tesi_definitiva_cistationina-libre

Indice generale
1 Introduzione.................................................................................................................................3
1.1 Metabolismo dello zolfo e dei composti solforati.............................................................4
1.1.1 Assimilazione dello zolfo............................................................................................4
1.1.2 Anabolismo dei composti solforati.............................................................................5
1.1.3 Sintesi degli aminoacidi solforati...............................................................................6
1.1.4 Metabolismo e riparazione degli aminoacidi solforati..............................................7
1.1.5 Riciclo della metionina ed equilibrazione del pool di sostanze solforate................8
1.1.6 Corredo enzimatico ed esigenze nutrizionali.............................................................9
1.2 Struttura e funzione degli enzimi coinvolti......................................................................11
1.2.1 Il gruppo degli enzimi non PLP-dipendenti.............................................................11
1.2.2 Gli enzimi PLP dipendenti: evoluzione e meccanismi............................................12
1.2.3 Il gruppo degli enzimi PLP-dipendenti....................................................................13
1.2.3.1 Enzimi del sottotipo β........................................................................................14
1.2.3.2 Enzimi del sottotipo γ........................................................................................16
1.2.3.3 Meccanismo di reazione....................................................................................17
1.2.3.4 Struttura e specificità.........................................................................................19
1.3 Metabolismo e regolazione nei batteri lattici...................................................................21
1.3.1 Lactococcus lactis......................................................................................................23
1.3.2 Streptococcus thermophilus......................................................................................26
1.4 Tecniche cromatografiche per l'analisi di metaboliti.......................................................27
1.4.1 Analisi degli aminoacidi............................................................................................28
1.4.2 Utilizzo degli alchil-cloroformati in gascromatografia...........................................29
1.4.2.1 Meccanismo di reazione....................................................................................30
2 Scopo della tesi..........................................................................................................................33
3 Materiali e metodi.....................................................................................................................35
3.1 Preparazione dei materiali.................................................................................................36
3.1.1 Materiali utilizzati.....................................................................................................36
3.1.2 Preparazione del terreno LB.....................................................................................36
3.1.3 Preparazione del terreno SOC...................................................................................36
3.1.4 Preparazione dei tamponi..........................................................................................37
3.1.5 Preparazione del buffer di lisi...................................................................................37
3.1.6 Preparazione dello standard di PLP e DTNB...........................................................37
3.1.7 Preparazione delle soluzioni standard di aminoacidi..............................................38
3.2 Analisi bioinformatica.......................................................................................................38
3.2.1 Analisi della sequenza e del contesto.......................................................................38
3.3 Preparazione dell'enzima ricombinante............................................................................38
3.3.1 Rivitalizzazione delle colonie...................................................................................39
3.3.2 Estrazione del DNA...................................................................................................39
3.3.3 Trasformazione delle cellule BL21...........................................................................39
3.3.4 Espressione della proteina ricombinante..................................................................39
1

3.3.5 Purificazione della proteina......................................................................................40
3.4 Preparazione dell'apoenzima.............................................................................................40
3.4.1 Verifica spettrofotometrica della formazione di derivati del PLP..........................41
3.4.2 Protocolli per la risoluzione del cofattore dall'enzima............................................41
3.4.2.1 Preparazione a piccola scala con cisteina.........................................................41
3.4.2.2 Preparazione a media scala con cisteina...........................................................41
3.4.2.3 Preparazione a grande scala con cisteina.........................................................41
3.4.2.4 Preparazione a media scala con idrossilammina..............................................42
3.5 Test di attività enzimatica mediante DTNB.....................................................................42
3.6 Quantificazione dell'enzima..............................................................................................42
3.6.1 Metodo Protparam.....................................................................................................42
3.6.2 Metodo Bradford non corretto..................................................................................43
3.6.3 Metodo Bradford corretto..........................................................................................43
3.7 Analisi dell'interazione PLP-enzima................................................................................44
3.7.1 Spettrofotometria UV-visibile..................................................................................44
3.7.2 Fluorimetria................................................................................................................44
3.7.3 Spettropolarimetria....................................................................................................45
3.7.3.1 Selettività del metodo........................................................................................45
3.7.3.2 Analisi quantitativa............................................................................................45
3.8 Analisi dei prodotti della reazione enzimatica.................................................................47
3.8.1 Derivatizzazione degli aminoacidi...........................................................................47
3.8.2 Analisi gascromatografica.........................................................................................47
3.8.3 Identificazione dei picchi degli analiti, dei prodotti secondari di reazione e messa
a punto del metodo SIM......................................................................................................48
3.8.4 Costruzione della retta di calibrazione.....................................................................48
3.8.5 Calcolo del limite di rivelazione e quantificazione.................................................50
3.8.6 Valutazione dell'attività enzimatica..........................................................................50
4 Risultati e discussione...............................................................................................................53
4.1 Espressione e purificazione dell'enzima ricombinante...................................................54
4.2 Analisi bioinformatica.......................................................................................................55
4.2.1 Analisi e comparazione delle sequenze....................................................................55
4.3 Produzione dell'apoenzima...............................................................................................58
4.4 Test di attività enzimatica mediante DTNB.....................................................................59
4.5 Quantificazione dell'enzima..............................................................................................60
4.6 Valutazione dell'interazione PLP-enzima.........................................................................60
4.6.1 Misura mediante dicroismo circolare......................................................................61
4.7 Analisi dei prodotti della reazione enzimatica.................................................................63
4.7.1 Messa a punto del metodo.........................................................................................63
4.7.2 Misura dell'attività enzimatica..................................................................................66
5 Conclusioni................................................................................................................................69
6 Abbreviazioni.............................................................................................................................71
7 Bibliografia................................................................................................................................73
2

Introduzione
1.1 Metabolismo dello zolfo e dei composti solforati
Lo zolfo è il quinto elemento più importante nelle molecole di origine biologica dopo
carbonio, idrogeno, ossigeno ed azoto. A differenza di queste molecole, però, il suo
coinvolgimento nei processi biologici non è universale, bensì limitato ad una serie di
famiglie di composti. Tra queste troviamo gli aminoacidi solforati, la classe più importante
per il ruolo chiave nella cellula e per l'universalità della loro presenza, e poi molti cofattori
necessari per il funzionamento degli enzimi. Nel metabolismo gnerale dello zolfo si possono
distinguere tre vie metaboliche ben distinte: la sintesi degli aminoacidi solforati e dei
coenzimi o gruppi prostetici solforati, il catabolismo e l'equilibrazione del pool di molecole
solforate ed il riciclo della metionina [1][2][3].
Illustrazione 1: Alcuni composti solforati. I:
S-Adenosilmetionina, II: taurina, III: coenzima-A, IV:
molibdopterina, V: glutatione, VI: tiamina, VII: acido
lipoico
Illustrazione 2: Schema generale dell'anabolismo dei composti solforati
1.1.1 Assimilazione dello zolfo
Lo zolfo inorganico può presentarsi sotto la forma di zolfo molecolare, ione solfuro (SH-
),
solfato (SO4
2-
), solfito (SO3
2-
) o tiosolfato (S2O3
2-
). La cellula può assimilare tutte queste
forme ma prima di poterle utilizzare per l'anabolismo deve ridurle allo stato di solfuro,
inoltre l'assimilazione dello zolfo è un processo energeticamente costoso per la cellula.
Innanzitutto queste molecole cariche negativamente devono essere trasportate all'interno
della cellula contro il gradiente di potenziale elettrico: questo viene effettuato da proteine di
membrana di tipo ABC che sfruttano allo scopo l'energia derivante dall'idrolisi di una
molecola di ATP. Devono quindi essere fissate in un composto organico: ad esempio il primo
passo dell'assimilazione del solfato, è la sua incorporazione in una molecola di ATP per
produrre adenosina-5'-fosfosolfato. Questa reazione è sfavorita termodinamicamente e per
poter procedere nel senso dell'incorporazione dello zolfo richiede la contemporanea idrolisi
di una molecola di GTP. La riduzione è infine effettuata da una complessa serie di enzimi
4
ON
H
N
HO
N
N
H
NH2
SH
SH
O
P
O
OH
OH
N
NH
O
OH
O
OH
NH2 O
SH
O
H
S
S
O
OH
SO
O
OH NH2
S
N
+
N
N
NH2
OH
OP
O
OH
OP
O
OH
O
ON
N
NN
NH2
OH O
P
O
OH
OH
NH NH
SH
OH
O O
I
I I
I I I
I V V
V I
S
+
O
N
N
NN
NH2
OH OH
NH2
O
OH
V I I

Metabolismo dello zolfo e dei composti solforati
NADH dipendenti. Lo zolfo ha un potenziale redox molto elevato pertanto tende ad ossidarsi
facilmente: in ambienti aerobici quindi la sua assimilazione diventa ancora più costosa,
poiché la cellula avrà maggiori difficoltà a mantenere il corretto potenziale redox al suo
interno e avrà scarsa disponibilità di substrati già ridotti. Appare quindi evidente che vi è una
forte spinta verso l'utilizzo di fonti già ridotte, e che l'intera via metabolica deve essere
finemente regolata per evitare inutili sprechi.
La fonte di zolfo più facilmente sfruttabile sono gli aminoacidi solforati ed i peptidi che li
contengono poiché il loro utilizzo elimina la necessità sia della riduzione che del fissaggio.
Quando questi sono disponibili, per esempio quando un microorganismo cresce in un
substrato organico ricco, la cellula cresce molto più rapidamente. Esistono permeasi
specifiche per cisteina, cistina, omocisteina, omocistina e metionina, anche se si suppone che
alcune possano avere specificità multiple.
Oltre alle molecole già menzionate alcuni organismi possono assimilare molte altre
molecole organiche, comprese quelle che contengono zolfo sotto forma ossidata, come solfati
organici, solfonati, tiosolfati, solfinati, solfossidi, solfoni e cisteina-S-coniugati. Queste
sostanze vengono prodotte da organosolforati per ossidazione spontanea o nel metabolismo
aerobico. La loro degradazione può essere necessaria qualora non siano presenti altre fonti di
zolfo, oppure quando una elevata concentrazione esponga la cellula ad effetti tossici. Esse
vengono trasportate nella cellula e vengono ridotte ed infine assimilate con meccanismi del
tutto simili a quelli citati in precedenza.
Illustrazione 3:
fonti organiche di
zolfo.
Illustrazione 4: Assimilazione dello zolfo inorganico
1.1.2 Anabolismo dei composti solforati
Tutto il solfuro che viene utilizzato dalla cellula viene quindi fissato in due aminoacidi:
cisteina e omocisteina, che rappresentano un fondamentale punto di controllo del
metabolismo cellulare. Questi due aminoacidi hanno una struttura simile, con la differenza
5
R O S OH
O
O
R S S
O
OH
O
R S
O
OH
O
R S
O
OH
SOH
O
NH2
R
I I I
II I IV
V

Introduzione
che la cisteina possiede uno scheletro carbonioso di tre atomi, che deriva dalla serina, e
l'omocisteina uno scheletro carbonioso a quattro atomi che deriva dall'omoserina.
Dall'omocisteina con la metilazione allo zolfo deriva la metionina, che può subire diversi
destini: essere incorporata nelle proteine, convertita in S-adenosilmetionina o etilene, o
utilizzata per la sintesi della spermidina. La metionina è particolarmente importante per la
sintesi proteica poiché è sempre incorporata dal ribosoma come primo residuo (il codone
nucleotidico che la codifica è anche il codone di inizio traduzione)[4]. La
S-adenosilmetionina è il principale agente metilante all'interno della cellula ed è il cofattore
di molti enzimi. E' importante notare che in tutte queste reazioni la metionina funge come
donatore di gruppi metile, mentre lo zolfo rimane sempre legato allo scheletro carbonioso.
Dopo essere stata utilizzata, la SAM segue una serie di reazioni definite pathway di recupero
della metionina, che consentono di ottenere nuovamente una molecola di omocisteina, che
può essere metilata e nuovamente utilizzata nel ciclo.
La cisteina, al pari della metionina, può essere incorporata nelle proteine, dove svolge due
ruoli diversi. Il gruppo tiolico può essere coinvolto nel sito attivo della catalisi negli enzimi,
oppure dimerizzare formando un ponte disolfuro, fondamentale nella stabilizzazione della
struttura secondaria. L'atomo di zolfo della cisteina, a differenza della metionina, è invece
utilizzato nella sintesi della quasi totalità delle molecole solforate nella cellula. Tra le più
importanti ricordiamo il glutatione, l'acido lipoico, il coenzima A, la molibdopterina, la
taurina, la tiamina, i glucosinolati ed i cluster ferro-zolfo. La cisteina si presenta nella forma
nativa solo in ambienti riducenti, poichè tende facilmente ad ossidarsi ed a dimerizzare a
cistina. Quest'ultima può in alcuni casi essere utilizzata dalla cellula tal quale, ma più spesso
viene prima ridotta da una molecola di NADH.
1.1.3 Sintesi degli aminoacidi solforati
Gli aminoacidi solforati possono essere divisi in due gruppi a seconda dell'aminoacido
idrossilato da cui sono sintetizzati e quindi dalla lunghezza dello scheletro carbonioso. La
cisteina, che ha una catena di tre residui, deriva dalla serina; mentre la omocisteina e la
metionina prendono la loro catena a quattro atomi di carbonio dall'omoserina.
Illustrazione 5: principali aminoacidi solforati. I: cistationina II: cistina
III: cisteina IV: omocisteina V: metionina. E' evidenziato in rosso lo
scheletro della cisteina ed in blu quello della metionina.
6
OH S
OH
O
NH2
NH2
O
OH S
S OH
O
NH2
NH2
O
OH SH
O
NH2
OH
O
NH2
SH
OH
O
NH2
S
CH3
I II
II I I V V

