Tesi bianchino

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Tesi bianchino

  1. 1. UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO DIPARTIMENTO DI SCIENZE FARMACEUTICHE Dottorato di Ricerca in Scienze Farmaceutiche VIII-CICLO NUOVA SERIE 2006-2009 PROGETTAZIONE E SVILUPPO DI NUOVI FARMACI ANTIMICROBICI Erminia Bianchino
  2. 2. ~ 1 ~    Sommario    INTRODUZIONE ........................................................................................................4 CAPITOLO 1:...............................................................................................................8 LA MEMBRANA CELLULARE ...............................................................................8 Aspetti generali.............................................................................................................8 Il modello a mosaico fluido ..........................................................................................9 I lipidi della membrana cellulare ................................................................................ 10 Proteine integrali di membrana................................................................................... 12 Proteine periferiche di membrana............................................................................... 15 Asimmetria della membrana cellulare ........................................................................ 16 Fluidità della membrana cellulare............................................................................... 18 Effetti del colesterolo sulla fluidità di membrana................................................... 21 Permeabilità della membrana cellulare....................................................................... 23 Composizione e struttura della membrana citoplasmatica batterica ed archeobatterica .................................................................................................................................... 26 CAPITOLO 2:............................................................................................................. 33 I PEPTIDI ANTIMICROBICI (AMP) ....................................................................... 33 Origine degli AMP...................................................................................................... 33 AMP dagli insetti.................................................................................................... 33 AMP da altri invertebrati ........................................................................................ 34 AMP dai vertebrati.................................................................................................. 34 Caratteristiche generali degli AMP............................................................................. 35 AMP come fattori dell’immunità innata conservati nel corso dell’evoluzione .......... 37 Meccanismi d’azione degli AMP................................................................................ 38 Classificazione degli AMP ......................................................................................... 40 AMP ad α-elica....................................................................................................... 41 AMP ricchi di cisteina ............................................................................................ 41
  3. 3. ~ 2 ~    AMP a foglietto β ................................................................................................... 41 AMP ricchi in aminoacidi specifici ........................................................................ 41 AMP con aminoacidi rari modificati ...................................................................... 42 Interazione degli α-AMP con la membrana plasmatica.............................................. 42 Formazione del canale ionico ................................................................................. 46 Altre modalità d’azione degli AMP........................................................................ 47 L’anfifilicità come strategia nell’azione antimicrobica degli AMP........................ 47 Relazione tra composizione aminoacidica ed azione antimicrobica degli α-AMP..... 49 Lunghezza e massa molecolare degli α-AMP......................................................... 50 Il punto isoelettrico e la carica netta modulano l’azione antimicrobica degli α-AMP 50 L’idrofobicità e l’anfifilicità influenzano l’azione antimicrobica degli α-AMP......... 51 AMP come agenti terapeutici...................................................................................... 51 Gli AMP nei trial clinici ............................................................................................. 53 CAPITOLO 3.............................................................................................................. 55 RACCOLTA, CATALOGAZIONE DI AMP E ANALISI STATISTICHE SULLA LORO COMPOSIZIONE AMINOACIDICA............................................................ 55 Creazione di un nuovo Database di AMP................................................................... 55 Relazione tra la composizione aminoacidica e l’attivita antimicrobica di AMP a differente spettro d’azione .......................................................................................... 59 Idrofobicità, polarità e carica netta influenzano l’attività antimicrobica degli AMP.. 62 Studio di correlazione tra la composizione aminoacidica media e la media ponderata sulla MIC in α-AMP ................................................................................................... 64 Indice di correlazione di Pearson............................................................................ 65 CAPITOLO 4.............................................................................................................. 68 ANALISI STATISTICHE E PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS ESEGUITE SULLE COMPOSIZIONI AMINOACIDICHE MEDIE DEI 101 PROTEOMI COMPLETI ................................................................................................................ 68 Presupposti e obiettivi dell’analisi proteomica........................................................... 68 Raccolta ed estrazione dei proteomi completi dai database più accreditati................ 71 Abbondanza aminoacidica media calcolata per i 101 proteomi completi................... 73
  4. 4. ~ 3 ~    Principal Component Analysis (PCA) eseguita sulle composizione aminoacidiche.. 77 Evidenze biologiche a supporto dei risultati ottenuti: commento ai risultati della PCA calcolata sui 101 proteomi completi ........................................................................... 81 CAPITOLO 5.............................................................................................................. 89 ANALISI STATISTICHE E PCA ESEGUITE SULLE COMPOSIZIONI AMINOACIDICHE MEDIE DELLE α-ELICHE TM DEI 101 ORGANISMI......... 89 Individuazione ed estrazione delle α-eliche trans membrana dai proteomi completi . 89 Predizione della topologia........................................................................................... 90 Implementazione dei predittori................................................................................... 93 Descrizione tecnica del software Phobius................................................................... 95 Analisi statistiche sulla composizione aminoacidica delle α-eliche ........................... 96 Principal Component Analysis (PCA) eseguita sulle composizione aminoacidiche medie delle α-eliche TM............................................................................................. 98 Evidenze biologiche a supporto dei risultati ottenuti: commento ai risultati della PCA calcolata sulle α-eliche TM......................................................................................... 99 CAPITOLO 6............................................................................................................ 104 CLUSTER ANALYSIS............................................................................................ 104 Caratteri generali....................................................................................................... 104 Decrizione delle tecniche alla base della cluster analysis......................................... 104 Tecniche gerarchiche di analisi dei gruppi ............................................................... 105 Tecniche gerarchiche aggregative............................................................................. 106 Metodo del legame singolo o del vicino più prossimo ......................................... 107 Metodo del legame completo................................................................................ 107 Metodo del legame medio o della media di gruppo.............................................. 107 Metodo del centroide ............................................................................................ 107 Metodo di Ward.................................................................................................... 107 Tecniche non gerarchiche di analisi dei gruppi ........................................................ 108 Scelta tra le tecniche di analisi dei gruppi................................................................. 109 Discussione dei risultati ottenuti dalla cluster analysis............................................. 109
  5. 5. ~ 4 ~    Relazione tra temperatura e composizione aminoacidica......................................... 113   CAPITOLO 7............................................................................................................ 117 PROGETTAZIONE DI UN POLIMERO POTENZIALMENTE ATTIVO............ 117 Modifiche strutturali ad aminoacidi aromatici.......................................................... 121 Saggio di attività ....................................................................................................... 125 CAPITOLO 8............................................................................................................ 127 DATABASE UTILIZZATI ...................................................................................... 127 UniProt...................................................................................................................... 127 Descrizione tecnica sull’estrazione dei proteomi eucariotici dal database UniProtKB ............................................................................................................ 129 HAMAP.................................................................................................................... 130 Descrizione tecnica sull’estrazione dei proteomi archeobatterici e batterici dal database HAMAP ................................................................................................. 130 Human Red Blood Cell Database ............................................................................. 131 Conclusioni............................................................................................................... 132 BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 133 APPENDICE ............................................................................................................ 144           
