Induction of apoptosis by  Meretrix   lusoria  through reactive oxygen species production, glutathione depletion, and casp...
Introduction
學名   Meretrix lusoria 中文名  文蛤 中文俗名   普通文蛤、麗文蛤、粉蟯  英文俗名   Hard clam (HC)   型態特徵  貝殼呈亞三角形,黃褐色而有深褐色之斑紋,殼質堅 厚,殼面光滑,大者可長至 12 公分...
Morphology of apoptosis Single cell Shrinking Chromatin condensation Nuclear fragment protuberances Apoptotic bodies forma...
ROS 氧分子能夠連續接受電子形成一系列中間產物,這些反應性較強的含氧分子稱為活化氧 (activated oxygen) ,有些活化氧亦是自由基
Extrinsic ( Death Receptor-Initiated ) Pathway   DNA fragmentation DNA repair ↓ Apoptosis FADD Pro-cas-8 cas-8 Apoptosis P...
Anti-apoptotic proteins Bcl-2,  Mcl-1 ,  Bcl-X L Bad,  Bid , Bim,  Bax Pro-apoptotic proteins 抗凋亡蛋白 存在於粒線體膜、內質網膜以及外核膜上,  但...
Intrinsic ( Mitochondrial ) Pathway   Apoptosis Mitochondria Cytochrome c Mcl-1 ↓ Bax cleavage Bcl-x L ↓ cas-9 ROS↑ GSH↓ D...
Mcl-1 ↓ Bax cleavage Bcl-x L ↓ caspase-3 Fas Fas L cas-8 tBid Bid Mitochondria cas-9 Apoptosis
Purpose
? Apoptosis Hard Clam
Meterials  and  Methods
MTT assay terazolium   formazan 570 nm 黃色 紫色 dehydrogenase   hello
Analysis of apoptosis by cell dying Acridine orange stain 利用 Acridine orange 染劑能與核酸親和的特性,其會嵌入 DNA 與 RNA 中,使用螢光顯微技術下可清楚觀測細胞...
look  me Analysis of apoptosis by cell dying  PI Stain   可以和細胞內的 DNA 結合,且結合量與 DNA 的量成正比,使用 Flow cytometer 來計算各細胞的 PI 含量,可以...
Analysis of apoptosis by cell dying  Annexin V-FITC stain   Fluorescence  ↑  Apoptosis cells  ↑ ; Fluorescence  ↓  Apoptos...
Determination of ROS generation   happy Flow cytometry ROS DCF Flow cytometry DCFH DCFH-DA Fluorescence  ↑  ROS  ↑ ; Fluor...
GSH CMF Flow cytometry CMF  CMF-DA Determination of GSH depletion   Cell esterase  Flow cytometry Fluorescence  ↑  GSH  ↑ ...
Analysis of mitochondrial transmembrane potential  DiOC 6   stain 粒線體膜電位的存在,會使一些親脂性陽離子螢光染料:《 DiOC 6 》結合到粒線體基質,然後再利用流式細胞計檢測...
specific substrate release (AMC)  Fluorescence spectrophotometer 產生黃綠色螢光 Caspase caspase specific substrate-(AMC) caspase ...
Results
抑制 50% 酵素活性所需要的藥物濃度 COLO 205 : 結腸癌細胞 SK-Hep 1 : 肝癌細胞 HL-60 : 人類骨髓白血病細胞株 AGS : 胃癌細胞 THP-1 : 人類白血病單核球細胞株 PMNs : 健康人類的多形核中性球 ...