Come primo passo la serina viene acetilata sull'ossidrile dall'enzima serina transacetilasi
producendo l'estere O-acetilserina. La O-acetilserina sulfidrilasi – cisteina sintasi poi
catalizza la reazione di sostituzione tra il gruppo acetato e l'idrogeno solfuro, rilasciando
acido acetico e cisteina. L'omocisteina può venire sintetizzata in maniera del tutto
equivalente a partire dall'omoserina tramite gli enzimi omoserina acetilasi e
O-acetilomoserina sulfidrilasi.
La metionina deriva dall'omocisteina per aggiunta di un gruppo metile che proviene dal
metabolismo del C1 ed esistono due enzimi chiamati metionina sintasi in grado di catalizzare
questa reazione. Uno utilizza la vitamina B12 come cofattore, prende il gruppo metile dal
5-metil-tetraidrofolato; mentre l'altro non richiede gruppo prostetico e prende il gruppo
metile dal 5-metil-tetraidropteril-tri-L-glutammato, ma è circa cento volte più lento. La
presenza di due enzimi è giustificata dal fatto che la sintesi della vitamina B12 è dispendiosa
ed in alcuni microorganismi deve essere assorbita dall'esterno; pertanto è utile disporre di
una via sintetica alternativa per quanto meno efficiente.
Esiste poi una via per convertire la cisteina in omocisteina e viceversa passando attraverso
la cistationina. Questo passaggio è necessario quando una cellula deve poter ottenere uno dei
due sopracitati aminoacidi senza dover fissare zolfo inorganico de novo. La cistationina può
essere immaginata come una molecola con una parziale simmetria: al centro si trova un
atomo di zolfo che unisce tramite un legame tioetere due aminoacidi: da un lato però la
catena carboniosa è lunga tre atomi (la parte derivante dalla serina) e dall'altra quattro (la
parte derivante dall'omoserina). Essa può essere ottenuta dalla condensazione della
O-succinilomoserina con la cisteina, catalizzata dalla cistationina gamma sintasi; e poi
essere scissa in omocisteina, acido piruvico ed ammoniaca dalla cistationina β-liasi . In
alternativa può essere sintetizzata dalla cistationina β-sintasi a partire da O-succinilserina e
omocisteina e poi essere scissa in cisteina, acido alfa-ketobutirrico ed ammoniaca dalla
cistationina γ-liasi.
Illustrazione 6: conversione degli aminoacidi solforati.
1.1.4 Metabolismo e riparazione degli aminoacidi solforati
Dato che l'assimilazione dello zolfo ha un costo elevato, esistono sistemi molto efficienti
per recuperare quello già assimilato, quando le molecole in cui è incorporato si degradano.
La cisteina tende a dimerizzare a cistina, che rappresenta un componente importante per la
stabilizzazione della struttura delle proteine. Quando queste sono catabolizzate nel normale
7

Introduzione
turnover, la cistina deve essere ridotta per poter essere riciclata: questo compito è svolto da
una catena di reazioni redox che utilizzano come donatore iniziale di elettroni NADH. In
alternativa in presenza di ossigeno molecolare la cisteina può ossidarsi spontaneamente ad
acido cisteico. Questo viene poi decarbossilato a taurina, che dopo alcuni passaggi alla fine
viene degradata a piruvato e solfato inorganico. In alternativa può essere ridotta nuovamente
a cisteina con la concomitante ossidazione di una molecola di solfuro a solfito. La
degradazione della metionina nelle proteine può avvenire per via di agenti ossidanti endogeni
od ambientali. La cellula ha due modi per trattare le proteine contenenti metionine ossidate:
degradarle oppure ridurre il residuo in situ. Questo compito è svolto dalla peptidil-metionina
reduttasi che inoltre può funzionare anche sull'aminoacido libero.
1.1.5 Riciclo della metionina ed equilibrazione del pool di sostanze
solforate
Nelle vie metaboliche descritte sopra, la cistationina svolge un ruolo fondamentale poiché
consente di passare da omocisteina a cisteina indiscriminatamente qualora un organismo
disponga di tutti gli enzimi necessari. La metionina invece non può essere direttamente
demetilata a omocisteina, pertanto per riutilizzare lo zolfo in essa contenuto deve passare
attraverso la via del recupero della metionina. Il primo passo è la conversione catalizzata
dalla SAM sintasi a S-adenosilmetionina, che dopo aver ceduto ad un accettore il gruppo
metilico, diventa S-adenosilomocisteina. Quest'ultima è poi idrolizzata a omocisteina da
xxxxxx; quindi l'omocisteina nuovamente formata può essere utilizzata per un nuovo ciclo di
metilazioni oppure essere trasformata in cistationina.
Illustrazione 7: schema generale del metabolismo degli aminoacidi solforati. In rosso è evidenziata la
transsulfurazione diretta, in blu la transsulfurazione inversa.
8

Esistono poi anche altre possibilità per recuperare lo zolfo. La cisteina può essere
direttamente desulfurata dalla cisteina β-liasi, oppure degradata passando per la
3-sulfino-L-alanina, liberando SH2 e piruvato. Anche l'omocisteina può essere desulfurata, e
la metionina può essere scissa dalla metionina gamma liasi in acido alfa-ketobutirrico e
metantiolo. Quest'ultimo poi può essere ossidato dalla metantiolo ossidasi in formaldeide e
solfato inorganico, che verrà poi ridotto ed assimilato. In alternativa la metionina può essere
transaminata con un accettore come l'alfa-ketoglutarato per dare acido
alfa-keto-gamma-metiltiobutirrico, che è quindi degradato a metantiolo.
1.1.6 Corredo enzimatico ed esigenze nutrizionali
Appare quindi evidente come esista una complessa rete che consente di convertire fra di
loro gli aminoacidi solforati, che sono il punto di partenza di molte biosintesi, a seconda
delle necessità della cellula. In particolare si possono distinguere due super-vie metaboliche,
che collegano i due aminoacidi chiave (cisteina e metionina) definite transsulfurazione
diretta ed inversa. Oltre alle due vie principali poi compaiono molti altri processi “laterali”,
che tuttavia nelle condizioni opportune possono anche sostituire o complementare con
diversa efficienza. In totale, contando tutti i punti in cui le vie si ricollegano e poi si
separano, è possibile contare 18 diversi percorsi che portanto dalla cisteina alla metionina
[5]. Questo può consentire di effettuare il metabolismo dei composti solforati con maggior
efficienza anche al variare delle fonti nutrizionali o dello stato del batterio (per esempio in
condizioni di stress, carenza di cibo, etc...). E' stato poi osservato che anche alcuni
microorganismi apparentemente privi degli enzimi chiave del metabolismo dei solforati sono
in grado di crescere utilizzando come fonte di zolfo molecole che apparentemente non
potrebbero utilizzare: è logico attribuire questo fenomeno alla straordinaria plasticità
evolutiva osservata.
Non tutti gli organismi dispongono di tutto questo patrimonio enzimatico per intero, più
spesso se è presente la via diretta è assente quella inversa, e viceversa. Anche le vie
alternative appena elencate non sempre sono presenti, oppure hanno una efficienza molto
bassa; per questo motivo diversi organismi hanno esigenze nutrizionali complesse per i
composti solforati, e crescono molto lentamente o non crescono del tutto quando ne vengono
privati.
Per esempio E. coli non può utilizzare la metionina come unica fonte di zolfo, mentre
cresce quando è presente la sola cisteina; inoltre è in grado di sintetizzare solo la cisteina
dallo zolfo inorganico. Probabilmente anche se il batterio è privo della transsulfurazione, ciò
non rappresenta un problema nell'ambiente in cui normalmente vive, ovvero l'apparato
digerente, che è caratterizzato dall'abbondanza di nutrienti e dall'anaerobiosi. Quando il
batterio raggiunge la fase stazionaria di crescita, tutta la metionina è riutilizzata nel ciclo
della SAM, la neosintesi delle proteine è ridotta e può essere maggiore l'eliminazione dello
zolfo in eccesso piuttosto che il suo riciclo [6].
9

Introduzione
Illustrazione 8: Distribuzione dei geni del metabolismo della metionina in vari organismi. HTA: omoserina trans-acetilasi, HTS: omoserina
trans-succinilasi, HSK: omoserina chinasi (non citata in questa tesi), CGS: cistationina γ-sintasi, CIMS: metionina sintasi
cobalamina-indipendente, CDMS: metionina sintasi cobalamina-dipendente. (Da Gophna, 2005)
10

I batteri gram positivi invece generalmente hanno la capacità di sintetizzare omocisteina
direttamente dallo zolfo inorganico. Ad esempio Pseudomonas aeruginosa dispone di tutti gli
enzimi, quindi può sintetizzare omocisteina e cisteina dallo zolfo inorganico e convertire
questi due composti a seconda delle esigenze. Anche Pseudomonas putida può fissare lo
zolfo in entrambi i composti però non può convertire la metionina via cistationina, ma può
sfruttarla per liberare metantiolo [7]. Anche Bacillus subtilis dispone di entrambe le vie di
transsulfurazione, oltre a poter sintetizzare ex novo cisteina e omocisteina [8].
1.2 Struttura e funzione degli enzimi coinvolti
Gli enzimi coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi solforati sono molti, e catalizzano
una serie di reazioni molto diverse fra loro. La tabella 1 è un tentativo di classificare questi
enzimi, secondo criteri filogenetici, strutturali e funzionali [9][10]. Appare subito evidente
che il gruppo degli enzimi piridossal-fosfato dipendenti è il più importante: esso contiene
enzimi strettamente correlati fra di loro sotto tutti i punti di vista, ed al suo interno è
possibile effettuare una classificazione che soddisfi contemporaneamente tutti i criteri citati
summenzionati. Il secondo gruppo è invece molto più eterogeneo, e la classificazione deve
essere vista come una guida approssimativa.
enzimi PLP-dipendenti
fold α
sub-fold γ
CYS desulfurasi
CTT γ sintasi
CTT γ liasi
CTT β liasi
OSHS sulfidrilasi
sub-fold ATI CTT β liasi tipo malY
fold β
CTT β sintasi
OAS solfidrilasi
enzimi non PLP-dipendenti
α/β idrolasi HTA HSER acetiltransferasi/succiniltransferasi
GLN amidotransf. classe I HTS HSER succiniltransferasi/acetiltransferasi
O-aciltransferasi esameriche acetiltransferasi SER acetiltransferasi
URO-D/CIMS CIMS MET sintasi
3 diversi domini conservati MET sintasi B12 dipendente
Tabella 1: Classificazione degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi solforati.
1.2.1 Il gruppo degli enzimi non PLP-dipendenti
Questo gruppo presenta due coppie di enzimi non correlati fra loro ma evolutivamente
convergenti (HSER acetiltransferasi e succiniltransferasi, e MET sintasi e MET sintasi B12
dipendente), ed un enzima senza alcun legame con gli altri (SER acetiltransferasi). La HTA
appartiene alla famiglia della idrolasi α/β [11], mentre la HTS a quella delle glutamina
amidotransferasi. Pur essendo molto differenti tra loro, esistono membri in ogni famiglia in
grado di catalizzare la reazione normalmente specifica dell'altra [12]. Dal momento che basta
anche la sola sostituzione di un residuo nel sito attivo è difficile predire dalla sola sequenza
quale reazione sarà catalizzata. E' molto importante tenere conto di questo fattore poiché
microorganismi diversi hanno preferenze diverse nell'utilizzo di O-acilomoserine nella
11