  6. 6. ~ 5 ~    INTRODUZIONE Le membrane cellulari sono sistemi chimici complessi nei quali il substrato lipidico e la controparte proteica giocano un ruolo fondamentale al fine di soddisfare i bisogni cellulari. Un buon esempio di ciò è dato dalla risposta all’heat shock e al raggiungimento dell’omeostasi; le alte temperature aumentano il processo di unfolding delle proteine e cambiano lo stato fisico delle membrane. Tra le molteplici risposte che le cellule esplicano, vi è anche l’alterazione della composizione lipidica per ripristinare il controllo della funzionalità chimico-fisica delle membrane. Queste ultime devono fornire il corretto intorno lipidico a tutte le proteine transmembrana e ciò viene realizzato mediante una organizzazione in raft lipidici con composizioni ben definite. L’ipotesi alla base di questo lavoro era verificare quanto la composizione aminoacidica delle porzioni transmembrana delle proteine di membrane di un gruppo di organismi presi in esame, riflettesse la diversa composizione lipidica delle membrane. La verifica di questa ipotesi permette un nuovo approccio alla lipidomica attraverso l’impiego di quelle numerosissime e ubiquitarie sonde chimiche che sono le sequenze transmembrana. Questa indagine, che riveste una fondamentale importanza teorica, assume anche una valenza pratica. Lo studio dell’interplay tra domini lipidici e composizione aminoacidica delle porzioni proteiche transmembrana, apre la strada a diverse possibilità di progettazione di nuovi farmaci agenti su membrane. Nel corso del progetto di dottorato sono state investigate le modalità di azione di una sottoclasse dei peptidi antimicrobici naturali (AMP) costituita da peptidi ad alfa elica agenti direttamente sulle membrane lipidiche (AMPHM). Questi peptidi costituiscono una classe sufficientemente numerosa da permettere una accurata indagine statistica. I peptidi antimicrobici naturali rappresentano un componente essenziale del sistema immunitario innato di organismi appartenenti a diversi livelli della scala evolutiva quali mammiferi, anfibi, insetti, piante e protozoi [1] . Oltre ad essere costitutivamente espressi, i geni codificanti per i peptidi naturali possono, spesso, essere rapidamente indotti da stimoli lesivi, infiammatori o da componenti microbici [2]. Da un punto di vista strutturale, i peptidi naturali sono costituiti da 12-50 aminoacidi, molti di essi presentano una carica positiva netta dovuta ad un eccesso di
  7. 7. ~ 6 ~    aminoacidi basici rispetto a quelli acidi [3]. Essi presentano, inoltre, caratteristiche di anfipaticità poiché possiedono una struttura tridimensionale che espone una porzione costituita da aminoacidi idrofobici ed un'altra costituita da aminoacidi polari [3]. Ad oggi, sono stati isolati e descritti oltre 800 peptidi antimicrobici [4] che, nonostante una base strutturale comune, differiscono tra loro per lunghezza, sequenza aminoacidica, presenza di legami disolfuro e struttura secondaria [3]. Sebbene l'esatto meccanismo con cui i peptidi antimicrobici svolgono la loro azione microbicida non sia stato chiarito ancora del tutto, si ritiene generalmente che esso coinvolga l'interazione del peptide stesso con la membrana citoplasmatica dei microrganismi target, portando alla sua permeabilizzazione con conseguente lisi e morte cellulare [5]. Il Target unico di tutti gli AMP è la membrana cellulare, la maggior parte di essi non ha un recettore specifico ma attacca direttamente il bilayer. Comprendere i dettagli della composizione lipidica e proteica delle varie membrane bersaglio è dunque indispensabile per l’indagine dei meccanismi d’attività antimicrobica di questi peptidi, nonché per la progettazione di peptidi o peptidomimetici efficaci e sicuri. L’obiettivo principale di questo progetto di dottorato era chiarire la relazione tra la composizione aminoacidica delle porzioni transmembrana delle proteine di membrana e la composizione lipidica delle membrane stesse. Chiarito il meccanismo di back-regulation tra parte proteica e parte lipidica delle membrane, si è cominciato a progettare peptidi antimicrobici agenti su membrane. Approfondire lo studio dell’interazione peptide-membrana plasmatica da un punto di vista computazionale risulta estremamente complesso, a causa dell’eterogeneità dei lipidi e della varietà delle proteine che costituiscono le membrane bersaglio. Le proteine integrali di membrana sono un target rappresentativo dell’intorno lipidico in cui sono immerse, per questo si è scelto di studiarne statisticamente la composizione aminoacidica e ricavare indirettamente le caratteristiche lipidiche di membrane appartenetenti ad organismi evolutivamente distanti. Per verificare questo ultimo punto è stata eseguita un’analisi sull’abbondanza aminoacidica relativa ai proteomi completi e alle sole porzioni ad α-elica transmembrana di Archaea, Batteri ed Eucarioti, per un totale di 101 organismi. Per questo lavoro di tesi, sono state utilizzate tecniche computazionali e di bioinformatica quali:
  8. 8. ~ 7 ~    • Calcolo di proprietà chimiche tramite metodi ab-initio e semiempirici (Materials Studio, Discovery Studio, PM3, PM6). • Analisi proteomica tramite string manipulation e metodi ad elementi finiti (Phobius, Matlab). • Applicazione di tecniche statistiche e bioinformatiche quali algoritmi genetici e principal component analysis (GA, PCA, Matlab). • Docking e dinamica molecolare (Autodock e NAMD).
  9. 9. ~ 8 ~    CAPITOLO 1: LA MEMBRANA CELLULARE Aspetti generali La membrana cellulare, anche detta membrana plasmatica o plasmalemma, è un sottile rivestimento che delimita la cellula in tutti gli organismi viventi. Formata in prevalenza da fosfolipidi, viene chiamata anche bilayer fosfolipidico, ed ha uno spessore di circa 5 nm (50 Å). Nella componente lipidica si vanno a collocare, con importanti funzioni fisiologiche, proteine e una piccola percentuale di glucidi, in forma di glicoproteine e glicolipidi, e di molecole di colesterolo che la stabilizzano. Negli organismi procarioti è ricoperta da un rivestimento protettivo chiamato parete cellulare, assente invece negli eucarioti animali; nelle cellule eucariotiche vegetali essa è presente sotto forma di una parete cellulare primaria (composta principalmente da pectina) e di una parete cellulare secondaria (composta principalmente da lignina). La membrana plasmatica presiede all'omeostasi cellulare, grazie alla sua permeabilità selettiva. Per la sua posizione di interfaccia, la membrana plasmatica, oltre alla funzione strutturale, svolge tre funzioni essenziali: 1. la funzione di filtro selettivo, che lascia passare alcune sostanze piuttosto che altre, assicurando così l'integrità biochimica del citoplasma; 2. la funzione di superficie di comunicazione, permettendo sia lo scambio di informazioni tra l'ambiente intra- ed extracellulare, sia l'interazione fisica con le strutture extracellulari circostanti. 3. la funzione di superficie catalitica, dato l'abbondante numero di enzimi ad essa legati, in gran parte coinvolti nella produzione di messaggeri intracellulari, come le fosfolipasi e la sfingomielinasi, che idrolizzano i fosfolipidi di membrana, e l’adenilatociclasi, che sintetizza AMP ciclico. Infine, la membrana cellulare partecipa a funzioni complesse: esocitosi (secrezione), endocitosi (ingestione di sostanze esterne mediante la formazione di vescicole), adesione e movimento cellulare ameboide (es. leucociti). La struttura e le funzioni della membrana plasmatica sono comuni a quelle delle membrane intracellulari, come ad esempio la membrana nucleare.
  10. 10. ~ 9 ~    Il modello a mosaico fluido Secondo il "modello a mosaico fluido", proposto nel 1972 da Singer e Nicolson [6], il doppio strato lipidico della membrana plasmatica è allo stato liquido-cristallino ed in esso sono immerse numerose proteine, che grazie alla fluidità della componente lipidica presentano un notevole grado di mobilità; ad esse spetta lo svolgimento della gran parte delle funzioni di membrana. Il doppio strato lipidico [7] non ha carattere omogeneo, ma piuttosto all'interno del mosaico fluido sono presenti microdomini lipidici meno fluidi (rafts), formati principalmente da sfingolipidi e colesterolo allo stato liquido-ordinato [8], che funzionerebbero sia da zattere di trasporto di componenti di membrana, sia da piattaforme per la genesi di segnali intracellulari, per cui in essi sono concentrate proteine specifiche. Attualmente si distinguono due tipi di rafts: le caveole e i rafts "non invaginati". Le prime si presentano morfologicamente come fossette (caveolae) della superficie cellulare e biochimicamente sono caratterizzate dalla presenza della proteina strutturale caveolina, essenziale per la loro costituzione. I rafts "non invaginati" sono piattaforme morfologicamente indistinguibili dalla restante porzione della membrana cellulare; in condizioni basali sono di piccolissime dimensioni, ma sono in grado di confluire per formare piattaforme di maggiori dimensioni in seguito a stimolazione, ad esempio in conseguenza del legame dei recettori contenuti nei rafts con i corrispondenti segnali extracellulari. Il concetto iniziale del modello a mosaico fluido, che prevedeva una distribuzione casuale delle proteine con ampia libertà di movimento laterale e di rotazione, deve quindi essere rivisto in favore di un modello di membrana in cui all'interno del doppio strato lipidico fluido esistono domini lipidici e aggregati proteici a carattere dinamico, la cui mobilità è ristretta sia dai legami lipidi-lipidi, proteina-proteina o proteina-lipidi, sia dalle interazioni delle proteine con il citoscheletro, con la matrice extracellulare o con cellule adiacenti.