agarose gel electrophoresis Fig. 1  dose dependent time dependent
/6 hrs 染色質皺縮 Acridine orange 觀測細胞經處理後整體型態與核內染色質的改變   Fig. 1
annexin V-FITC staining and flow cytometry Right shift Apoptosis ↑ Fig. 1
dose time Fig. 2
left shift Δ Ψm   ↓ Δ Ψm↓ Cytochrome c cas-9 cas-3 Fig. 3 Mitochondria
Δ Ψm↓ Cytochrome c cas-9 cas-3 Fig. 3 Mitochondria
Right shift ROS ↑ left shift GSH ↓ Fig. 4
caspase 9   在 1 hr 可看到明顯的上升 caspase 3,8 在 2,3 hr 看到上升 9 Fig. 5 3 8 1,6 2
->   caspase  inhibitor Fig. 5
a  -> allopurinol b  -> catalase c  -> DPI d  -> NAC e  -> PDTC f  -> SOD   ,  GSH   c a f b d e Fig. 5
dose time DNA repair ↓ cas-3 PARP Apoptosis Fig. 6
cas-3 ( inhibitor of CAD ) DNA  fragmentation Fig. 6 DFF-45 CAD DFF-45 CAD
Fig. 7
tBid Bid cas-8 Fig. 8 Fas Fas L FADD Pro-cas-8
Fig. 8 Fas Fas Ligand
Discussion
Intrinsic Pathway   Extrinsic Pathway
市售蜆精一覽表  80  元 綠川黃金蜆精 60  元 蒜味重 ★ ( 多 3%) 白蘭氏蜆精 ★ 50  元 ★ 台糖蜆精 零售價格 調味 ( 口味 ) 蜆精濃度
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  1. 1. Induction of apoptosis by Meretrix lusoria through reactive oxygen species production, glutathione depletion, and caspase activation in human leukemia cells Origin : Life Sciences 79 (2006) 1140–1152 Authors : P, M-H , H, Y-T , H, C-J , C, C-I , H, P-C , P, B-S Impect Impact factor : 2.512 Speaker : Ching-Sheng Hung MT Date : 2007/11/09
  2. 2. Introduction
  3. 3. 學名 Meretrix lusoria 中文名 文蛤 中文俗名 普通文蛤、麗文蛤、粉蟯  英文俗名 Hard clam (HC)   型態特徵 貝殼呈亞三角形,黃褐色而有深褐色之斑紋,殼質堅 厚,殼面光滑,大者可長至 12 公分 棲所生態 生活在低潮區及稍深的淺海細砂的海底,棲息深度可達 20 公尺 地理分布 東亞一帶皆產,台灣盛產於西海岸泥沙底,且大量被人養殖 漁業利用 肉質鮮味美,殼可供藥用或做燒石灰之原料 Meretrix lusoria
  4. 4. Morphology of apoptosis Single cell Shrinking Chromatin condensation Nuclear fragment protuberances Apoptotic bodies formation Phagocytosis
  5. 5. ROS 氧分子能夠連續接受電子形成一系列中間產物,這些反應性較強的含氧分子稱為活化氧 (activated oxygen) ,有些活化氧亦是自由基
  6. 6. Extrinsic ( Death Receptor-Initiated ) Pathway DNA fragmentation DNA repair ↓ Apoptosis FADD Pro-cas-8 cas-8 Apoptosis PARP DFF-45 CAD CAD Fas Fas L cas-3 Nucleus
  7. 7. Anti-apoptotic proteins Bcl-2, Mcl-1 , Bcl-X L Bad, Bid , Bim, Bax Pro-apoptotic proteins 抗凋亡蛋白 存在於粒線體膜、內質網膜以及外核膜上, 但主要定位於粒線體外膜,它抵抗促凋亡蛋白的功能 促凋亡蛋白 則定位於細胞質,一旦受到凋亡因子的誘導 ,它們可以向粒線體靠近,在粒線體外膜形成跨膜通道 ,或者開啟粒線體的 PT 孔,而導致粒線體中的凋亡因子 釋放,活化 Caspase ,導致細胞凋亡 Bcl-2 family
  8. 8. Intrinsic ( Mitochondrial ) Pathway Apoptosis Mitochondria Cytochrome c Mcl-1 ↓ Bax cleavage Bcl-x L ↓ cas-9 ROS↑ GSH↓ DFF-45 CAD cas-3 Nucleus Apoptosis Δ Ψm↓
  9. 9. Mcl-1 ↓ Bax cleavage Bcl-x L ↓ caspase-3 Fas Fas L cas-8 tBid Bid Mitochondria cas-9 Apoptosis
  10. 10. Purpose
  11. 11. ? Apoptosis Hard Clam
  12. 12. Meterials and Methods