Introduzione
sintesi della cistationina o dell'omocisteina, e non è stato ancora chiarito se questo dipenda
dalla sintesi esclusiva o dall'utilizzo preferenziale di uno dei due substrati [5]. Dato che per
verificare l'attività degli enzimi successivi nella via metabolica è necessario conoscere il
substrato di preferenza è di massima importanza svolgere prove pratiche.
Anche le due metionina sintasi sono completamente diverse nella struttura, e, pur con
efficienze diverse, catalizzano la stessa reazione (cfr. paragrafo 1.1.3). L'isozima non
B12-dipendente presenta una similitudine di sequenza con le
uroporfirinogeno-decarbossilasi, assieme alle quali è raggruppata in una famiglia in Pfam
(URO_D_CIMS). La proteina richiede zinco come cofattore, ed è costituita da due domini
molto simili fra loro, di cui però uno ha perso i residui di legame al substrato. La forma
B12-dipendente invece ha una struttura caratteristica, in cui si possono individuare quattro
distinti domini. A partire dall'estremità carbossi-terminale si trovano il dominio dell'effettore
(SAM), quindi quello di legame della vitamina B12, quello di legame della pteridina ed
infine una sequenza conservata caratteristica di questa proteina. Mentre i domini di legame
per i cofattori sono motivi condivisi con altre proteine, gli altri due hanno caratteristiche di
unicità.
1.2.2 Gli enzimi PLP dipendenti: evoluzione e meccanismi
Prima di descrivere le caratteristiche degli enzimi PLP-dipendenti coinvolti nel
metabolismo dello zolfo, è importante fare una breve panoramica sul funzionamento e
l'evoluzione delle proteine che lo utilizzano come coenzima. Il PLP rappresenta
probabilmente il cofattore più versatile nella biologia, tanto che gli enzimi che lo utilizzano
si trovano in non meno di quattro delle sei classi EC [13]. Nonostante questa grande varietà
di funzioni, tutti gli enzimi PLP-dipendenti appartengono a soli cinque gruppi strutturali
diversi, che probabilmente corrispondono a cinque lineaggi evolutivi indipendenti [14].
La maggior parte di questi enzimi agisce sugli aminoacidi, e questo è denotato da alcune
importanti caratteristiche comuni. Il PLP è sempre legato al gruppo ε-amminico di un residuo
di lisina del sito attivo, formando la cosiddetta “aldimmina interna”. Questo termine deriva
da “aldeide” (poiché il doppio legame si trova dove prima si trovava il doppio legame del
gruppo aldeidico), “immina” (o base di Schiff) ed è definita interna poiché il gruppo ammino
deriva da un aminoacido della stessa proteina. Il primo passaggio del ciclo catalitico, uguale
per tutte le proteine, è la sostituzione del gruppo ε-amminico con quello α-amminico del
substrato per formare una “aldimmina esterna”. Quindi i passaggi successivi divergono a
seconda della reattività specifica di ogni enzima. In tutti i casi il PLP agisce come un
“attrattore di elettroni”, accumulando gli elettroni derivanti dal substrato che subisce una
eliminazione e restituendoli per la formazione di un nuovo legame: tutte le reazioni
catalizzate dal PLP sugli aminoacidi infatti prevedono la rottura di un legame in α. La
selettività del taglio è determinata dall'orientamento dei legami in α del substrato rispetto al
cofattore [15]: è stato verificato che il legame scisso giace assieme a quello fra il carbonio e
l'azoto in α su un piano ortogonale a quello del sistema aldimmina-anello piridinico.
12

Struttura e funzione degli enzimi coinvolti
Illustrazione 9: Ipotesi stereoelettronica di Dunathan (Da Eliott 2004)
Una prima suddivisione degli enzimi PLP-dipendenti sulla base della sequenza [16] aveva
già individuato tre sottogruppi caratterizzati dal catalizzare reazioni rispettivamente al
carbonio α, β o γ. In seguito sono stati scoperti altri sottotipi di enzimi e l'attuale
classificazione prevede 5 famiglie, suddivise sulla base della struttura terziaria [17]. La
famiglia (fold) I è quella più numerosa e con i membri più diversi fra loro, mentre le altre
presentano una relativa omogeneità strutturale al loro interno. Tutte le famiglie (fold)
presentano motivi strutturali completamente diversi fra loro, eppure condividono un
meccanismo di reazione simile. Il fold V costituisce una eccezione poiché sfrutta il gruppo
fosfato del PLP anziché il carbonile. L'opinione corrente sull'evoluzione degli enzimi PLP
dipendenti è che ognuno di questi fold abbia avuto origine indipendentemente, e che
l'omogeneità dei meccanismi di reazione dipenda da costrizioni evolutive legate alla struttura
del cofattore [17].
1.2.3 Il gruppo degli enzimi PLP-dipendenti
Al centro ideale del metabolismo degli aminoacidi solforati si trovano alcuni enzimi
accomunati da alcune caratteristiche: tutti hanno una struttura simile, utilizzano il PLP come
cofattore e catalizzano reazioni di eliminazione o eliminazione/sostituzione sul carbonio in β
o γ degli aminoacidi. Inoltre sono caratterizzati da una certa promiscuità catalitica: ovvero,
benchè specializzati in una particolare reazione, sono spesso in grado di catalizzare con
minor efficacia una reazione secondaria sugli stessi substrati, oppure di accettare substrati
differenti. Le differenze fra i membri di questa famiglia talvolta si rivelano solo dopo uno
studio dettagliato, e spesso quando viene scoperta una nuova sequenza genetica le
annotazioni preliminari le assegnano spesso una funzione non corretta. Anziché essere
oggetto di verifiche queste indicazioni imprecise vengono prese per vere, creando un errore
di fondo nelle ricerche scientifiche successive.
13

Introduzione
Alexander 1993 Grishin 1995 Christen 2001 Enzimi rappresentativi
α family
Fold I α family Aspartato amminotransferasi
γ family
β family Fold II β family Triptofano sintasi subunità β
Fold III D-alanine aminotransferase family D-alanina aminotransferasi
Fold IV Alanine racemase family Alanina racemasi
Fold V Glicogeno fosforilasi
Tabella 2: Classificazione degli enzimi PLP dipendenti
1.2.3.1 Enzimi del sottotipo β
La cistationina β-sintasi e la O-acetilserina sulfidrilasi sono i membri più rappresentati di
questa famiglia. Le due proteine, benchè diverse nella sequenza, presentano diversi motivi
molto conservati relativi al sito catalitico, all'interfaccia del dimero ed al legame del
cofattore, hanno un meccanismo di reazione uguale e agiscono su substrati simili. Oltre a
queste caratteristiche conservate sia nei procarioti che negli eucarioti, possono essere
presenti o meno vari domini regolatori [9]. Sono note le strutture tridimensionali di entrambe
le proteine provenienti da diversi organismi [18][19][20][21][22] che, al pari delle sequenze,
appaiono simili fra di loro (cfr Illustrazione 10). La reazione catalizzata si svolge in due fasi:
nella prima una serina O-acilata si lega al cofattore e subisce l'eliminazione del gruppo
acilico in β per formare un intermedio aminoacrilato. Questo subisce quindi l'attacco di un
nucleofilo solforato per formare il prodotto finale, che si libera dal cofattore e lo rende
disponibile per un nuovo ciclo. La OASS utilizza come nucleofilo lo ione solfuro per
produrre cisteina, mentre la CBS utilizza cisteina per produrre cistationina. L'aminoacrilato è
un intermedio stabile, e ciò determina una cinetica definita a “ping-pong”; in mancanza del
secondo substrato nucleofilo questo intermedio è rilasciato ed una volta libero idrolizza
spontaneamente ad acido piruvico [23].
Illustrazione 10: Sovrapposizione delle strutture
tridimensionali delle due isoforme di OASS di E. coli
(cysK e cysM).
14

Illustrazione 11: Meccanismo di reazione della OASS (sotto) e della CBS (sopra).
Oltre allo ione solfuro, molti altri nucleofili possono partecipare alla reazione: ad esempio
in E. coli esistono due isoforme di OASS (cysK e cysM), la seconda delle quali ha la
capacità di utilizzare lo ione tiosolfato per formare S-sulfo-cisteina da O-acetilserina [20].
Inoltre è stato dimostrato che l'enzima può catalizzare l'addizione di altri nucleofili, anche
non solforati, per produrre aminoacidi non naturali [24][25].
Zhao Meyer Zhao Meyer
cysK cysM cysK cysM cysK cysM cysK cysM
Solfuro di sodio +++ ++ +++ +++ Cysteamine - -
Tiosolfato di sodio - + - +++ 5-carbossi-1,2,3-benzotriazolo ++ +
Benzentiolo ++ ++ ++ +++ 8'-azoguanina - +
3-mercapto-1,2,4-triazolo - + + +++ 1,2,4-oxadiazolidna-3,5-dione - +
Sodio azide ++ - +++ +++ Fenilselenolo ++ +++
1,2,4-triazolo ++ + +++ ++ Cianato di potassio +++ +++
1,2-pirazolo + - ++ ++ Mercaptoetanolo +++ +++
1,2,3,4-tetrazolo + + +++ ++ 2-mercapto-tiazolo ++ +++
1,2,3-benzotriazolo ++ - ++ +
Tabella 3: Reattività delle due isoforme di OASS di E. coli con alcuni nucleofili. I segni + indicano una buona
reattività, i segni – nessuna reattività, il campo vuoto indica che non sono stati ottenuti i dati. Fonte: Zhao (2006) e
Meyer (2003), modificato.
Sempre in E. coli l'isoforma cysK, oltre a formare un omodimero, può formare un
eteromultimetro multifunzionale con la serina transacetilasi in cui un monomero di OASS si
lega ad un trimero di STA; é stata inoltre dimostrata l'esistenza di un simile complesso anche
in altri eubatteri e nelle piante [26]. La OASS ha la massima attività quando è nella forma di
omodimero. Quando la cellula si trova in condizioni di carenza di zolfo, la concentrazione di
O-acetilserina sale nel citosol, guidando il complesso verso la dissociazione [27] ed attivando
quindi un sistema di autoregolazione a feedback.
15

Introduzione
1.2.3.2 Enzimi del sottotipo γ
Questo gruppo contiene la O-acilomoserina sulfidrilasi, la cistationina γ-sintasi, la
cistationina γ-liasi, una cistationina β-liasi e la metionina γ-liasi. Questi enzimi,
analogamente a quelli del sottotipo β, sono in grado di accettare molti substrati diversi;
inoltre possono catalizzare reazioni di eliminazione e sostituzione sul carbonio in γ, ma solo
di eliminazione sul carbonio in β.
La cistationina γ-liasi è sicuramente l'enzima su cui sono stati compiuti più studi fra tutti
quelli coinvolti nel metabolismo dello zolfo: questo perché è assente nell'uomo, ma
fondamentale per la sopravvivenza per molti dei microrganismi patogeni, ed è quindi un
potenziale bersaglio per gli antibiotici. Si conoscono quindi molte strutture tridimensionali di
membri di questo sottotipo [28][29][30][31][32][33][34][35][36][37], che, come per il
sottotipo β, sono tutte molto simili. La maggior parte degli studi riguarda quindi la
conformazione del sito attivo e la sua interazione con vari inibitori [37], mentre il problema
della specificità (cap. 1.2.3) è stato indagato in soli due studi [32][38].
Illustrazione 12: Reazioni principali catalizzate dafgli enzimi del sottogruppo γ.
In rosso è evidenziata il residuo a tre atomi di carbonio ed in blu quello a
quattro.
La CGL, partendo dalla cistationina, è in grado di tagliare la molecola tra il carbonio in γ
e l'atomo di zolfo in δ, rilasciando cisteina e acido α-ketobutirrico. La CBL invece taglia il
legame β-γ, agisce cioè sull'altra metà della molecola, e libera omocisteina ed acido piruvico.
La MGL similmente agisce sulla metionina per liberare acido α-ketobutirrico e metantiolo.
Spesso le cistationina liasi esibiscono entrambe le attività liasiche, così come la capacità di
accettare altri substrati.
La CGS catalizza la condensazione della cisteina con O-acetil oppure
O-succinilomoserina e, nelle piante, con O-fosfoomoserina. Apparentemente, mentre gli
organismi si sono evoluti per produrre uno solo dei substrati di partenza, gli enzimi hanno
mantenuto la capacità originaria di accettarli tutti, seppure con diverse efficienze.
Relativamente ai batteri, si può affermare che i gram-positivi preferiscono la forma acetilata,
mentre i gram-negativi quella succinilata [39], ma non è stato ancora effettuato nessuno
studio sistematico che consenta di predire a priori tale preferenza, ad esempio dalla sequenza
o dalla struttura.
16
NH3+
OH S
δ
γ
β
α OH
O
NH2
NH2
O
OHα
β
S
γOH
O
NH2
NH2
O
OH SH
O
NH2
SH
OH
NH2
O
OH
O
O
OH
O
O
+
+
C G L
C B L
OH SH
O
NH2
O
OH
NH2
O
R
O
+
C G S
OH S
OH
O
NH2
NH2
O
+ OH R
O