  11. 11.   Figura 1: legano for Le protein mezzo acq presentan I lipidi d I lipidi [7 pur essen ogni pro fosfolipid I princ fosfatidil compless dei lipidi presenti segnali plasmeni membran muscolar anfipatic natura an formata d (OH), ca (N+ (CH3) Immagine d rtemente al b ne estrinseche quoso sia su o della caten della memb 7] costituisc ndo molto p oteina). Le di (70% del ipali fosf lserina (PS sivamente q i di membra in piccole intracellula iletanolamm ne, con pref ri striate e he, cioè m nfipatica è d dall'acido o arbossilico )3) del rad della membra bilayer, costit e sono legate l versante in e zuccherine brana cellul cono circa i più numeros e tre princ l peso lipidi folipidi di S), fosfatid queste quat ana. Altri fo quantità, m ari. I plas mina, costit ferenza per cellule ne manifestano dovuta alla p ortofosforico (COOH), a dicale legat ~ 10 ~ ana cellulare tuito per la m alle superfic ntra- che ext laterali sulla lare il 50% della si delle prot ipali classi ico totale), c i membran diletanolamm ttro specie fosfolipidi, c ma svolgono smalogeni, tuiscono c le cellule ec ervose. I l proprietà presenza di o (PO4) a cu amminico (N to all'ortofo ~  e. Le protein maggior parte ci idrofiliche ( tracellulare. a superficie ex a massa del teine (circa i di lipidi colesterolo na sono: mina (PE) lipidiche co come il fos o un ruolo principalm irca il 18% ccitabili: ce ipidi di m sia idrofob una estrem ui si aggiun NH2) o ion osfato, e d e intrinseche e da fosfolipi (polari), che Alcune prot xtracellulare. lla membran 50 molecol delle mem (20%) e gli fosfatidil e sfingom ostituiscono fatidilinosit cruciale ne mente plasm % dei fos ellule mioca membrana s biche che i mità polare i ngono i grup ne ammonic di una estr e penetrano idi e colester si affacciano eine intrinse . na plasmati e lipidiche p mbrane son icolipidi (5% lcolina (P mielina (SM o oltre il 50 tolo (PI), so ella genesi menilcolina sfolipidi de ardiche, cell ono molec drofiliche. idrofila (test ppi ossidril co quaterna remità apol e si olo. nel eche ica, per no: %). C), M); 0% ono dei a e elle lule cole La ta), lico ario lare
  12. 12. ~ 11 ~    idrofoba (coda) formata dalle catene alifatiche degli acidi grassi o dal nucleo ciclopentanoperiidrofenantrenico del colesterolo. A causa della natura anfipatica, i fosfolipidi e i glicolipidi formano lamine bimolecolari. In ciascun monostrato i lipidi sono allineati tra loro, con le teste polari dirette all'esterno, verso l'ambiente acquoso, e con le code idrofobiche rivolte verso l'interno del doppio strato. L'associazione tra le molecole lipidiche è sostenuta da legami elettrostatici (dipolari e idrogeno) tra le teste e dai deboli legami di Van der Waals tra le catene alifatiche (dipolo indotto- dipolo indotto). I lipidi di membrana svolgono una funzione strutturale, costituendo l'impalcatura fondamentale della membrana plasmatica; una funzione di barriera semipermeabile, che si lascia attraversare liberamente dalle molecole liposolubili, ma risulta impenetrabile da quelle idrosolubili [9]; una funzione metabolica, in quanto rappresentano una fonte di mediatori lipidici, che possono essere mobilizzati in risposta agli stimoli esterni: inositol-1,4,5- trifosfato (IP3), diacilglicerolo (DAG), acido fosfatidico (PA), liso-PAF (lyso- platelet-activating factor), ceramidi. Sebbene la funzione dei plasmalogeni non sia del tutto chiarita, si ritiene che questi lipidi possano proteggere le membrane dallo stress ossidativo, agendo come antiossidanti endogeni, in quanto il legame vinilico è in grado di legare radicali liberi (effetto scavenger o spazzino). Altre funzioni che sono state attribuite ai plasmalogeni di membrana includono la modulazione della fluidità di membrana e la partecipazione negli eventi di fusione tra le membrane cellulari, grazie alla loro propensione a formare fasi esagonali. Un cenno particolare richiede il PI, essendo esso il precursore di importanti composti fosforilati di membrana: fosfatidilinositolo-monofosfati [PI-3-P, PI-4-P (PIP), PI-5-P]; fosfatidilinositolo-bifosfati [PI-3,4-P2, PI-4,5-P2 (PIP2), PI-3,5-P2]; fosfatidilinositolo-trifosfato [PI-3,4,5-P3 (PIP3)]; PIP e PIP2 sono i più abbondanti, dal momento che costituiscono circa il 60% del totale dei fosfatidilinositol-fosfati. PI-4,5-P2 ha una notevole importanza perché da un lato da esso deriva l'IP3, un secondo messaggero solubile prodotto dalle fosfolipasi C (PLC), dall'altro interagisce, nelle membrane, con numerose proteine, modulandone la funzione.
  13. 13. ~ 12 ~    Proteine integrali di membrana Le membrane delle cellule animali hanno una percentuale proteica approssimativa del 50%. La membrana mitocondriale interna arriva a contenere una percentuale in proteine intorno al 75%, mentre la mielina che avvolge le cellule nervose e che svolge una funzione di isolante elettrico, contiene soltanto il 25% in proteine. Le proteine sono immerse nel "mare" lipidico e svolgono una serie di importanti funzioni [10]: 1. funzione di trasporto di ioni e molecole; 2. funzione recettoriale, permettendo il riconoscimento di segnali extracellulari; 3. funzione enzimatica, con la generazione di segnali intracellulari, utilizzando le componenti lipidiche delle membrana; 4. funzione di collegamento, fungendo da intermediari nella interazione funzionale tra due proteine (per es. fra recettore ed enzima); 5. funzione strutturale e meccanica, costituendo punti di ancoraggio per strutture extra- e/o intra-cellulari. Dal punto di vista strutturale le proteine, in base alle caratteristiche della loro estrazione dalla membrana, possono essere distinte in due tipi: proteine integrali e periferiche [10]. Per la maggior parte le proteine integrali sono transmambrana (TM), cioè si estendono da un lato all'altro della membrana citoplasmatica con due o più regioni idrofiliche che sporgono dalla superficie della membrana, collegate da un tratto idrofobico intermedio immerso nel doppio strato lipidico. Il loro riconoscimento è facilitato dalla presenza di questi segmenti trans membrana altamente idrofobici responsabili della loro interazione con il bilayer [11]. Le differenze nelle modalità di isolamento riflettono le caratteristiche dell'inserimento delle proteine nella membrana. Le proteine integrali necessitano, per essere isolate, di trattamenti drastici, che scompaginano la struttura stessa della membrana cellulare. Possono essere distinte in transmembranose, intramembranose e proteine con ancore lipidiche. Le proteine integrali possono attraversare il doppio stato lipidico completamente una o più volte (proteine transmembranose bi- o poli-topiche), oppure possono attraversarlo parzialmente, emergendo con entrambe le
