 低速
vortex避光備用
7. 反應40分鐘後，倒掉盤內液體，在吸水紙巾上拍乾
8. 清洗：每個well加入300 μL WB 、倒掉盤內液體
9. 重複清洗三次後，在吸水紙巾上徹底拍乾
10.A~G中加入50 μL稀釋好的二級抗體

10. Procedure of Pakplus (II)
1. 輕敲PNPP的玻璃瓶，減少粉末附著在瓶蓋；小心的打開。
2. 加入0.5 mL dd water，蓋回瓶蓋，搖動混和均勻
3. 取20 μL完全溶解的PNPP，加入2 mL的 SB 中，混和均勻
避光備用
4. 反應40分鐘後，倒掉盤內液體，在吸水紙巾上拍乾
5. 清洗：每個well加入300 μL WB 、倒掉盤內液體
6. 重複清洗三次後，在吸水紙巾上拍乾。
7. 設定計時器倒數30分鐘，立即進行以下步驟
8. A~G中加入100 μL稀釋好的PNPP，勿加入H(blank)中
9. 貼好封膜，避光室溫反應30分鐘
(以PNPP加入第一個well起算)
10. 計時結束後在A~G中加入100 μL ST ，H中加入200 μL

12. Result and interpretation
判讀：減去blank吸光度，2X於相對列
mean of negative control 則可判定為
positive，介於1X~2X為bordline.
但positive需至少8X的mean of
negative control吸光度，否則實驗
Invalid。

13. GTI-PAKPLUS
ELISA Screening Test for the Detection of HLA
Class I, Platelet and weaker antibodies
Neg. control
Neg. control P’t sample 1 Neg. control P’t sample 2 P’t sample 3

14. Thanks For Your Attention