Le due O-acilomoserina sulfidrilasi catalizzano una reazione simile, con la differenza che
il nucleofilo entrante è lo ione solfuro anziché la cisteina, ottenendo come prodotto finale
omocisteina. Bisogna ricordare che anche per alcune CGS è stata dimostrata una piccola
attività di sulfidrilazione diretta. La OAHS preferisce utilizzare la forma acetilata
dell'omoserina, mentre la OSHS quella succinilata, tuttavia entrambe con minore efficienza
accettano anche l'altra forma. A differenza della CGS è possibile in questo caso risalire ad
uno dei due tipi in base alla sequenza [40]. Nonostante questo, anche per questi enzimi si
osserva lo stesso problema di attribuzione della funzione citato in precedenza (cap. 1.2.3).
Ricostruendo un albero filogenetico dei membri della famiglia gamma con attività
sintasica appare netta la distinzione in tre rami. In un ramo si trovano le CGS delle piante,
che utilizzano la O-fosfoomoserina e non hanno attività sulfidrilasica diretta, in un altro le
CGS batteriche, in un altro le OAHS batteriche, vegetali e fungine, ed in un altro ancora le
OSHS di tutti e tre i regni (Illustrazione 13).
Illustrazione 13: Albero filogenetico degli enzimi della famiglia della CGS
1.2.3.3 Meccanismo di reazione
Il meccanismo delle reazioni di β/γ eliminazione/sostituzione degli enzimi del sottotipo γ
è stato determinato [23][41] e comprende diversi passaggi comuni. Come già descritto
l'enzima inizia un ciclo catalitico con la formazione tra il cofattore ed il primo substrato
dell'aldimmina esterna. Il complesso è quindi orientato in modo tale che sia favorita
l'eliminazione del protone in α del substrato, contemporaneamente ad uno spostamento a
catena degli elettroni. L'anello piridinico si trova quindi nella forma chinonica, mentre la
base di Schiff passa nella forma ketimminica (contrapposta a quella aldimminica poiché il
doppio legame è ora fra l'azoto ed una carbonio secondario). A questo punto è possibile
eliminare direttamente un buon gruppo uscente che si trovi in γ: la base di Schiff può
nuovamente isomerizzare nella forma aldimminica con la concomitante formazione di un
nuovo doppio legame β-γ. Il prodotto dell'eliminazione è quindi la base di Schiff dell'acido
2-aminoacrilico. Quando invece si ha un buon gruppo uscente in δ è necessario compiere un
ulteriore passaggio di isomerizzazione per formare una enammina nella quale il legame
17

Introduzione
olefinico si trova in posizione Δ3 rispetto al gruppo uscente stesso. Dopo l'eliminazione si
avrà quindi un ulteriore riarrangiamento per formare la base di Schiff dell'acido
2-aminocrotonico.
Nel primo caso l'intermedio aminoacrilato può solamente essere eliminato (gli enzimi del
sub-fold γ non possono catalizzare la reazione di β-sostituzione), ed una volta libero subisce
una idrolisi spontanea ad acido piruvico ed ammoniaca. Nel secondo caso invece l'intermedio
aminocrotonato può prendere due strade: essere eliminato, e quindi idrolizzato ad acido
α-ketobutirrico ed ammoniaca, oppure subire l'attacco nucleofilo della cisteina per formare
cistationina[41]. E' stato dimostrato che anche gli enzimi della famiglia γ, al pari di quella
β, possono accettare vari nucleofili nella seconda semireazione. Per esempio in S. cerevisiae
è possibile ottenere, tramite la CGS, metionina a partire da O-succinilserina e metantiolo.
Illustrazione 14: Meccanismo di azione della cistationina γ sintasi. I: formazione dell'intermedio II: eliminazione III:
addizione
A causa di questo complesso meccanismo di reazione la cinetica della CGS segue due
andamenti diversi a seconda delle concentrazioni dei substrati [38]. Ad alte concentrazioni di
cisteina la cinetica è quella tipica di un meccanismo ordinato: infatti la cisteina si può legare
all'enzima contemporaneamente alla O-acilomoserina in modo da essere già disponibile per
la reazione di addizione dopo che si è formato l'intermedio aminocrotonato. Nel caso invece
che la concentrazione di cisteina sia bassa, si osserva una cinetica di tipo ping-pong, in cui
l'intermedio deve attendere che una molecola di cisteina si leghi all'enzima per poter
18

effettuare la seconda parte della reazione. Inoltre, in assenza di cisteina o a concentrazioni
molto basse, l'intermedio può essere direttamente eliminato dall'enzima (da cui l'attività
liasica).
Illustrazione 15: Cinetica della cistationina γ sintasi.
Sopra: cinetica ad alte concentrazioni di cisteina; sotto:
cinetica a basse concentrazioni di cisteina
1.2.3.4 Struttura e specificità
Come descritto in precedenza (1.2.2) tutte le reazioni PLP-catalizzate, ad eccezione di
quelle del fold V, procedono attraverso un meccanismo simile: la specificità nei confronti dei
diversi substrati deve quindi essere ricercata in altri fattori. Sono stati ipotizzati diversi
meccanismi generali che non si escludono a vicenda: una specificità duale del sito attivo e le
modificazioni conformazionali in seguito al legame del substrato [42]. Uno studio
comparativo fra enzimi di struttura ed attività nota appartenenti al sottotipo γ del fold I è
riuscito a chiarire in parte i determinanti della specificità [43].
Tutti gli enzimi di questa famiglia esistono sotto forma di omodimeri o di multimeri di
ordini più elevati. Ogni dimero dispone di due siti attivi, che sono collocati nell'interfaccia
fra i due monomeri e sono formati da residui di entrambe le subunità. Ogni subunità può
essere divisa in tre domini principali: (I) il dominio N-terminale, che comprende l'elica 1 ed
una ansa di circa 40 residui; (II) il dominio di legame del PLP, con al centro un ampio foglio
β formato da 7 filamenti perlopiù paralleli (a,b,c,d,e,f,g) circondato dalle eliche 2,5,6 e 7,
esposte al solvente, e 3,4 e 8, coinvolte nell'intefaccia dimerica; (III) il dominio C-terminale,
caratterizzato da un foglio β antiparallelo.
19

Introduzione
Illustrazione 16: Struttura della CGS di E. coli e numerazione delle strutture secondarie.
Le differenze fra i vari membri di questa famiglia si trovano in sei punti, di cui solo due
nel sito attivo: il primo è situato nel dominio C-terminale fra i residui 344-366 (numerazione
della CGS del lievito), il secondo nel dominio N-terminale fra i residui 38-47. Entrambe le
regioni fanno parte del sito attivo, ma la seconda viene fornita dall'altra unità del dimero.
I due membri più simili sono cistationina γ-liasi e sintasi, che mostrano due siti attivi
virtualmente identici. Il gruppo α-carbossile della cistationina è legato con un legame
idrogeno all'arginina 369, che è altamente conservato. All'altro lato della molecola, il gruppo
α-amino interagisce con il glutammato 333 ed il gruppo α-carbossile con l'arginina 108 e
l'arginina 51 dell'altra catena. Questa grande somiglianza fa pensare che esse agiscano come
sintasi o liasi a seconda della loro posizione relativa nella via metabolica. Ad esempio nel
lievito sono presenti sia la CGS che la CGL; mentre la prima mostra attività sintasica in
presenza di cisteina ed O-acetilomoserina, la seconda mostra una attività sintasica in vitro
solo con la O-succinilomoserina. Questa molecola non è sintetizzata dal lievito e pertanto in
vivo i due enzimi non interferiscono fra loro.
La differenza fra la CGL e la CBL si origina non tanto in un diverso meccanismo d'azione,
ma dall'orientamento del substrato pseudosimmetrico nel sito attivo. Infatti i due enzimi
differeriscono per il residuo 333, che nel primo caso è costituito da un glutammato, mentre
nel secondo da una tirosina. Questa orienta lo zolfo della CTT in modo che si leghi al PLP
dal lato della catena a 3 carboni: tuttavia in questo modo è possibile solo l'eliminazione
poichè il secondo substrato non è orientato correttamente per la semireazione di addizione.
20

Illustrazione 17: Comparazione delle sequenze dei membri della sottofamiglia gamma con strutture cristsallografiche note. Dall'alto al
basso: CGS di E. coli, CGS di N. tabacum, CGL di S. cerevisiae, MGL di P. putida, MGL di C. freundii, CBL di E. coli e CBL di A.
taliana. Il folding è uguale per utte le proteine con l'eccezione di CBL di E. coli, le cui differenze sono indicate sull'ultima linea in basso.
1.3 Metabolismo e regolazione nei batteri lattici
Ad oggi esiste un solo studio che analizzi globalmente il metabolismo degli aminoacidi
solforati nei LAB [44]; si tratta tuttavia di uno studio di genomica comparativa in cui manca
una parte di verifica in laboratorio. Attualmente sono pochi i geni che sono stati purificati o
clonati e espressi, e quindi caratterizzati chimicamente; e quasi tutti questi appartengono al
tipo γ del fold II; inoltre raramente è stata verificata una eventuale attività sintasica.
21

Introduzione
Nome del gene Microrganismo Tipo Funzione proposta
Attività
β-liasica
Attività
γ-liasica
Attività γ-sintasica Riferimento
metC Lb. casei tipo γ CTT γ-sintasi si debole si
[52]
malY Lb. casei tipo AAT CTT β-liasi si - -
ctlI e ctlII Lb. casei CTT β-γ-liasi si si - [51]
cbl Lb. elveticus ? CTT β-liasi si debole su MET - [50]
patC Lb. delbrueckii spp. bulgaricus tipo AAT CTT β-liasi si - - [49]
ytjE L. lactis tipo AAT CTT β-liasi si debole su MET - [48]
metC L. lactis tipo γ CTT β-liasi si, non verificata specificità - [47]
lcd S. constellatus CTT β-liasi si - -
[46]lcd S. gordonii CTT β-liasi si - -
lcd S. anginosus CTT β-liasi si - -
cgs S. anginosus tipo γ CTT γ-sintasi no no si, produce HCY e CTT [45]
Tabella 4: Geni coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi solforati nei LAB espressi o purificati e caratterizzati chimicamente. Il trattino
significa che quella determinata attività non è stata verificata sperimentalmente.
Illustrazione 18: albero filogenetico degli enzimi di fold I nei LAB.
Gli enzimi identificati con il cerchio rosso sono stati caratterizzati
sperimentalmente. Le funzioni sono indicate a caratteri maiuscoli -
AHSH significa O-acetilomoserina sulfidrilasi Dopo ogni
abbreviazione è riportato il codice GI della NCBI. Da M. Liu et al.
2008
Illustrazione 19: albero filogenetico degli enzimi di fold II nei LAB.
Lo schema segue le stesse convenzioni di quello precedente. Gli
enzimi di tipo CysK probabilmente sono O-acetilserina sulfidrilasi.
Da M. Liu et al. 2008, modificato.
Sulla base delle sequenze aminoacidiche è possibile raggruppare gli enzimi
PLP-dipendenti coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi solforati in diversi gruppi con
attività specifiche, per ognuno dei quali è stato caratterizzato chimicamente almeno un
rappresentante. Il fold II è diviso nettamente in due gruppi con due funzioni ben distinte:
cistationina β-sintasi e O-acetilserina sulfidrilasi. Il fold I invece presenta una divisione più
complicata: a fianco di un gruppo composto da OSHS (definite nello schema AHSH), gli altri
due gruppi presentano una ambivalenza funzionale: infatti esistono CGS con una attività
secondaria di OSHS, ed infine CGL con una attività di CBL. Inoltre sembra che talvolta
l'attività in vivo non corrisponda totalmente a quella in vitro [53]; questo può essere
22