  14. 14.   estremità membran transmem loro estre Figura 2: I segmen principal leucina, i gli amino segmenti elica, in m idrogeno Una clas covalente lipidici cellulare isoprenoi glicosilfo oligosacc distribuis hanno un lipidici a hanno ca stato liq à dallo st na (protei mbranose po emità C-term Differenti tip nti proteici lmente da isoleucina, oacidi che i intramemb modo tale c o (O- ••••• H sse importa emente all sono utiliz . Questi gr idi (far osfatidilinos caridi). Le scono di pre na conforma allo stato liq atene lipidic quido-ordina tesso versa ine intram ossono esse minale sia in pi di proteine che attrave aminoacidi alanina e v costituiscon branosi ass che tutti i le H+ ) riducen ante di prot a catena p zzati come ruppi comp rnesilpirofos sitolo (GP proteine pa eferenza ne azione parti quido-ordin che ramifica ato, si dist ~ 13 ~ ante, citop membranos ere indicate ntra- o extra integrali di m ersano il do i non pola valina. Poich no la caten sumono di egami pepti ndo la polar teine integr peptidica ( ancore ch prendono: a sfato e PI, moleco almitoilate e ei rafts, in q icolarmente nato. Al con ate e volum tribuiscono ~  plasmatico se monoto come di tip a-cellulare. membrana. oppio strato ari (idrofob hé i legami na proteica regola una dici possan rità del seg rali contien (lipid-ancho he si inser acidi grassi geranil la comple e miristoila quanto le lo e adatta ad e ntrario, le p minose, non di prefere o extrace opiche). po I o II, a s o lipidico s bici), sopra peptidici ( sono essi s a configura no formare t gmento intra e catene lip ored protein riscono nel i (palmitico lgeranilpiro essa forma ate e quelle ro catene li essere acco proteine iso idonee per enza nelle ellulare, de Le prote seconda che sono compo attutto glici -CO- NH+ ) stessi polar azione ad a tra loro lega amembrano pidiche leg ns). I grup lla membra o e miristic ofosfato) ata da PI GPI-legate ipidiche satu olta nei dom oprenilate, c r i domini a regioni de ella eine e la osti ina, tra ri, i alfa ami oso. gate ppi ana co), o e e si ure mini che allo ella
  15. 15. ~ 14 ~    membrana più fluide (stato liquido-cristallino). Le proteine GPI-legate sono localizzate esclusivamente nel foglietto esterno della membrana cellulare, mentre quelle legate ad acidi grassi o isoprenoidi sono presenti unicamente nel foglietto interno. Gli acidi grassi e gli isoprenoidi sono legati alla molecola peptidica tramite legame estere con il gruppo tiolico della cisteina. L'idrolisi del legame estere da parte di enzimi specifici permette di regolare l'associazione di queste proteine al versante citoplasmatico della membrana cellulare e quindi di controllarne la compartimentazione fra citoplasma e membrana. L'asimmetria strutturale delle proteine rispetto al doppio strato lipidico riflette un'asimmetria a livello funzionale: proteine con 2, 4 o 6 segmenti trans membrana funzionano generalmente come canali, proteine con 7 segmenti trans membrana sono di solito adibite a pompe, mentre proteine con 12 segmenti trans membrana sono principalmente trasportatori [12]. L’abbondanza di proteine TM ad α-elica è stata misurata per diversi organismi [13-15]. In generale, il numero medio di sequenze TM ha valori compresi tra il 20 e il 30% per i genomi microbici e una percentuale leggermente più alta per gli organismi eucariotici. L’analisi del genoma [16] ha mostrato una prevalenza di proteine con 7 domini TM negli eucarioti mentre per i batteri vi è una abbondanza di proteine con 6 o 12 domini TM. Vi sono alcune caratteristiche che regolano la presenza di TM: • C’è una relazione lineare tra il numero di proteine di membrana e il numero di ORF. • La maggior parte delle proteine di membrana integrali ha un singolo dominio politopico. Circa il 78% delle TM di archeobatteri e procarioti e il 67% di quelle eucariotiche contengono un singolo dominio di membrana [17], suggerendo che la ricombinazione tra domini non è comune all’interno delle membrane. Diversamente le proteine solubili che nel corso dell’evoluzione acquistano nuove funzioni sono il frutto di ricombinazioni tra diversi domini (circa il 65% dei domini procariotici e l’80% eucariotici sono in combinazione con altri domini). Le proteine di membrana potrebbero raggiungere lo stesso obiettivo attraverso un utilizzo più frequente di associazioni oligomeriche non covalenti con la membrana.
  16. 16. ~ 15 ~    • Il numero delle famiglie proteiche TM politopiche è più piccolo rispetto a quello delle proteine solubili [17, 18]. Nei domini TM alcuni aminoacidi, come GLy e Pro occupano posizioni conservate mentre aminoacidi quali Ile, Val e Met sono meno conservati. Residui di Cys, Trp, e Tyr mostrano una tendenza ad apparire prossimi l’un l’altro [19]. Particolarmente interessante è la presenza di coppie di Gly in proteine alfa-elica TM. Il motivo GxxxG, ossia 2 glicine in posizione i e i+4, è un elemento strutturale chiave nell’associazione dimerica dell’interfaccia transmembrana delle glicoforine [20]. Una separazione lunga 4 residui posiziona una coppia sulla stessa faccia dell’ α-elica. Il motivo GxxxG fa si che piccoli residui presenti sulla stessa faccia dell’elica, e prossimi a grandi catene laterali, possano aumentare l’area di impacchettamento. Oltre alle coppie di Gly vi sono altre combinazioni di due residui di piccole dimensioni (Ala, Ser) in posizione i e i+4 che risultano significativamente sovra rappresentate. Anche gli aa di grandi dimensioni (Ile, Val, Leu) possono essere distanziati da 4 residui, ma hanno più frequentemente posizioni i+1 e i+2. Questi motivi sono ben conservati all’interno di famiglie TM che hanno funzione di trasportatori simporto e di canale [18]. I residui di glicina permettono la formazione di deboli legami a idrogeno tra le eliche: queste interazioni sono abbastanza favorite all’interno della parte apolare delle membrane, e sono in grado di stabilizzare la membrana stessa [21]. Le eliche con angoli levogiri sono impacchettate in maniera più stretta rispetto a quelle con angoli destrogiri [22]. I residui aminoacidici più grandi come Phe, Trp e His possiedono la propensione ad apparire nelle tasche transmembrana, riempiendo le zone “vuote” tra i fosfolipidi, mentre quelli più piccoli (Ser, Gly, Ala) non lo fanno. Proteine periferiche di membrana Le proteine periferiche possono essere isolate più facilmente dalla membrana, attraverso trattamenti blandi (es. variazioni del pH o della forza ionica del mezzo). Ciò è legato al fatto che le proteine periferiche non si inseriscono nel doppio strato lipidico, ma si associano alla sua superficie, intra- o extra- cellulare, interagendo con la testa polare dei lipidi o con le proteine integrali. Fanno parte delle proteine periferiche associate con la faccia citoplasmatica
  17. 17. ~ 16 ~    della membrana cellulare alcuni enzimi e le proteine del citoscheletro spectrina e actina. Le proteine che contengono domini PH (Pleckstrin Homology), come le fosfolipasi C (PLC), si legano ai derivati fosforilati dei PI. Le proteine provviste di domini C2 (protein kinase C domain 2) aderiscono tramite ponti di Ca2+ a fosfolipidi anionici (PS e PI). La presenza di domini SH (Src Homology) consente alle proteine citoplasmatiche di associarsi ai residui tirosinfosforilati di proteine di membrana, in particolare dei recettori di membrana con attività tirosinchinasica. Una proprietà delle proteine periferiche consiste nella possibilità che la loro associazione con la membrana possa essere transitoria e soggetta a regolazione, ad esempio dalla attivazione delle proteine stesse o dei substrati ai quali esse aderiscono. Grazie a questa regolazione le proteine periferiche possono spostarsi fra citoplasma e membrana plasmatica a seconda delle necessità funzionali della cellula [23]. Alcuni enzimi, come la proteinchinasi C (PKC), si legano alla membrana in risposta alla attivazione da parte del Ca2+ intracellulare. Asimmetria della membrana cellulare La composizione dei due foglietti, esterno e interno, della membrana cellulare presenta notevoli differenze, non solo nella componente proteica, ma anche nella stessa componente lipidica, per cui la membrana plasmatica è caratterizzata da una marcata asimmetria, che riflette le differenti funzioni dei due monostrati. In primo luogo i glucidi (oligosaccaridi), che sono presenti nella membrana plasmatica in forma di glicoproteine e glicolipidi, sono situati nel solo foglietto esterno, in contatto con l'ambiente extracellulare, dove possono svolgere una funzione recettoriale, in particolare nei processi di adesione tra le cellule, oppure una funzione protettiva, formando uno strato (glicocalice) che riveste esternamente la membrana plasmatica, proteggendola dagli insulti meccanici e chimici. Per quanto riguarda i lipidi, oltre 80% delle molecole che nella testa polare contengono colina (-(CH3)3N+CH2CH2OH-), precisamente PC e SM, sono situate nel monostrato esterno della membrana, mentre circa il 90% dei lipidi con teste senza carica netta (PE) o con carica netta negativa (PS e PI), sono localizzati di preferenza nel monostrato interno. Ciò comporta una