  13. 13. MTT assay terazolium formazan 570 nm 黃色 紫色 dehydrogenase hello
  14. 14. Analysis of apoptosis by cell dying Acridine orange stain 利用 Acridine orange 染劑能與核酸親和的特性,其會嵌入 DNA 與 RNA 中,使用螢光顯微技術下可清楚觀測細胞經處理後整體型態與核內染色質的改變 Morphology hello
  15. 15. look me Analysis of apoptosis by cell dying PI Stain 可以和細胞內的 DNA 結合,且結合量與 DNA 的量成正比,使用 Flow cytometer 來計算各細胞的 PI 含量,可以了解處於不同細胞週期的細胞數目多寡。 Flow cytometry
  16. 16. Analysis of apoptosis by cell dying Annexin V-FITC stain Fluorescence ↑ Apoptosis cells ↑ ; Fluorescence ↓ Apoptosis cells ↓ Flow cytometry Annexin V-FITC PS
  17. 17. Determination of ROS generation happy Flow cytometry ROS DCF Flow cytometry DCFH DCFH-DA Fluorescence ↑ ROS ↑ ; Fluorescence ↓ ROS ↓
  18. 18. GSH CMF Flow cytometry CMF CMF-DA Determination of GSH depletion Cell esterase Flow cytometry Fluorescence ↑ GSH ↑ ; Fluorescence ↓ GSH ↓
  19. 19. Analysis of mitochondrial transmembrane potential DiOC 6 stain 粒線體膜電位的存在,會使一些親脂性陽離子螢光染料:《 DiOC 6 》結合到粒線體基質,然後再利用流式細胞計檢測細胞的螢光強度 其螢光的增強或減弱說明粒線體膜電位的增高或降低 Flow cytometry
  20. 20. specific substrate release (AMC) Fluorescence spectrophotometer 產生黃綠色螢光 Caspase caspase specific substrate-(AMC) caspase specific substrate-(AMC) Fluorescence ↑ active caspase ↑ ; Fluorescence ↓ active caspase ↓ 激發光 360 nm Caspase 發射光 460 nm Fluorogenic assay
  21. 21. Results
  22. 22. 抑制 50% 酵素活性所需要的藥物濃度 COLO 205 : 結腸癌細胞 SK-Hep 1 : 肝癌細胞 HL-60 : 人類骨髓白血病細胞株 AGS : 胃癌細胞 THP-1 : 人類白血病單核球細胞株 PMNs : 健康人類的多形核中性球 6 hrs MTT assay Table 1
  23. 23. agarose gel electrophoresis Fig. 1 dose dependent time dependent
  24. 24. /6 hrs 染色質皺縮 Acridine orange 觀測細胞經處理後整體型態與核內染色質的改變 Fig. 1
  25. 25. annexin V-FITC staining and flow cytometry Right shift Apoptosis ↑ Fig. 1
  26. 26. dose time Fig. 2
  27. 27. left shift Δ Ψm ↓ Δ Ψm↓ Cytochrome c cas-9 cas-3 Fig. 3 Mitochondria
  28. 28. Δ Ψm↓ Cytochrome c cas-9 cas-3 Fig. 3 Mitochondria
  29. 29. Right shift ROS ↑ left shift GSH ↓ Fig. 4
  30. 30. caspase 9 在 1 hr 可看到明顯的上升 caspase 3,8 在 2,3 hr 看到上升 9 Fig. 5 3 8 1,6 2
  31. 31. -> caspase inhibitor Fig. 5
  32. 32. a -> allopurinol b -> catalase c -> DPI d -> NAC e -> PDTC f -> SOD , GSH c a f b d e Fig. 5
  33. 33. dose time DNA repair ↓ cas-3 PARP Apoptosis Fig. 6
  34. 34. cas-3 ( inhibitor of CAD ) DNA fragmentation Fig. 6 DFF-45 CAD DFF-45 CAD
  35. 35. Fig. 7
  36. 36. tBid Bid cas-8 Fig. 8 Fas Fas L FADD Pro-cas-8
  37. 37. Fig. 8 Fas Fas Ligand
  38. 38. Discussion
  39. 39. Intrinsic Pathway Extrinsic Pathway
  40. 40. 市售蜆精一覽表 80 元 綠川黃金蜆精 60 元 蒜味重 ★ ( 多 3%) 白蘭氏蜆精 ★ 50 元 ★ 台糖蜆精 零售價格 調味 ( 口味 ) 蜆精濃度
  41. 41. Thank you for your attention

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