Metabolismo e regolazione nei batteri lattici
giustificato ipotizzando che i test non abbiano un'adeguata sensibilità, oppure che non
riproducano correttamente le condizioni intracellulari, come il pH o la presenza di altre
proteine che possono formare complessi funzionali.
In Lactococcus lactis e Streptococcus thermophilus sono presenti tutti gli enzimi necessari
per la via biosintetica diretta ed inversa, nonchè le proteine necessarie per l'assorbimento
degli aminoacidi ma sono apparentemente assenti trasportatori per lo zolfo inorganico (cfr.
Tabella 3 e 5). Tra tutti i LAB sicuramente i Lactococci, assieme agli Streptococci, hanno il
più ampio corredo di enzimi deputati al metabolismo degli aminoacidi solforati, essendo
assente unicamente la metionina γ-liasi. In bibliografia sono riportati dati contrastanti
riguardo alle esigenze nutrizionali di zolfo di Lactococci e Streptococci nei terreni di coltura
[54][55][56][57]; il che è giustificato dalla grande variabilità ceppo-specifica [44]. In
generale si può affermare che, dal momento che il latte è praticamente privo di aminoacidi
solforati liberi, e ne è comunque povero anche considerando la frazione proteica (cisteina
0,89 % e metionina 2,4%), per i ceppi di Lactococci e Streptococci utilizzati nella
fermentazione del latte è fondamentale poter sintetizzare de novo questi composti: dato
l'elevato costo energetico della loro sintesi è quindi giustificabile un rallentamento della
crescita.
1.3.1 Lactococcus lactis
Dal momento che L. lactis è un organismo dal genoma stabile ed è forse il più importante
dei LAB in ambito industriale, fino ad essere spesso utilizzato come organismo modello, il
primo studio sistematico relativo alla regolazione ed alla funzione del metabolismo degli
aminoacidi solforati è stato svolto su questo organismo [58]. Dall'analisi del genoma, il
batterio sembra possedere un corredo ricco di enzimi relativi al metabolismo dello zolfo e
degli aminoacidi solforati, mancando solo la MGL e gli enzimi relativi all'assimilazione del
solfato inorganico. Esistono cinque operoni prinicipali che raggruppano la maggior parte dei
geni relativi al metabolismo degli aminoacidi solforati: metB2-cysK, metA-metB1-ytjE,
yjgC-yjgD-yjgE, cysE-cysS e plpA-plpB-plpC-plpD-ydcB-ydcD. Per la maggior parte di
questi geni è stato possibile attribuire una funzione basandosi sulla similitudine delle
sequenze, ma solo metB2 è stato espresso e parzialmente caratterizzato.
23

Introduzione
Lactococcus lactis Streptococcus thermophilus Tipo di enzima/
funzione propostalactis IL1403 cremoris MG1363 cremoris SK11 LMG18311 CNRZ1066 LMD-9
yjgC COG-HisJ COG-HisJ COG-HisJ COG-HisJ COG-HisJ ABC subst. bind.
yjgD COG-HisM COG-HisM COG-HisM COG-HisM COG-HisM ABC transport. perm.
yjgE COG-GlnQ COG-GlnQ COG-GlnQ COG-GlnQ COG-GlnQ ABC ATP binding
cysE cysE COG-cysE cysE1 cysE1 COG-cysE serina acetiltransferasi
- - - cysE2 cysE2 COG-cysE serina acetiltransferasi
cysK cysK cysK cysM2 cysM2 COG-cysK PLP fold II
cysM COG-cysK COG-cysK cysM1 cysM1 COG-cysK PLP fold II
cysS cysS COG-cysS cysS cysS COG-cysS cisteinil-tRNA sint.
plpA,B,C,D plpA,B,C,D 3X COG-N1pa 2X COG-N1pa 2X COG-N1pa 2X COG-N1pa membrane lipoprotein
ydcB COG-AbcC COG-AbcC COG-AbcC COG-AbcC COG-AbcC ABC ATP binding
ydcD COG-abcD COG-abcD COG-abcD COG-abcD COG-abcD ABC transport. perm.
cysD cysD COG-MET17 cysD cysD COG-MET17 OAHSS
metA metA - metA metA COG-metA PLP fold II CBS-like
metB1 metB1 - metB1 metB1 COG-metC CGS/CGL
metB2 COG-metC metC metB2 metB2 COG-metC CGS/CGL
ytjE patB - COG-malY COG-malY COG-malY PLP fold I subfold ATI
metE metE COG-metE metE metE COG-metE MET sintasi B12 indip.
metF metF COG-metF metF metF COG-metF MTHF reduttasi
yhcE metE2 COG-metE COG-metE (trunc.) COG-metE (trunc.) -- MET sintasi B12 indip.
metS metS COG-metG metS metS COG-metG metionil-tRNA sint.
Tabella 5: comparazione dei nomi dei due enzimi in Streptococcus e Lactococcus
Ad oggi sono stati caratterizzati due fattori regolatori: una sequenza di tipo MET-box per
il solo gene metE, ed una sequenza in grado di legarsi al regolatore trascrizionale CmbR
(FhuR in L. lactis IL1403) a monte di tutti gli altri operoni del metabolismo degli AA
solforati. CmbR richiede OAS (o il suo prodotto di degradazione spontanea N-acetilserina)
come coattivatore e sembra essere coinvolto nella regolazione contemporanea di molti geni;
inoltre è sempre espresso a livelli elevati ed è tra i soli sette regolatori che è stato possibile
individuare tramite elettroforesi bidimensionale [59]. Allo stato attuale della conoscenza i
geni coinvolti nel metabolismo dello zolfo possono essere divisi in due gruppi: uno espresso
differenzialmente in risposta alla carenza di cisteina senza il coinvolgimento di CmbR, ed un
altro, dipendente da CmbR, espresso unicamente in condizioni di carenza di cisteina.
Il primo gruppo potrebbe essere attivato da segnali relativi alle funzioni cellulari
perturbate dalla carenza di cisteina o dalla sua sintesi. Fra questi geni yrjBCD, nifJ e cadA
(che sono ipoteticamente una ossidoreduttasi ferro-dipendente, una piruvato-flavodossina
ossidoreduttasi ed una ATPasi a pompa ionica) hanno una espressione ridotta in assenza di
cisteina. Invece i geni yqeI, yjiB, yrfD, pi e ps (rispettivamente una proteina di trasporto di
cationi, una aminoacido-idrolasi, un antiporter e due geni profagici) hanno una espressione
aumentata nella stessa condizione. Il secondo gruppo, come descritto sopra, comprende
invece quasi tutti i geni correlati al metabolismo degli aminoacidi solforati.
Per meglio definire il ruolo di CmbR sono stati caratterizzati alcuni geni del suo regolone.
L'inattivazione di metB2 e cysK rende Lactococcus incapace di crescere con la metionina
come sola fonte di zolfo, indicando un ruolo dell'operone nel conversione da metionina a
cisteina. Inoltre l'addizione di solfuro inorganico ripristina la capacità di crescita, indicando
24

che quest'ultimo può essere utilizzato come per la sintesi de novo di cisteina. Infine
l'inattivazione di yhcE non impedisce la crescita su un terreno privo di cisteina, a condizione
che non sia presente solfuro libero: una concentrazione 0,5 mM rallenta la crescita ed una
2mM la inibisce completamente.
E' stato quindi proposto per il metabolismo degli aminoacidi solforati in L. lactis
l'organizzazione descritta nella Illustrazione 20, che apporta alcune modifiche alla funzione
ipotizzata per i geni nei progetti di sequenziamento. La cisteina e la metionina possono
entrare all'interno della cellula tramite i sistemi di tipo ABC codificati dai geni
yjgCDE-ydcBCD e plp ABCD. La presenza di quattro diverse subunità di legame per gli
aminoacidi è rara e lascia supporre una diversa specificità per importare diversi derivati della
metionina o altri composti solforati potenzialmente presenti nella nicchia ecologica originale,
che è probabilmente vegetale. Gli enzimi chiave per l'assimilazione del solfuro sono cysM e
cys D, potenzialmente una OASS ed una OAHS. La OAS, il substrato di cysM, è prodotta da
cysE; mentre la OAHS è prodotta da metA. L'operone metB1-ytjE, che codifica per la CBS e
la CBL è coinvolto nella conversione di metionina e cisteina; mentre l'operone metB2-cysK
opera in direzione contraria e codifica per la CGS e la CGL. Sebbene i geni codificanti per la
metionina sintasi siano due (metE e yhcE), solo il primo svolge realmente questa funzione,
mentre il secondo sembra funzionare in direzione opposta. Questa tesi è supportata dal fatto
che mentre metE è espresso maggiormente quando la cisteina è abbondante, yhcE ha un
comportamento opposto, ed è inoltre inibito dal solfuro inorganico. Sembra quindi essere una
via per far entrare rapidamente la metionina nelle reazioni di conversione a cisteina, attivitata
solo quando non è possibile sintetizzare de novo quest'ultima.
Rimangono ancora alcuni punti da chiarire: innanzitutto CmbR attiva
contemporaneamente diversi geni che dirigono il flusso metabolico in due direzioni opposte,
creando apparentemente un ciclo futile, inoltre evidenze sperimentali indicano che metB2 è
una CBL [47], anzichè una CGL. Relativamente al primo punto, diventa quindi necessario
ipotizzare altre forme di regolazione. Non sono finora stati trovati altri sistemi di
regolazione, come S- , T- e MET-box, ed anche se non si può escludere la presenza di altri
regolatori non ancora identificati, è più probabile che vi sia una inibizione da feedback a
livello di uno o più enzimi. Un probabile candidato è cysE, che è inibito dalla cisteina in
molti batteri, piante ed animali. Gli aminoacidi che in E. coli formano il dominio coinvolto
nell'inibizione sono conservati in L. lactis, suggerendo un meccanismo simile. Per quanto
riguarda il secondo punto, il metodo utilizzato per caratterizzare l'enzima è discutibile, e
pertanto l'assegnazione della specificità per l'eliminazione in beta non può essere considerata
inconfutabile.
25

Introduzione
Illustrazione 20: schema proposto per il metabolismo degli aminoacidi
solforati in L. lactis (da Sperandio 2005).
1.3.2 Streptococcus thermophilus
I Lactococci e gli Streptococci, che sono geneticamente molto simili [60], condividono
anche una organizzazione dei geni coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi solforati
molto simile. Una differenza è costituita da metA che in Streptococcus non è più all'interno
dell'operone metA-metB1-ytjE, ma si trova isolato nel genoma.
Una differenza è costituita dal differnete meccanismo di regolazione del metabolismo
della metionina. Infatti negli streptococci non è presente nessuno dei meccanismi utilizzati
nei Bacilli, Clostridi o Lactobacilli, ovvero S-box e T-box regolati rispettivamente da SAM e
cisteinil-tRNA. Il sistema di regolazione appare basato su MET-box [61] e apparentemente
non vi è coinvolgimento di un sistema simile a CmbR di Lactococcus.
Un'altra importante caratteristica è unica a S. thermophilus: infatti questo organismo è
andato incontro ad un trasferimento orizzontale di geni da parte di Lactobacillus bulgaricus
[62]. Questo evento ha causato la completa sostituzione dell'operone metC-cysK con un altro
operone contenente i geni cysK-metC-cysE. In conseguenza di questo, il genoma S.
thermophilus contiene due copie di cysE (ipoteticamente una serina O-acetiltransferasi).
Illustrazione 21: comparazione di alcuni importanti operoni coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi solforati. Colori uguali denotano
geni omologhi.
26

Questo trasferimento ha riguardato anche le sequenze regolatrici: infatti a monte
dell'operone non è presente il motivo CmbR che si ritrova nei lactococci e negli altri
streptococci. Al suo posto è presente una sequenza ricca in GC, altamente simile a quella
presente a monte degli stessi geni in Lb. bulgaricus, Lb. plantarum, Oenococcus e
Leuconostoc; questa sequenza potrebbe essere una sequenza regolatrice con un ruolo ancora
sconosciuto.
Illustrazione 22: schema proposto per il metabolismo degli
aminoacidi solforati in Streptococcus. (da Sperandio 2007)
1.4 Tecniche cromatografiche per l'analisi di metaboliti
Per la caratterizzazione dell'attività degli enzimi la biochimica ha nel passato fatto
affidamento su tecniche in grado di rivelare o quantificare una sola molecola di interessa
oppure contemporaneamente tutta una famiglia di composti [63]. I saggi più popolari sono
basati sull'utilizzo di un agente chimico che dopo aver reagito con gli analiti può essere
rivelato tramite spettroscopia UV/VIS o la fluorescenza. Questi sistemi hanno il grande
vantaggio di essere semplici, robusti, standardizzati e di richiedere attrezzature semplici,
inoltre spesso consentono di monitorare l'evoluzione nel tempo di una reazione per scoprirne
la cinetica. Talvolta però la scarsa selettività, o al contrario la possibilità di rivelare un solo
analita per volta, costituiscono un problema insormontabile. Il problema non può ovviamente
essere risolto utilizzando un numero elevato di test in parallelo, poiché il tempo necessario
per creare, ottimizzare e rendere comparabili fra loro molti protocolli sarebbe troppo elevato.
Le tecniche cromatografiche abbinate alla spettrometria di massa presentano molte
caratteristiche che le rendono ideali per questo tipo di applicazioni: sono universali, ovvero
consentono la ricerca contemporanea di analiti diversi, ma al contempo sono specifici, perchè
consentono di identificare univocamente ogni analita [64]. Per le analisi trovano consolidata
applicazione due tecniche cromatografiche, ognuna delle quali ha una tecnica di
spettrometria di massa di elezione: la cromatografia liquida ad alta pressione ifenata con un
27