  18. 18. ~ 17 ~    prevalenza di cariche negative sul versante citoplasmatico della membrana cellulare. L'asimmetria dei fosfolipidi di membrana è generata durante la sintesi della membrana nel reticolo endoplasmatico, nel quale carriers (proteine trasportatrici) di fosfolipidi trasportano specifici fosfolipidi da un monostrato all'altro. Una volta che le neomembrane hanno raggiunto la superficie cellulare, l'asimmetria dei fosfolipidi è mantenuta dall’attività coordinata di specifici meccanismi di trasporto. Sono stati identificati almeno tre meccanismi. • La traslocasi ATP-dipendente specifica per gli aminofosfolipidi (o flippasi), trasporta rapidamente PE e soprattutto PS dal monostrato esterno a quello interno. • La floppasi ATP-dipendente non specifica trasporta lentamente e senza specificità fosfolipidi dal monostrato interno a quello esterno. La floppasi è un membro della superfamiglia ABC di proteine trasportatrici, un gruppo di proteine specializzate nel trasporto ATP-dipendente di molecole anfipatiche. Fa parte di questa famiglia la proteina ABCA1, responsabile del trasferimento del colesterolo dalla membrana plasmatica alle HDL. • La scramblase (dall'inglese to scramble, mescolare), una proteina Ca2+ -dipendente non specifica, che consente ai fosfolipidi di muoversi casualmente tra i due monostrati. L'asimmetria di membrana ha un ruolo importante nella funzionalità cellulare. La prevalenza dei fosfolipidi contenenti etanolammina (PE e plasmeniletanolammina) nel foglietto interno della membrana e dei colino- fosfolipidi nel foglietto esterno potrebbe influenzare i processi di endo- ed eso- citosi, dal momento che gli etanolammino-fosfolipidi hanno predilezione per la fase HII, mentre i colino-fosfolipidi per la fase lamellare. Inoltre, alcune proteine periferiche (PKC, annessina, spectrina) si fissano alla superficie citosolica della membrana grazie alla interazione con la PS. La perdita della asimmetria provoca un aumento degli aminofosfolipidi, in particolare della PS, sulla superficie cellulare, con notevoli conseguenze per la fisiologia cellulare. La trasformazione della membrana plasmatica delle piastrine in una superficie procoagulante è causata dalla alterazione della asimmetria dei fosfolipidi, che comporta un'eccessiva presenza di PS sul foglietto esterno; ciò promuove la coagulazione e la trombosi, aumentando la formazione di trombina di oltre un
  19. 19. ~ 18 ~    milione di volte. L'esposizione della PS fornisce una superficie catalitica per l'assemblaggio dei complessi enzimatici: protrombinasi (complesso dei Fattori Va e Xa che catalizza la conversione di protrombina in trombina) e tenasi (complesso attivante il Fattore X, composto dai Fattori IXa e VIIIa). Inoltre, l'esposizione della PS nel monostrato esterno rende la cellula riconoscibile ed eliminabile dai fagociti del sistema reticolo-endoteliale. Fluidità della membrana cellulare In condizioni fisiologiche, sia le molecole lipidiche sia quelle proteiche in esse immerse sono in grado di muoversi all'interno del proprio monostrato della membrana cellulare. A temperature fisiologiche, la membrana cellulare è allo stato lamellare liquido-cristallino, in cui le catene idrocarboniose dei lipidi sono allo stato fluido, manifestando una notevole libertà di movimento (stato Lα di Luzzati) [24]. Al contrario, allo stato cristallino le catene idrocarboniose presentano una disposizione rigida, parallela alla perpendicolare della superficie del doppio strato (Lβ) o angolata rispetto a questa (Lβ’). La temperatura alla quale si verifica la fusione delle catene alifatiche, cioè il passaggio dallo stato cristallino a quello liquido-cristallino, si definisce temperatura di transizione (Tc o Temperatura Critica oppure Tm da melting). La maggior parte delle proteine presenta movimenti di spostamento (diffusione) laterale; fanno eccezione le proteine di membrana ancorate al citoscheletro. Per quanto riguarda i lipidi di membrana, sono stati descritti diversi tipi di movimenti sia intramolecolari che intermolecolari: 1. Rotazione intorno ai legami semplici C-C 2. Rotazione intorno all'asse longitudinale 3. Rotazione intorno all'asse trasversale (la rotazione di 180° porta ad un movimento di flip-flop) 4. Diffusione laterale 5. Movimenti collettivi, come l'ondulazione della membrana Il movimento intermolecolare si svolge soprattutto in direzione orizzontale (diffusione laterale), oltre che intorno agli assi longitudinale e trasversale della molecola (rotazione e oscillazione), ma solo raramente avviene la rotazione
  20. 20. ~ 19 ~    trasversale di 180°, che causa il passaggio della molecola da un monostrato all'altro (movimento di flip-flop). Infatti, dal punto di vista termodinamico, è sfavorevole per una molecola polare penetrare con la sua estremità idrofila nella parte idrofoba del doppio strato; la spesa di energia è minore nel caso di una molecola lipidica, ma anche in questo caso lo spostamento da una parte all'altra della membrana avviene molto lentamente. Nelle membrane artificiali e naturali, una singola molecola lipidica scambia il posto con quelle vicine con una frequenza di circa 107 volte al secondo e diffonde alcuni micron al secondo a 37°C, con un coefficiente di diffusione (D) di circa 10-8 cm²/s. A questa velocità di spostamento, una molecola lipidica può diffondere lungo l'intera cellula batterica (≈1µ) in un solo secondo, mentre può percorrere l'intera circonferenza di una cellula animale in circa 20 secondi [25]. I movimenti intramolecolari consistono nella rotazione intorno ai legami semplici C-C, che comporta l'isomerizzazione tra le differenti conformazioni della molecola lipidica, in particolare l'isomerizzazione trans-gauche. I movimenti di rotazione dei gruppi metilici e di isomerizzazione trans-gauche sono massimi verso il centro del doppio strato lipidico. La conformazione trans è la più stabile (minor contenuto di energia) in quanto i gruppi metilici sono alla massima distanza tra loro. Alla configurazione all trans (quando tutti i gruppi metilici sono in conformazione trans) la catena idrocarboniosa ha la sua massima lunghezza, in quanto la molecola è completamente distesa, mentre la presenza della conformazione gauche causa un piegamento della molecola. Allo stato Lβ le catene alifatiche dei fosfolipidi sono in conformazione all trans, mentre con l'aumento della temperatura l'eccitazione termica delle catene favorisce l'isomerizzazione trans-gauche. Poiché la percentuale delle conformazioni gauche aumenta con l'aumentare della temperatura, alle alte temperature le catene idrocarboniose dei fosfolipidi sono più corte. I principali fattori che determinano la fluidità della membrana cellulare sono, oltre alla temperatura: 1. lunghezza degli acidi grassi; 2. grado di insaturazione degli acidi grassi delle code dei fosfolipidi; 3. caratteristiche della testa polare; 4. concentrazione del colesterolo nella membrana.