Introduzione
rivelatore con ionizzazione electrospray (HPLC/ESI/MS) e la gas-cromatografia ifenata con
un rivelatore a ionizzazione ad impatto elettronico (GC/MS-EI). Ognuna delle due tecniche
ha un ambito ottimale di applicazione determinato dalla natura degli analiti (Illustrazione 23)
.
Illustrazione 23: ambito ottimale di applicazione delle diverse tenciche cromatografiche
(Halket 2005)
La GC ha tre grandi vantaggi rispetto ad altre tecniche cromatografiche: i tempi di analisi
estremamente ridotti, la risoluzione più elevata ed i bassi costi si gestione. Inoltre può essere
abbinata efficacemente ad uno spettrometro di massa EI, che consente di ottenere importanti
informazioni strutturali sugli analiti. Purtroppo questa tecnica ha la severa limitazione di non
poter lavorare con analiti ad alto PM, mentre può accettare senza trattamenti preparativi solo
quelli volatili. L'analisi di molecole polari richiede spesso passaggi aggiuntivi di
purificazione e derivatizzazione lunghi e complicati, che possono annullare i vantaggi già
elencati. La LC ha un potenziale di applicazione più ampio relativamente alla polarità ad al
peso molecolare degli analiti. Questo si traduce nella possibilità di analizzare i prodotti di
una reazione enzimatica “tali e quali” senza derivatizzazioni o pre-trattamenti particolari.
Un grande svantaggio è costituito però dal costo proibitivo richiesto per l'acquisto e la
manutenzione della strumentazione.
Pertanto in molti studi in cui l'utilizzo della GC-MS è impraticabile e quello della LC-MS
comunque possibile, si è preferito ripiegare su metodi tradizionali per motivi di costo e
semplicità. In tempi recenti tuttavia sono stati effettuati molti studi rivolti ad ampliare
l'ambito operativo della GC tramite tecniche di derivatizzazione semplificate ed universali
che coniughino volatilità e stabilità egli analiti.
1.4.1 Analisi degli aminoacidi
Per superare le limitazioni della GC, ed al contempo sfruttarne i vantaggi di rapidità e
risoluzione, nel corso degli anni sono stati sviluppati molti metodi che consentono di
trasformare analiti polari in composti meno polari e volatili [65]. In particolare è necessario
rimuovere gli idrogeni dai gruppi funzionali più polari (alcoli, ammine, tioli, acidi
carbossilici, etc..), poiché questi riducono la volatilità ed in generale limitano le performance
cromatografiche. Questa procedura è chiamata derivatizzazione, poiché converte l'analita
28

Tecniche cromatografiche per l'analisi di metaboliti
originale in un derivato che condivide lo stesso scheletro di base. Gli approci più comuni
sono tre, ovvero la sililazione, l'alchilazione e l'acilazione; che trasformano i gruppi polari
rispettivamente in silil-eteri, alchil-eteri ed esteri. Generalmente queste reazioni procedono
con una elevata efficienza, ma devono avvenire in solventi organici, poiché i prodotti od i
reagenti stessi sono sensibili all'idrolisi. Pertanto quando si parte da una matrice acquosa,
come è spesso il caso quando si lavora in campo biologico, si rende necessario operare alcuni
passaggi estrattivi. L'analisi degli aminoacidi è uno dei settori dove, a causa della enorme
importanza di questa famiglia di composti, si sono rivolti i maggiori sforzi. La loro analisi
cromatografica è particolarmente complicata, dal momento che tutti hanno un peso
molecolare simile, presentano due o più gruppi funzionali con proprietà chimiche diverse e
devono spesso essere ricercati in matrici biologiche complesse[66].
Una procedura classica per l'analisi degli aminoacidi, ad esempio, comprende almeno tre
diversi passaggi. Prima gli aminoacidi sono concentrati dalla fase acquosa tramite una
colonna a scambio ionico, quindi sono eluiti ed esterificati con isopropanolo ed acido
cloridrico, infine vengono acilati con anidride trifluoroacetica. Questo protocollo richiede
circa 90 minuti, mentre la corsa cromatografica in sé dura solo dieci minuti circa.
1.4.2 Utilizzo degli alchil-cloroformati in gascromatografia
Una innovazione relativamente recente [67] è costituita dall'utilizzo degli alchil-esteri
dell'acido cloroformico (alchil-cloroformati), di cui è nota da tempo nella chimica organica la
reattività, ma per i quali è stata per la prima volta descritta solo nel 1991 l'applicazione alla
microscala analitica [68]. Questa tecnica, sviluppata inizialmente per l'analisi degli
aminoacidi nei liquidi biologici [69][70][71][72], ha poi trovato applicazioni nella
metabolomica [73], nella biologia [74][75][76], nella conservazione delle opere d'arte
[77][78][79], nella ricerca di inquinanti nell'acqua [80][81], nell'analisi degli alimenti
[82][83][84][85] ed addirittura nell'analisi di campioni di terreno in missioni interplanetarie
[86][87].
Illustrazione 24: I: Acido cloroformico, II: metil
cloroformato, III: mentil cloroformato, IV: esil
cloroformato, V: octafluoroesil cloroformato
La grande versatilità dei cloroformati deriva dalla capacità di reagire con molti gruppi
funzionali contemporaneamente, con alte rese addirittura in ambiente acquoso. Caratteristica
altrettanto importante è il costo ridotto, dalla metà ad un quarto rispetto ai reagenti per la
silanizzazione. Gli alchil-cloroformati sono stati utilizzati per analizzare una ampia gamma
di composti organici [88]: aminoacidi, acidi grassi, acidi organici, steroli e derivati, composti
29
OCl
O
OCl
O
OCl
O
F
F
F
F
F
F
F
F
OCl
O
OHCl
O I I I I I I
I V V

Introduzione
idrossiaminici, composti di organoselenio, bifenili policlorurati idrossilati ed addirittura
piccoli peptidi. Per coprire un così ampio spettro di applicazioni sono stati sviluppati nuovi
reagenti, con catene alchiliche da 1 a 6 atomi di carbonio, eventualmente fluorurati, oppure
con gruppi otticamente attivi per l'analisi chirale. Attualmente si può affermare che nelle
condizioni classiche di reazione [68] essi consentono di analizzare contemporaneamente
molti composti organici con buone performance, e che con l'utilizzo di condizioni e reagenti
particolari è possibile abbassare i limiti di rivelazione, migliorare la selettività o analizzare
classi particolari di analiti [88].
Tutte le caratteristiche sopraelencate rendono i cloroformati ideali per l'analisi in GC:
infatti possono reagire direttamente in una matrice acquosa, in un solo passaggio e senza
causare degradazioni dovute all'ossidazione o all'alta temperatura. Dal momento che si
utilizzano reagenti e condizioni non aggressive la tecnica è particolarmente adatta per gli
aminoacidi solforati ed i loro derivati seleniati, che a causa della loro reattività pongono
sempre difficoltà nelle analisi.
Illustrazione 25: Cromatogramma GC-FID di aminoacidi, ketoacidi ed acidi grassi nel plasma
umano.( da Hušek, 1995)
1.4.2.1 Meccanismo di reazione
Gli alchil-cloroformati reagiscono facilmente in solvente organico con alcol, ammine
primarie e secondarie, tioli e fenoli per formare un O-, N- o S-alcossicarbonil estere, ovvero
un estere misto dell'acido carbonico. In questo caso il cloroformato si comporta come un
normale alogenuro acilico: il primo passo è l'attacco nucleofilo dell'eteroatomo sul carbonile
per formare un intermedio tetraedrico, quindi questo intermedio elimina spontaneamente
acido cloridrico, formando l'estere misto finale. Generalmente si utilizza una ammina
terziaria o aromatica, come la trietilammina o la piridina, per tamponare l'acido e migliorare
la resa della reazione.
30

Tecniche cromatografiche per l'analisi di metaboliti
Illustrazione 26: meccanismo di reazione dei cloroformati con alcol, amine, tioli,
fenoli. X= O, N, S
Anche un acido carbossilico può reagire come nucleofilo con un cloroformato, con un
mecanismo sostanzialmente simile a quello descritto in precedenza. In questo caso il
prodotto finale è una anidride mista, abbastanza stabile da poter essere isolata [89]. Queste
anidridi sono un ottimo agente esterificante e sono utilizzate, ad esempio, per la sintesi di
peptidi in alternativa alle carbodiimidi [90]. Se nella miscela di reazione è presente anche un
buon nucleofilo (generalmente un alcol) è possibile condurre l'esterificazione in un solo
passaggio. Infatti in presenza di una ammina terziaria, alifatica od aromatica, le anidridi
formano reversibilmente una N-acil-ammina[91] che, benchè presente in piccole quantità
reagisce rapidamente con altri nucleofili per formare un estere ed un sale di piridinio.
Illustrazione 27: meccanismo di reazione dei cloroformati con gli acidi carbossilici in presenza di piridina come catalizzatore.
Benchè queste reazioni idealmente debbano essere condotte in un solvente organico,
possono essere condotte anche in ambiente acquoso: evidentemente oltre alla reazione di
esterificazione avrà luogo anche una indesiderata idrolisi del cloroformato e delle anidridi.
Se queste reazioni secondarie non sono tollerabili quando si lavora sulla macroscala
preparativa, nella microscala analitica ottimizzando le condizioni è possibile minimizzarne
gli effetti. In particolare è necessario utilizzare un catalizzatore tale da minimizzare le
reazioni laterali ed ottimizzare le quantità di alcol, catalizzatore e reagente da utilizzare al
fine di ottimizzare la resa. Inoltre è importante utilizzare alcol e cloroformato che abbiano
una uguale catena alchilica, di modo che l'alcol liberato dall'idrolisi del reagente non porti
alla formazione di un secondo prodotto di esterificazione diverso da quello principale.
31

Introduzione
Le cosiddette condizioni classiche di reazione in fase acquosa [68] prevedono che tra
matrice acquosa, alcol, catalizzatore e reagente si mantenga il rapporto di 12:8:2:1. Tuttavia
per altri alcol e cloroformati queste proporzioni non garantiscono la migliore resa. Per
esempio quando si usano cloroformati con una catena alchilica lunga l'addizione di alcol è
addirittura detrimentale[88]. In ogni caso i prodotti finali della reazione sono sempre un N-,
O-, S-alcossicarbonil-estere dell'analita ed un doppio estere simmetrico dell'acido carbonico.
32

Scopo della tesi
2 Scopo della tesi
33

Scopo della tesi
Questo lavoro di tesi ha esplorato le proprietà rilevanti dell'enzima PLP-dipendente
cistationina liasi codificato dal gene metC di Lactococcus lactis, un batterio lattico
importante per molte fermentazioni industriali. Questo enzima è coinvolto nel metabolismo
degli aminoacidi solforati durante il ciclo vitale della cellula, ed inoltre è implicato nella
formazione di aromi negli alimenti lattiero-caseari.
In particolare, è stata investigata la correlazione sequenza-struttura-funzione, l'equilibrio
di legame al PLP e la selettività nella catalisi al fine di stabilire se l'enzima possiede attività
β- o γ-liasica. Per raggiungere questo scopo sono state utilizzate tecniche di bioinformatica,
spettroscopia UV/VIS, fluorimetria, dicroismo circolare e gascromatografia ifenata alla
spettrometria di massa.
34

Materiali e metodi
3 Materiali e metodi
35

Materiali e metodi
3.1 Preparazione dei materiali
3.1.1 Materiali utilizzati
Salvo diversamente indicato, tutti i materiali sono della massima purezza
commercialmente disponibile e sono stati utilizzati senza ulteriori trattamenti.
• L-Cisteina, L-omocisteina, DL-metionina, L-cistationina e L-cistina 95% - Sigma
Aldrich
• Etil-cloroformato 98% - Sigma aldrich
• Piridina 98%+ - Sigma Aldrich
• Etanolo 96% - Carlo Erba
• Acido 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzoico) 95% - Sigma aldrich
• Piridossal fosfato 95% - Fluka
• Diclorometano grado Normapur, stabilizzato con 0,1% di etanolo - Prolabo
3.1.2 Preparazione del terreno LB
Per preparare 1 l di terreno si mescolano in un becker 10 g di triptone, 5 g di estratto di
lievito e 10 g di NaCl con tantsa acqua distillata quanto basta per portare al volume finale;
dopo aver ottenuto la totale dissoluzione si trasferisce in bottiglie di vetro, aggiungendo a
questo punto 15 g di agar se desiderato. Si sterilizza quindi in autoclave a 121° C per 15'.
Gli antibiotici, quando richiesti, sono stati aggiunti al terreno autoclavato immediatamente
prima dell'utilizzo. L'ampicillina è stata utilizzata alla concentrazione finale di 100 μg/ml e la
tetraciclina a 10 μg/ml.
3.1.3 Preparazione del terreno SOC
Sotto cappa batteriologica si mescolano in una provetta tipo Falcon alla quantità
desiderata di terreno LB liquido una soluzione di MgCl2 da diluire 200:1 ed un'altra di
glucosio da diluire 50:1. Il terreno deve essere preparato immediatamente prima dell'utilizzo
e conservato sotto ghiaccio per evitare il deterioramento microbiologico.
36