  21. 21. ~ 20 ~    Nei fosfogliceridi si trovano due tipi di acidi grassi: quelli saturi, in cui tutti i legami che gli atomi di carbonio possono formare sono saturati con atomi di idrogeno, e quelli insaturi, nei quali si formano doppi legami tra gli atomi di carbonio. La fluidità del doppio strato lipidico è in parte dovuta alla abbondanza relativa degli acidi grassi insaturi; in genere l'acido grasso in posizione 2 dei fosfogliceridi è insaturo, tuttavia il grado di insaturazione varia a seconda della specie lipidica, essendo la PE e la PS (prevalenti nel monostrato interno della membrana) più insature rispetto agli altri fosfolipidi, in primo luogo rispetto alla SM, che presenta circa il 70% di acidi grassi saturi. La presenza di catene insature provoca un maggiore disordine nell'allineamento delle catene, rendendo più fluida la membrana, mentre le catene sature con il loro allineamento più compatto favoriscono la formazione di un reticolo rigido. Infatti, i doppi legami con configurazione cis (che costituiscono la configurazione di quasi tutti gli acidi grassi insaturi naturali) causano un inginocchiamento della catena idrocarboniosa, per cui si riduce la lunghezza dei segmenti paralleli che interagiscono con le molecole vicine, ottenendo lo stesso effetto di un accorciamento della catena; il massimo effetto si ha quando il doppio legame occupa la posizione intermedia tra la fine della catena ed il glicerolo: allontanandosi il doppio legame dalla posizione intermedia, la lunghezza del segmento parallelo aumenta progressivamente e diventano maggiori le interazioni con le catene vicine. Al contrario, i doppi legami in conformazione trans hanno un effetto di gran lunga inferiore sulla fluidità di membrana, in quanto la catena idrocarboniosa mantiene quasi la stessa conformazione delle catene sature. Un altro fattore che influisce sulla fluidità della membrana cellulare è il volume occupato dalla testa polare dei fosfolipidi, che è dipendente dal suo grado di idrofilia. Il volume occupato dalla testa idratata rispetto all'area occupata dalle due catene idrocarboniose influenza lo spazio a disposizione per il movimento delle catene idrocarboniose e quindi la compattezza del loro allineamento. Per esempio, le teste della PE occupano poco spazio per la formazione di legami idrogeno tra i gruppi –NH e i gruppi -PO-4, mentre le teste di PC, prive di gruppi donatori, interagiscono attraverso le molecole di acqua legate, cosicché l'area occupata da ciascuna testa misura 47-54Å, molto di più dell'area di sezione occupata dalle due catene idrocarboniose. Ciò determina una minore vicinanza delle
  22. 22. ~ 21 ~    catene idrocarboniose, che possono così formare un minor numero di legami fra loro. Di conseguenza, gli acidi grassi della PC hanno una maggior libertà di movimento, per cui la fluidità della membrana risulta aumentata. La libertà di movimento della catena idrocarboniosa è espressa dal parametro S o parametro di ordine di orientamento, che è funzione degli angoli tra la perpendicolare alla membrana e gli assi x,y,z del sistema cartesiano relativo al gruppo CH2 in esame, in modo che S = 1 significa ordine e S = 0 disordine. Marcando con deuterio gli atomi di C in posizioni sequenziali lungo la catena idrocarboniosa, le tecniche di risonanza hanno dimostrato che la massima mobilità si verifica alla estremità delle code idrocarboniose e corrisponde al centro del doppio strato, mentre la minore mobilità si registra in prossimità della testa polare. La natura della testa polare influenza l'ordine della catena idrocarboniosa prossimale, cosicché la mobilità è minore per gli etilenamminofosfolipidi rispetto ai colinofosfolidi. L'ordine della catena è influenzato anche dalla presenza di colesterolo, dal grado di saturazione della catena e naturalmente dalla temperatura. Effetti del colesterolo sulla fluidità di membrana Sebbene il colesterolo [26] sia troppo idrofobico per formare, in dispersione pura, lamine bimolecolari, tuttavia esso concorre alla struttura della membrana cellulare intercalandosi tra le molecole di fosfolipidi. Il nucleo steroideo del colesterolo ha una struttura planare relativamente rigida, che viene in contatto con i gruppi CH2 prossimali (C1-C10) delle catene alifatiche dei fosfolipidi, mentre il suo gruppo ossidrilico in posizione 3 è in contatto con l'ambiente acquoso extracellulare, posizionandosi nei pressi della testa polare dei fosfolipidi, nelle immediate vicinanze del gruppo carbossilico esterificato degli acidi grassi. Per questa sua posizione, il colesterolo riduce la libertà di movimento del tratto prossimale (più vicino al glicerolo) delle catene degli acidi grassi, con scarso effetto sul tratto distale, che occupa il centro della membrana cellulare. Gli studi di risonanza hanno, infatti, dimostrato che il colesterolo aumenta l'ordine del tratto prossimale delle catene alifatiche, diminuendo l'isomerizzazione trans-gauche e gli inginocchiamenti transitori delle catene stesse. Quindi, a causa della rigidità della sua struttura, l'effetto del colesterolo sui fosfolipidi, a temperature al di sopra della Tm, è quello di
  23. 23. ~ 22 ~    aumentare l'ordine del tratto prossimale delle catene degli acidi grassi, mentre l'effetto sul tratto distale, al centro del doppio strato lipidico della membrana, è scarso. Al contrario, a temperature inferiori alla Tm, l'effetto del colesterolo è quello di diminuire l'ordine delle catene alifatiche degli acidi grassi e di ostacolarne la cristallizzazione, in quanto interferisce con l'interazione CH2- CH2 tra le catene idrocarboniose dei fosfolipidi. A causa del maggior contenuto di sfingolipidi e di colesterolo, i raft presentano un minor grado di fluidità rispetto alle restanti regioni della membrana plasmatica [27]. Proprio il maggior ordine delle catene lipidiche nei raft, porta alla separazione di questi microdomini dalla restante membrana allo stato liquido-cristallino Lα. Figura 3: Modello di una membrana lipidica che presenta organizzazioni in microdomini (rafts). La nuova fase che si forma per l'effetto del colesterolo sugli altri lipidi è stata denominata da Zuckermann (1993) liquido-ordinata (lo) ed è intermedia tra la fase cristallina e quella liquido-cristallina [28]. In questa fase le catene idrocarboniose sono distese e strettamente impaccate, come nella fase cristallina, ma conservano un alto grado di mobilità laterale. Nelle miscele binarie di colesterolo con un fosfolipide saturo (che quindi ha una elevata Tm), al di sopra della Tm si separa una fase lo da una fase liquido-cristallina, mentre al di sotto della Tm la fase lo si separa dalla fase cristallina. Poiché gli
  24. 24. ~ 23 ~    sfingolipidi hanno una maggiore saturazione e una più elevata Tm, rispetto ai fosfogliceridi, anche il maggior contenuto in sfingolipidi favorisce la separazione di domini lo e quindi la formazione dei raft. In conclusione, è lo stretto impaccamento delle catene idrocarboniose la caratteristica chiave della esistenza dei raft [27]. Data l'asimmetria della membrana, gli sfingolipidi si localizzano per la maggior parte nel foglietto esterno del doppio strato, per cui in esso i raft sono probabilmente più abbondanti. La formazione di raft nel foglietto interno è favorita dai fosfolipidi contenenti etanolammina (PE e plasmeniletanolammina) che, grazie alla piccola testa polare, hanno un'influenza favorevole sull'impaccamento delle code idrocarboniose [29]. Va sottolineato che la separazione di fase che occorre nei raft favorisce la partizione di proteine provviste di ancore lipidiche sature o che comunque abbia preferenza per gli ambienti lo. Per questo motivo i raft contengono proteine specifiche. Un'altra conseguenza dell'effetto del colesterolo sugli acidi grassi dei fosfolipidi è l'aumento di spessore delle membrane dovuto alla diminuzione delle isomerizzazioni trans-gauche e, quindi, alla tendenza del tratto prossimale delle catene alifatiche ad assumere di preferenza la configurazione trans, anche se non si manifesta mai la configurazione all trans tipica dello stato cristallino. Per concentrazioni di colesterolo superiori al 25% la lunghezza delle catene si riduce a causa dell'impaccamento delle catene dei fosfolipidi del foglietto opposto, che sono disposti di fronte alle molecole del colesterolo. Queste coppie opposte colesterolo-fosfolipidi sono più corte delle coppie opposte fosfolipidi-fosfolipidi. Permeabilità della membrana cellulare La membrana plasmatica è una barriera selettivamente permeabile tra il citoplasma e l'ambiente extracellulare: questa caratteristica è conseguenza della composizione lipidica e proteica. Il doppio strato fosfolipidico permette il libero passaggio di acqua, gas (O2, CO2) e di piccole molecole liposolubili (prive di carica) come ammoniaca, urea, etanolo e glicerolo, mentre specifiche proteine di trasporto assicurano il passaggio di ioni e molecole idrosolubili (elettricamente cariche).
  25. 25. ~ 24 ~    Il passaggio attraverso la componente lipidica della membrana avviene per semplice diffusione passiva (osmosi), secondo il gradiente di concentrazione tra i compartimenti intra- ed extracellulare e senza consumo di energia (ATP). Il movimento delle molecole è diretto dal compartimento a più alta concentrazione a quello a concentrazione più bassa ed è influenzato dalle dimensioni e dalla lipofilia della molecola. Ad esempio, la dietilurea, che è 50 volte più idrofobica dell'urea, diffonde attraverso la membrana cellulare 50 volte più velocemente di questa, nonostante le maggiori dimensioni. Secondo la teoria del mobile kink, il passaggio delle molecole attraverso il doppio strato lipidico avverrebbe attraverso gli spazi tra le catene degli acidi grassi dei fosfolipidi. La formazione di questi spazi è favorita dalla mobilità, dalla isomerizzazione trans-gauche e dalla presenza di insaturazioni, che causano una piegatura o inginocchiamento (kink) dell'acido grasso. Di conseguenza la massima resistenza alla diffusione delle molecole lipofile corrisponde al segmento prossimale delle catene degli acidi grassi, che presenta una minore rigidità, mentre la resistenza minore corrisponde al segmento terminale delle catene che, al contrario, manifesta la massima mobilità. La maggioranza delle molecole attraversa la membrana plasmatica con l'aiuto di proteine di trasporto. Oltre alle molecole idrosolubili, anche alcune molecole liposolubili, come l'urea, si avvalgono anche del trasporto mediato dalle proteine, con lo scopo di potenziarne il passaggio, qualora siano presenti particolari necessità funzionali, come si verifica nei tubuli renali. Si conoscono diversi tipi di trasporto mediato da proteine: trasporto passivo, che avviene secondo gradiente e perciò senza dispendio di energia, e trasporto attivo, che avviene contro gradiente e perciò con dispendio di energia. Si distinguono inoltre uniporto, simporto e antiporto. Nell'uniporto si ha il trasporto di un'unica specie di soluto. Nel simporto e nell'antiporto si ha il trasporto accoppiato di due diverse specie di soluti: nel simporto il trasporto dei due soluti avviene nella stessa direzione, mentre nell'antiporto avviene in direzione opposta [30]. Nel trasporto passivo il passaggio di una molecola idrosolubile (uniporto) avviene per diffusione secondo il gradiente di concentrazione e, nel caso di molecole elettricamente cariche, anche secondo il gradiente elettrico.