Preparazione dei materiali
3.1.4 Preparazione dei tamponi
Su una bilancia si pesa la quantità di tampone determinata dalla formula 1. Quindi dentro
un becker si mescola la polvere con circa il 70% dell'acqua necessaria per raggiungere il
volume finale. Dopo la completa dissoluzione dei solidi, si porta al pH desiderato mediante
l'aggiunta goccia a goccia di NaOH 20 M o HCl 12 M, mantenendo in costante agitazione e
misurando con un pHmetro.
Formula 1: pesata dei tamponi.
Quando opportuno, i tamponi sono stati preparati in stock a concentrazione 1 M e
conservati a 4° C per limitare la contaminazione batterica, per poi essere diluiti solamente al
momento dell'utilizzo.
3.1.5 Preparazione del buffer di lisi
Il buffer di lisi è costituito come descritto nella tabella sottostante diluendo i componenti
principali a partire da soluzioni stock concentrate. Per sapere quanto reagente mescolare per
ottenere una determinata concentrazione finale si usa la seguente formula:
Formula 2: calcolo della diluizione da soluzione stock.
Le soluzioni finali devono contenere i seguenti reagenti: KPi 50 mM, NaCl 0,3 M,
β-mercapto-etanolo 1 mM, glicerolo 10%, leupeptina 1 μM, pepstatina 1 μM, PMSF 100 μM.
Si porta quindi il pH a 8 come descritto nel paragrafo 3.1.4.
3.1.6 Preparazione dello standard di PLP e DTNB
Su una bilancia di precisione a 5 cifre decimali si pesano all'incirca 1-2 mg di polvere
dentro una vial di vetro da 4 ml, quindi si diluisce fino a raggiungere la concentrazione
10mM con con KPi 10mM a pH 8, calcolato con la formula 3:
Formula 3: calcolo della diluizione per gli standard 10
mM.
Dopo aver vortexato per alcuni minuti, si preparano diverse aliquote individuali di circa
200 μl ciascuna dentro provette Eppendorf. Queste poi sono avvolte nella carta stagnola,
conservate a -20°C per prevenire la fotoossidazione, quindi scongelate quando necessario e
conservate in ghiaccio per il tempo dell'utilizzo.
37
Pesotampone =
V finale∗M finale
PMtampone
V prelevatoreagente =
V finaletampone∗C finalereagente
C stockreagente
V diluenteml =
Pesata standardmg
PM standardDa∗10−2

Materiali e metodi
3.1.7 Preparazione delle soluzioni standard di aminoacidi
Su una bilancia di precisione a 5 cifre decimali si pesano all'incirca 1-2 mg di analita
dentro una vial di vetro da 4 ml, quindi si diluisce fino a raggiungere la concentrazione
10mM con HCl diluito, calcolato secondo la formula 3.
Per gli standard di metionina, cisteina ed omocisteina si è utilizzato HCl 30 mM, mentre
per la cistationina e la cistina si è utilizzato HCl 0,5 M. Inoltre è stata preparata una seconda
serie di standard di cisteina, omocisteina e cistationina a concentrazione 0,1 mM diluendo 10
ml del primo standard in 990 ml di HCl diluito alla stessa concentrazione. Nel testo si
intenderà come soluzione A la serie a concentrazione 10mM e come soluzione B la serie
0,1mM.
Le soluzioni standard di cistationina, cistina e metionina possono essere preparate ogni
mese, quindi aliquotate e congelate a -20°C, scongelate quando necessario e conservate in
ghiaccio durante il loro utilizzo. Le soluzioni di cisteina ed omocisteina devono invece essere
preparate fresche ogni volta il giorno stesso del loro utilizzo e quindi conservate facendo
gorgogliare al loro interno tramite un capillare un lento flusso di azoto.
3.2 Analisi bioinformatica
Allo scopo di cercare omologhi della CGL di L. lactis in altri batteri lattici, si è sottoposta
una query al server NCBI Blast [92] con l'algoritmo blastp. Partendo dalla sequenza
aminoacidica e ricercando un'altra sequenza aminoacidica, il risultato con il più alto
punteggio è stata la proteina metB2 di S. thermophilus.
3.2.1 Analisi della sequenza e del contesto
La sequenza di metC e metB1 da L. lactis e metB1 e metB2 da S. thermophilus sono state
confrontate con quella di altri enzimi PLP-dipendenti del fold II a funzione nota, ovvero la
CGS di E. coli e N. tabacum, la CGL di S. cerevisiae, la MGL di Pseudomonas putida e C.
freundii e la CBL di E. coli e A. taliana. Mediante il software Jalview [93] si è provveduto
all'allineamento mediante l'algoritmo Muscle [94] ed alla annotazione delle sequenze stesse.
Inoltre mediante il server Microbes Online [95] si è provveduto a confrontare il contesto
di tutti i geni di L. lactis e S. thermophilus elencati nella tabella 5 con quello degli omologhi
in altri batteri lattici.
3.3 Preparazione dell'enzima ricombinante
Per la produzione dell'enzima ricombinante si è seguito il protocollo messo a punto in un
precedente lavoro di tesi [96]. In breve, il gene metC di Lactococcus lactis MG1363 è stato
acquistato dalla NIZO food research (Ede, Olanda) e clonato su un plasmidio pET11B in
cellule di E. coli competenti XL1B.
38

Preparazione dell'enzima ricombinante
3.3.1 Rivitalizzazione delle colonie
Si prelevano dallo stab conservato a -80° C le cellule di E. coli XL1B già trasformate con
il plasmidio pET11B contenente il gene metC e si strisciano su piastra LB agar con
tetraciclina e ampicillina. Dopo aver lasciato overnight a 37° C si prelevano dalla piastra 10
colonie e si inoculano su una piastra master su LB agar con gli antibiotici. Anche la piastra
master viene lasciata in incubatrice a 37° C per la notte, inoltre si inocula direttamente la
colonia 1 in 1 ml di terreno LB e incubo in agitatore a 37°C overnight.
3.3.2 Estrazione del DNA
Si estrae il DNA plasmidico con il mini kit Perfect-prep della Eppendorf seguendo il
protocollo indicato dal produttore. Si ottengono circa 70 μl di soluzione acquosa, in cui si
quantifica la concentrazione di DNA mediante spettrofotometria UV. Si misura l'assorbanza a
260 e 300 nm del campione incognito quindi si ottiene la concentrazione mediante la formula
4:
Formula 4: formula empirica per il calcolo della
concentrazione di DNA.
La soluzione di DNA così ottenuta può essere conservata senza deterioramento a -20° C e
scongelata al momento dell'utilizzo.
3.3.3 Trasformazione delle cellule BL21
Si scongela il DNA estratto con il mini-prep, se ne preleva 1 μl e si trasferisce dentro una
provetta Eppendorf contenente E. coli BL21 competenti già aliquotate. Si prelevano 40 μl del
liquido, si pongono tra le lamine di una cuvetta per elettroporazione e si applica la scarica.
Immediatamente dopo si aggiunge nella cuvetta 1 ml di terreno SOC, si mescola e si
trasferisce in una Falcon da 15 ml. Questa viene incubata per 1h a 37° C in agitazione,
dopodichè se ne piastrano 300 μl su una piastra LB agar con ampicillina che si pone in
incubazione a 37° C per una notte.
3.3.4 Espressione della proteina ricombinante
Si preleva una colonia dalla piastra preparata con le cellule trasformate e la si inocula in
una quattro Falcon contenenti 15 ml di LB liquido con ampicillina a 37° C per la notte.
Quindi si pongono 25 ml di precoltura in una beuta con 1 l di terreno LB liquido con
ampicillina, e si incuba a 37° C sotto agitazione. Ad intervalli di 30' si verifica la crescita
batterica misurando l'OD600 fino a quando non raggiunge 0,8. A questo punto in ciascuna
beuta si aggiungono 10 ml dell'induttore IPTG 0,1 M, quindi si pone in incubazione a 30° C
sotto agitazione per 2h30'.
39
[ DNAg/ml]=50∗OD260−OD300 

Materiali e metodi
3.3.5 Purificazione della proteina
Si centrifuga l'intero volume della coltura a 8000 giri per 10', quindi si scarta il surnatante
e si risospende tutto il pellet dentro 60 ml di buffer di lisi. Si sonica in un becker sotto
ghiaccio per 10 cicli di 15'' separati da 1' di intervallo e quindi si centrifuga il lisato a 7500
giri per 15', scartando il pellet. Si concentra su membrana AMICON con cutoff 10.000 Da
sotto flusso di azoto fino a raggiungere un volume finale di circa 3 ml.
Si carica quindi il concentrato su una colonna per cromatografia ad esclusione
dimensionale con fase stazionaria Sephacryl S-200, eluendo un flusso di 0,12 ml/min con una
fase mobile composta da KPi 100 mM pH 7,6 e NaCl 0,3 M. Si raccolgono le frazioni in
uscita dalla colonna e si monitora l'assorbanza a 260, 280 e 420 nm per individuare
l'eluizione rispettivamente degli acidi nucleici, delle proteine e delle proteine legate a PLP.
Si recuperano quindi le frazioni contenenti la CGL e si dializzano e riconcentrano su
membrana AMICON, aggiungendo per tre volte tampone TRIS 25 mM a pH 7,5 in modo da
eliminare ogni traccia di sale. Si carica quindi il campione su una colonna a scambio
anionico con fase stazionaria Q-sefarosio. L'eluizione avviene alla velocità di 8 ml/ora con il
seguente gradiente della fase mobile: da 0 a 36 ml buffer TRIS 25 mM pH 7,5, da 37 a 64 ml
buffer TRIS più gradiente di NaCl da 0 a 0,5 M, da 65 ml in poi buffer TRIS e NaCl 0,5 M.
Si raccolgono le frazioni in uscita dalla colonna e si misura come prima l'assorbanza per
individuare la proteina purificata.
Dopo verifica dell'attività mediante il test descritto nel paragrafo 3.5, le frazioni sono state
conservate a -20° C fino al momento del loro utilizzo.
3.4 Preparazione dell'apoenzima
L'apoenzima è stato preparato derivatizzando il gruppo aldeidico del PLP, in modo da
rendere impossibile la formazione dell'aldimmina interna e favorire il distacco del cofattore
dalla proteina. Si è valutato l'uso di due reagenti già indicati in letteratura, la cisteina
[97][98] e l'idrossilammina [99]. La prima reagisce formando una tiazolidina, in una reazione
all'equilibrio [100]; la seconda invece produce un ossima. Sono stati confrontati diversi
protocolli per ottimizzare il metodo.
Illustrazione 28: derivatizzazione del PLP con cisteina ed
idrossilammina
40
N
O
O
-
OP
O
O
-
O
-
OH SH
O
NH2
N
O
-
OP
O
O
-
O
-
S NH
OH
O
+
NH2 OH
N
N
O
-
OP
O
O
-
O
-
OH
+

Preparazione dell'apoenzima
3.4.1 Verifica spettrofotometrica della formazione di derivati del PLP
Per misurare la formazione di tiazolidina, si preparano 100 μl di una soluzione 1 mM di
PLP in buffer, quindi con uno spettrofotometro se ne misura l'assorbanza nel range da 500 a
300 nm in una cuvetta di quarzo con percorso ottico di 10mm. Si aggiungono 10 μl di
cisteina 0,5M diluita nello stesso tampone e se ne misura nuovamente lo spettro dopo 15
minuti. Si preparano quindi 100 μl di buffer BIS-TRIS 10mM a pH 6 aggiungendo 200 μg di
proteina purificata, e se ne misura lo spettro prima e dopo l'aggiunta di cisteina come sopra
indicato.
Per valutare la formazione dell'ossima si ripete la procedura sopra descritta, utilizzando
idrossilammonio cloruro alla stessa concentrazione al posto della cisteina.
3.4.2 Protocolli per la risoluzione del cofattore dall'enzima
Al termine di ogni protocollo l'apoenzima ottenuto è stato quantificato come descritto nel
paragrafo 3.6.1. L'attività è stata misurata con il protocollo descritto nel paragrafo 3.5 sia
sull'apoenzima tal quale, sia con l'aggiunta di PLP a concentrazione saturante; e quindi
comparata con quella della stessa quantità di proteina nativa con e senza PLP.
3.4.2.1 Preparazione a piccola scala con cisteina
In una provetta eppendorf si mescolano 64 μl di acqua distillata, 250 μl di tampone di
BIS-TRIS pH6 1M, 20 μl di soluzione acquosa di proteina 10 mg/ml e 500 μl di cisteina 500
mM disciolta nello stesso tampone. Si chiude e si lascia a 4° C per 6 ore. Si trasferisce quindi
in una membrana da dialisi con cutoff 10.000 Da e si dializza per 48 h contro 1 L dello stesso
tampone dentro un cilindro graduato mantenendo in agitazione con un magnete, cambiando
la soluzione dopo 24 h.
3.4.2.2 Preparazione a media scala con cisteina
In una provetta tipo falcon richiudibile da 15 ml si mescolano 2 ml cisteina 500mM in
tampone BIS-TRIS pH 6 e 100 μl di soluzione acquosa di proteina 10 mg/ml. Si chiude e si
lascia a 4° C per 6 ore. Si trasferisce quindi in una membrana da dialisi con cutoff 10.000 Da
e si dializza per 48 h contro 1 L dello stesso tampone dentro un cilindro graduato
mantenendo in agitazione con un magnete, cambiando la soluzione dopo 24 h.
3.4.2.3 Preparazione a grande scala con cisteina
In un cilindro graduato da 50 ml si mescolano 20 ml di cisteina 500mM in tampone
BIS-TRIS pH 6 e 1 ml di soluzione acquosa di proteina 10 mg/ml di cist. Si chiude e si lascia
a 4° C per 6 ore. Si trasferisce quindi in una membrana da dialisi con cutoff 10.000 Da e si
dializza per 48 h contro 2 L dello stesso tampone dentro un cilindro graduato mantenendo in
agitazione con un magnete, cambiando la soluzione dopo 24 h. Se necessario, si è provveduto
a concentrare e/o scambiare il tampone mediante quattro ripetuti cicli di concentrazione e
cambio di tampone su membrana Amicon con cutoff di 10.000 Da.
41