  26. 26. ~ 25 ~    Tuttavia, a differenza di quanto accade nella diffusione passiva delle molecole liposolubili, in questo caso la diffusione è facilitata dall'intervento di proteine. Due classi di proteine sono responsabili del trasporto passivo, i carriers e i canali. I carriers mediano il trasporto di glucidi, aminoacidi e nucleosidi. Una volta legato il soluto nel compartimento ad alta concentrazione, il carriers va incontro ad un cambiamento conformazionale che permette il trasferimento del soluto nel compartimento a bassa concentrazione. Nel caso dei canali, le proteine formano dei pori nella membrana plasmatica, che consentono la diffusione di ioni o di piccole molecole idrosolubili di idoneo peso molecolare e carica elettrica. Fanno parte dei canali le acquaporine, che favoriscono il passaggio di molecole di acqua. L’apertura dei canali può essere regolata da recettori (canali ROC o Receptor Operated Channels), da secondi messaggeri (canali SMOC o Second Messenger Operated Channels) o dal potenziale elettrico della membrana (canali VOC o Voltage Operated Channels), cosicché il passaggio può essere finemente modulato. Ne è un chiaro esempio la complessa famiglia dei canali del calcio, la cui complessità è in relazione con il ruolo determinante che il calcio intracellulare ha nel controllo di un'ampia serie di funzioni cellulari. I canali delle gap junctions permettono il passaggio di molecole da una cellula all'altra. Nel trasporto attivo le proteine trasportano i soluti contro il gradiente elettrochimico, utilizzando l'energia ottenuta dall'idrolisi dell'ATP, per cui queste proteine sono dotate di attività enzimatica (ATPasi). Le pompe trasportano ioni, mentre i trasportatori ABC (ATP- binding cassettes) trasportano un ampia gamma di molecole, compresi glucidi, aminoacidi e ioni. Il legame dell'ATP alla proteina di trasporto permette il cambiamento conformazionale necessario al trasferimento del soluto. Nel trasporto attivo secondario, l'energia necessaria al trasporto di un soluto contro il suo gradiente di concentrazione non è fornita direttamente dall'ATP, ma dall'esistenza di un gradiente elettrochimico del Na+ (o di H+ ) prodotto dalla rispettiva pompa ionica. Il trasporto attivo secondario è quindi indirettamente accoppiato ad un sistema di trasporto attivo primario che genera il gradiente elettrochimico. Nel trasporto attivo secondario si ha, quindi, il trasporto accoppiato di due diverse specie di soluti: il Na+ (o H+ ) è trasportato passivamente dall'ambiente a concentrazione elevata al compartimento a bassa concentrazione, mentre l'altro soluto è trasportato, sempre passivamente,
  27. 27. ~ 26 ~    contro il gradiente di concentrazione dal compartimento a bassa concentrazione verso quello ad alta concentrazione. Nel simporto il trasporto dei due soluti avviene nella stessa direzione, mentre nell'antiporto avviene in direzione opposta. Anche in questo caso il trasferimento dei soluti avviene grazie al cambiamento conformazionale della proteina trasportatrice, che è indotto dal legame dei soluti stessi. Composizione e struttura della membrana citoplasmatica batterica ed archeobatterica Archaea, batteri ed eucarioti mostrano notevoli differenze nella composizione della membrana plasmatica. In alcuni procarioti la membrana citoplasmatica contiene molecole complesse dette Hopanoidi, derivati pentaciclici saturi dell’acido mevalonico. A causa della loro somiglianza strutturale con gli steroli della membrana eucariotica, si ritiene che nei procarioti essi svolgano una funzione analoga, cioè di rafforzamento della membrana citoplasmatica. Una delle principali differenze nella composizione chimica delle membrane eucariotiche e procariotiche risiede nel fatto che le prime posseggono steroli, assenti nelle seconde. La rigidità della membrana degli eucarioti può essere considerata una caratteristica di grande importanza, poiché le cellule eucariotiche sono molto più grandi di quelle procariotiche e le loro membrane devono quindi sostenere stress fisici maggiori. Sebbene vari archaea, e perfino alcuni eucarioti, possano assumere colorazione Gram-positiva (G+) o Gram-negativa (G-), la parete cellulare dei batteri è chimicamente unica e di immensa rilevanza pratica.
  28. 28. ~ 27 ~    Figura 4: Parete dei batteri Gram-positivi.     Figura 5: Parete dei batteri Gram-negativi. I batteri possono essere suddivisi in due gruppi principali mediante una particolare tecnica di colorazione: alla base della diversità di risposta alla
  29. 29. ~ 28 ~    colorazione di Gram vi sono differenze di struttura della parete cellulare. La parete cellulare delle cellule G- è una struttura pluristratificata e piuttosto complessa, mentre la parete cellulare dei G+ è costituita essenzialmente da un unico tipo di molecola ed è in genere più spessa. Lo strato rigido dei batteri G+ e G- ha una composizione chimica molto simile. Questo strato, chiamato peptidoglicano (o mureina) è una sottile lamina costituita da due derivati polisaccaridici, l’N-acetilglucosamina e l’acido N-acetilmuramico, e da un piccolo gruppo di aminoacidi rappresentato da: D-alanina, acido D- glutammico, (o, in alternativa, acido diaminopimelico, DAP), L-alanina e lisina. Questi costituenti sono assemblati in modo da formare una unità di ripetizione, il glican-tetrapeptide. Nei batteri G- i legami sono rappresentati generalmente da un legame peptidico diretto tra il gruppo amminico dell’acido diaminopimelico e il gruppo carbossilico della D-alanina terminale. Nei batteri G+ i legami crociati sono costituiti da un ponte peptidico: il tipo e il numero di legami crociati varia in modo caratteristico da un organismo all’altro. Figura 6: Parete cellulare dei batteri G+ e G-. I due schemi mostrano la rete bidimensionale del sacco peptidoglicanico che circonda (A) una cellula G+ (B) una cellula G-. Questo strato rappresenta la componente strutturale principale della parete cellulare batterica. L’N-acetilglucosamina (NAG) e l’acido n-acetilmuramico (NAM) sono legati in modo da formare lo scheletro di aminozuccheri (glicano); le catene di glicano sono tenute insieme da ponti peptidici. I batteri G+ non hanno lo strato polisaccaridico esterno, ma sono generalmente dotati di polisaccaridi acidi associati alla parete cellulare, detti acidi teicoici. A causa della loro carica negativa, gli acidi teicoici sono in genere responsabili
  30. 30.   della car contribui L’acido N degli arch in alcune la lisina e Pur mant e di org filamento eucariote presentan rivestime imperme cellulare pseudope talosamin Gli archa fosfoglic degli euc isoprenoi Figura 7: contengon etere, form rica comple ire al passag N-acetilmur haea e degl e specie G+ e, in qualch tenendo le c ganuli citop o di DNA, s e), date le c no una co ento (parete eabilità e ch degli arch eptidoglican nuronico, m aea sono car ceridi (che r carioti e de idi. Lipidi del g no le catene mando dieter essivamente ggio di ioni ramico e il D li eucarioti. +, ma nella g he altro Gram caratteristic plasmatici r strutture di condizioni e omposizione e e membra he li differen haea è comp no, che al mentre manc ratterizzati d rappresentan ei batteri) s glicerolo deg del lato isop i o tetraeteri. ~ 29 ~ e negativa d attraverso l DAP sono d Sono prese gran parte d m-positivo, che dei proc rivestiti da rivestiment estreme in e biochimi ana cellulare nzia sia dai posta da pr posto dell' cano i D-am da una mem no l'impalc sono sostitu li Archaea. I prenoide lega . Si ritiene ch ~  della super la parete [3 del tutto ass enti in tutti i dei cocchi G vi possono carioti (asse membrane to più comp cui possono ica unica e), che con batteri che roteine, pol 'acido mura minoacidi ca mbrana citop atura fonda uiti da lipid I tipici lipidi ate al glicero he il tetraeter ficie cellula 1-33]. senti nella p i batteri Gra G+ al posto essere altri enza di un n e, presenza plesse rispet o sviluppar delle loro ferisce loro dagli eucar lisaccaridi o amico cont aratteristici d plasmatica, amentale de di contenen i del glicerol olo per mezz e attraversi l are e posso parete cellul am-negativi o del DAP v i aminoacid nucleo distin a di un un tto alla cell si, gli archa o strutture o una notev rioti. La par o molecole tengono ac dei batteri. in cui i diac elle membra nti glicerolo lo degli arch zo di un lega a membrana ono lare i ed vi è di. nto nico lula aea di vole rete e di ido cil- ane o e haea ame .