Materiali e metodi
3.4.2.4 Preparazione a media scala con idrossilammina
In una provetta tipo falcon richiudibile da 15 ml si mescolano 200 μl di tampone
BIS-TRIS pH6 1M, 100 μl di proteina 10 mg/ml, 6,2 mg di idrossilammonio cloruro e 4,6
mg di ditiotreitolo. Si chiude e si lascia a 4° C per 6 ore. i trasferisce quindi in una membrana
da dialisi con cutoff 10.000 Da e si dializza per 48 h contro 1 L dello stesso tampone dentro
un cilindro graduato mantenendo in agitazione con un magnete, cambiando la soluzione dopo
24 h.
3.5 Test di attività enzimatica mediante DTNB
Per il test si preparano 10 μl di tampone TRIS 1M a pH 8, 5 μl di CTT 10 mM, 5 μl di DTNB
10 mM, fino a 5 μl di PLP 10 mM, fino a 30 μl di soluzione contenente l'enzima ed acqua
quanto basta per arrivare a 100. Si mescolano tutti i reagenti tranne la cistationina dentro una
cuvetta in quarzo da 100 μl, quindi si attendono circa 2' per raggiungere l'equilibrio. Si
aggiunge il substrato ed immediatamente si effettua una lettura continua dell'assorbanza a
420 nm con uno spettrofotometro. Il cromoforo prodotto nella reazione è direttamente
proporzionale al quantità di tioli prodotti nella degradazione del tiolo, per cui effettuando una
regressione di tutti i punti della retta ottenuta, il coefficiente angolare è proporzionale
all'attività dell'enzima.
3.6 Quantificazione dell'enzima
3.6.1 Metodo Protparam
Si elabora presso il servizio online Protparam del server Expasy la sequenza aminoacidica
della cistationina liasi, ottenendo il valore di assorbanza a 280 nm di 0,570 UA g-1
l-1
. Si
effettua in uno spettrofotometro la lettura a 280 e 350 nm di un campione incognito di
proteina nonchè del bianco contenente solo il tampone. La concentrazione della proteina si
ricava dalla seguente formula:
Formula 5: Calcolo della concentrazione della proteina mediante il metodo dell'assorbanza a 280 nm
Questo metodo è applicabile solo sull'apoenzima, poichè il cofattore presenta un picco di
assorbimento vicino a 280 nm che introduce quindi un errore nella lettura.
42
[concentrazione proteina g /l]=
OD280incognito−OD280bianco−OD350incognitoOD350bianco
0,570

Quantificazione dell'enzima
3.6.2 Metodo Bradford non corretto
Il metodo di Bradford si basa sulla modifica delle caratteristiche spettrali del colorante
Coomassie brilliant blue in seguito al legame con i residui idrofobici di una proteina. In
seguito a questo legame il colorante sposta il suo massimo di assorbanza a 595 nm, e mostra
una assorbanza proporzionale alla quantità di analita, in modo che questa sia determinabile in
base alla legge di Lambert-Beer.
Si crea innazitutto una curva di calibrazione con uno standard a concentrazione nota, nel
nostro caso sieroalbumina bovina (BSA). In una provetta tipo Eppendorf si pongono 500 μl
di reagente ed alcuni microlitri di standard a concentrazione 1 mg/ml, partendo da 2,5 fino a
50 μg. Dopo aver agitato e lasciato reagire per 5', se ne trasferisce il contenuto dentro una
cuvetta per spettrofotometria e se ne legge l'assorbanza a 595 nm. Ogni punto viene replicato
in doppio. Effettuando una regressione fra il valore della lettura e la quantità nota di analita
si ottiene una retta che potrà essere utilizzata per la quantificazione della nostra proteina.
L'equazione della retta risulta essere:
Formula 6: Retta di taratura metodo Bradford su BSA
coefficiente angolare 0,0346
intercetta 0,1849
R2
0,9652
Tabella 6: parametri della retta di calibrazione del metodo Bradfrod su BSA
Per quantificare una proteina si aggiungono, dentro una provetta Eppendorf, alcuni
microlitri di una sua soluzione a concentrazione incognita ed 1 ml di reagente, quindi si
lascia reagire e se ne effettua la lettura a 595 nm. Per una maggiore precisione, si utilizzano
due quantità diverse ognuna replicata in doppio. Bisogna prima calcolare la quantità di
proteina in soluzione in ogni singola lettura, quindi calcolarne la media:
3.6.3 Metodo Bradford corretto
Si effettua una taratura simile a quella del metodo Bradford, utilizzando come standard
apo-CGL quantificata con il metodo Protparam al posto della BSA . In una provetta tipo
Eppendorf si mescolano 500 μl di reagente con alcuni microlitri di standard, quindi si lascia
reagire per 5' ed infine se ne legge l'assorbanza a 595 nm. Si è utilizzata apo-CGL prodotta
con il protocollo descritto nel paragrafo 3.4.2.2 a concentrazione 6,456 mg/ml, analizzando
un range di concentrazioni finali da 1,614 a 25,824 mg/ml. Dalla regressione effettuata sui
dati si ottiene una retta con equazione uguale alla formula 6 ed i parametri indicati nella
tabella 7.
coefficiente angolare 0,0386
intercetta 0,0686
R2
0,9608
Tabella 7: parametri della retta di calibrazione del metodo Bradford su apo-CGL
43
OD595= gproteina soluzione⋅ab

Materiali e metodi
3.7 Analisi dell'interazione PLP-enzima
Per valutare il legame fra PLP e proteina si sono valutati tre protocolli basati
rispettivamente sulla spettrofotometria UV, sulla fluorescenza e sul dicroismo circolare.
3.7.1 Spettrofotometria UV-visibile
Il PLP legato alle proteine presenta un forte assorbimento avente il massimo a 420 nm. Per
valutare se l'assorbimento a 420 nm sia un buon indicatore del grado di saturazione
dell'enzima, si è misurata la variazione di densità ottica a questa lunghezza d'onda a diverse
concentrazioni di PLP.
Si pongono in una cuvetta di quarzo 500 μl di proteina 1,73 mg/ml, quindi se ne misura lo
spettro da 500 a 250 nm ad ogni successiva aggiunta di 2 μl di PLP, per 10 volte consecutive.
3.7.2 Fluorimetria
Si è utilizzato un fluorimetro Beckman-Coulter modello... utilizzando i seguenti
parametri:
• Per tutti gli spettri: Slit width eccitazione = 5 , Slit width emissione = 10, Velocità
di scansione 100 nm/min
• Per gli spettri di eccitazione: Range 240-320 nm, Emissione 350 nm
• Per gli spettri di emissione: Range 300-500 nm, Eccitazione 280 nm
Sono stati analizzati i campioni descritti nella tabella 8:
campione μl apoenzima μl PLP μl KPi eccitazione emissione
1 8 0 72 X X
2 0 2 78 X X
3 8 2 70 X X
4 8 4 70 X
Tabella 8: preparazione dei campioni per la fluorimetria
Si è utilizzato KPi 100 mM a pH 7,6 come tampone, PLP 10 mM e apoenzima preparato
con il protocollo descritto nel capitolo 3.4.2.2 e diluito alla concentrazione di 0,470 mg/ml.
Si è quindi provveduto a confrontare graficamente il risultato riportando la fluorescenza in
unità arbitrarie sull'asse delle ascisse e la lunghezza d'onda sulle ordinate, senza effettuare
correzioni per il cambio di diluizione
44

Analisi dell'interazione PLP-enzima
3.7.3 Spettropolarimetria
3.7.3.1 Selettività del metodo
Dopo essere stati preparati come nella tabella 9, i campioni vengono direttamente
miscelati in una cuvetta di quarzo ed analizzati con i seguenti parametri:
• Strumento utilizzato: spettropolarimetro Jasco modello J-715
• Scansione da 500 a 250 nm, velocità 50 nm/min, fenditura 2 nm, 3 accumulazioni
• Sensibilità standard, tempo di risposta fotomoltiplicatore: 1 secondo;
• Flusso di azoto: 5 l/min
• Lunghezza del cammino ottico: 10 mm, cuvetta termostatata a 25°C
campione μl
apo-CGL
μl BSA μl PLP μl KPi
1 500 0 0 500
2 500 0 16 500
3 0 500 0 500
4 0 500 16 500
5 0 0 16 1000
Tabella 9: Preparazione dei campioni per il test di specificità del CD
Per l'analisi si è utilizzata CGL preparata con il protocollo descritto nel paragrafo 3.4.2.3 alla
concentrazione di 1,5 mg/ml, BSA alla concentrazione di 1 mg/ml, PLP alla concentrazione
10 mM e KPi 100 mM a pH 8. Ogni misura è stata corretta sottraendo la lettura del bianco,
costituito da acqua e tampone.
3.7.3.2 Analisi quantitativa
Per l'analisi quantitativa dell'interazione ligando-enzima si utilizzano i paramentri
strumentali descritti nel paragrafo precedente, con la sola modifica del range di scansione
che va da 415 a 420. Viene prima preparato il campione contenente solo proteina e tampone,
quindi ad ogni misura si aggiunge direttamente nella cuvetta una determinata quantità di PLP,
e dopo 5' di riposo si analizza.
45

Materiali e metodi
campione μl
apo-CGL
μl PLP aggiunti μl PLP finale μl KPi Vfinale
1 500 0 0 500 1000
2 500 0,1 0,1 500 1000,01
3 500 0,1 0,2 500 1000,02
4 500 0,2 0,4 500 1000,04
5 500 0,4 0,8 500 1000,08
6 500 0,8 1,6 500 1001,6
7 500 1,6 3,2 500 1003,2
8 500 3,2 6,4 500 1006,4
9 500 6,4 12,8 500 1012,8
10 500 12,8 25,6 500 1025,6
Tabella 10: Preparazione dei campioni per l'analisi quantitativa in CD
Si procede quindi all'analisi dei dati. Le uniche variabili conosciute sono la quantità di
ligando aggiunto, la quantità di enzima in soluzione e l'ellitticità della soluzione a diverse
concentrazioni. E' necessario effettuare una correzione per la diluizione causata dall'aggiunta
di PLP:
Formula 7: correzione delle concentrazioni per la diluizione
E' teoricamente possibile risalire alla concentrazione di ligando legato ipotizzando una
proporzionalità diretta tra l'ellitticità misurata e la sua concentrazione, ponendo tutto a
sistema e risolvendo:
Formula 8: calcolo della concentrazione di ligando legato mediante CD.
Si possono quindi rappresentare i dati graficamente in due modi: confrontando la
concentrazione di ligando legato con quella del ligando libero, oppure confrontando il
rapporto fra ligando libero e legato con la concentrazione di ligando legato (grafico di
Scatchard [101]). Per poter realizzare quest'ultimo è necessario conoscere la concentrazione
di ligando libero:
46
[ PLP totalek ]=
l PLPaggiunti∗[ PLPstandard ]
Vfinalek
[ proteina totalek ]=
[ proteina totaleiniziale]
Vfinalek
{
[ PLP legatosaturazione ]=[ proteina totalesaturazione]
a=
saturazione
[ proteina totalesaturazione]
k =a[ PLP legatok ]
[ PLP legatok ]=
[ proteina totalesaturazione]∗saturazione
k

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