  31. 31.   A differ esterei a etereo a d Figura 8: di batteri l’1,2-sn-gl catena con idrofilico. I più fre bifitanolo eteri o membran interno, s di-glicero molecole tetra-eter costituite rappresen idrofila rappresen tetra-eter si mantie La magg residui g all'altra e (di solit enza dei dia due acidi g due isopren Stereochimic e archaea h licerolo; i lip n legame eter equenti iso o (C40). Si di-fitanil-gl ne a doppio simili a que ol-tetraeteri e degli isopr ri formano, e da un un ntata dalle a contatto ntata dalle ri sono costi ene simile a gioranza de glucidici le estremità un to l'estremi acil-fosfogl grassi, negl noidi. ca dei lipidi d hanno una st pidi degli ar re, R2= acido oprenoidi n riconoscon licerol-diete o strato, co elle degli al i, (caldarch renoidi sono caso unico nico fogliett catene idro o con gli molecole d ituiti da bifi quello dell ei glicerol-t egati al gli n gruppo fos ità citoplas ~ 30 ~ liceridi, nei li archeobat del glicerolo tereochimica rchaea conten grasso con le egli archeo no due tipi eri (detti a on un foglie ltri due regn heolipidi) in o legate ad u o tra gli es to, compos ocarboniose ambienti di glicerolo. fitanolo, lo s e membran tetra-eteri p icerolo (di sfato esterif smatica). D ~  quali il glic tteri il glice in batteri e a differente. I ngono il 2,3- egame estere, obatteri son fondamenta archeolipidi etto lipidico ni; i glicero n cui entra una moleco sseri vivent to da una e degli isop acquosi i Poiché gli spessore del e a doppio s possiede a u solito l'es ficato a un'a Due archeo cerolo è uni erolo è unit archaea. I lip I lipidi batte -sn-glicerolo. , R3 = aminoa no il fitano ali di lipidi i), che for o esterno e l-tetra-eteri ambe le e ola di glicer ti, membran parte idrof prenoidi, e intra- ed isoprenoid lle membra strato. una estrem tremità ext altra moleco obatteri (M ito con lega to con lega pidi del glicer erici contengo . R1= lato d acido o zucch olo (C20) e : i glicerol- rmano tipic d un foglie o di-bifitan stremità de olo. I glicer ne monostr fobica inter da una pa extracellula di dei glicer ane monostr mità uno o p tracellulare) ola di glicer Methanococc ami ame rolo ono ella hero e il -di- che etto nil- elle rol- rato rna, arte are, rol- rato più ) e olo cus
  32. 32. ~ 31 ~    jannaschii e Methanococcus igneus) contengono nella loro membrana archeoli macrociclici o glicerol-di-eteri ciclici, in cui un'unica catena isoprenoide (C40) è eterificata con entrambe le estremità al glicerolo, formando una struttura ciclica. La maggioranza degli archaea che vivono in condizioni di stress ambientale moderato hanno membrane cellulari formate da glicerol-di-eteri (metanogeni e alofili), mentre quelli che sono esposti a condizioni più estreme presentano di preferenza glicerol-tetra-eteri (termofili e acidofili). Negli archeobatteri termofili, una o più subunità isoprenoidi dei glicerol-tetra- eteri possono formare strutture cicliche sature a cinque atomi di carbonio (ciclopentano). A differenza dei diacil-fosfogliceridi, che alle alte temperature divengono notevolmente permeabili all'acqua e ai protoni, i lipidi degli archaea formano un’impalcatura rigida che mantiene una notevole impermeabilità anche alle alte temperature. L'aumento di permeabilità con la temperatura è causato dalla maggiore mobilità delle catene idrocarboniose, in particolare dalla maggior frequenza delle isomerizzazioni trans-gauche, che provocano momentanee soluzioni di continuità nella membrana cellulare, sufficienti per il passaggio di piccole molecole, come acqua e ioni. La rigidità della membrana archaeale è dovuta a un minor grado di movimento delle catene idrocarboniose dei lipidi, che è conseguenza della saturazione delle catene isoprenoidi e della presenza di legami etere, invece che estere, e dell’eventuale formazione di anelli ciclopentanici. Dal momento che la massima mobilità delle catene idrocarboniose si ha al centro dei doppi strati lipidici (ovvero in corrispondenza delle estremità terminali delle catene idrocarboniose), le membrane costituite da un solo monostrato di glicerol-tetra-eteri sono in assoluto le più rigide, in quanto entrambe le estremità delle catene idrocarboniose degli isoprenoidi sono fissate al glicerolo, che ne limita i movimenti. Anche la presenza di anelli ciclopentanici, a causa del loro notevole ingombro sterico, riduce notevolmente la mobilità delle catene isoprenoidi, con un effetto simile a quello prodotto dal colesterolo nelle membrane eucariote. Per questo alcuni termofili possono controllare la fluidità della propria membrana, variando il numero degli anelli ciclopentanici da 1 a 8 nelle catene lipidiche. Per le stesse ragioni di stabilità, la membrana cellulare degli eubatteri termofili, che come gli archaea possono popolare ambienti ad alte temperature (>60 °C), quali le
  33. 33. ~ 32 ~    acque nelle vicinanze dei vulcani, contiene dialchil-di-eteri-gliceroli [34].
  34. 34. ~ 33 ~    CAPITOLO 2: I PEPTIDI ANTIMICROBICI (AMP) Origine degli AMP I peptidi antimicrobici (AMP) sono molecole largamente diffuse in natura e rappresentano il primo meccanismo di difesa [35] utilizzato da diversi organismi, tra cui i mammiferi, gli uccelli, gli anfibi, i crostacei, i pesci, gli insetti e le piante [36-38]. Gli stessi batteri producono AMP e circa 50 di loro sono stati isolati da diversi batteri G+, specialmente dagli organismi che producono acido lattico [39]. Si parlò per la prima volta dell’esistenza di tali molecole nella specie animale nel 1963 ma solo nel 1980 fu possibile identificarle. Nel 1981, Steiner ed i suoi collaboratori, descrissero la sequenza di due peptidi, più tardi chiamati Cecropine, isolati dall’Hyalophora cecropia. I primi ad individuare peptidi antimicrobici in macrofagi di coniglio furono, nel 1983, Selsted et al. mentre nel 1985 si riuscì ad isolare la prima defensina appartenente alla specie umana. Dopo la scoperta di tali sostanze, altri peptidi antimicrobici sono stati isolati da un elevato numero di organismi e ad oggi più di 800 di queste sostanze sono state identificate in una serie di organismi filogeneticamente lontani. AMP dagli insetti Dalla scoperta degli AMP inducibili nella farfalla Hyalophora cecropia sono stati identificati più di 150 peptidi simili in vari insetti [40, 41]. Questi peptidi, chiamati cecropine, sono peptidi lineari anfipatici da 3,4 kDa e mostrano attività contro i parassiti protozoi e metazoi, nonché contro batteri e funghi [2, 42, 43]. L’insetto Drosophila è servito come modello ideale per l’analisi dei meccanismi di immunità innata. Il danno settico in questo insetto induce rapidamente la produzione di peptidi (drosomicina, cecropine, diptericina, drosocina, attacina e metchnikowina) da parte dei geni per gli AMP delle cellule del tessuto adiposo. La drosomicina e la metchnikowina sono potenti antifungini mentre gli altri esibiscono proprietà antibatteriche [42]. Dal veleno della formica Pachycondyla goeldii, sono stati estratti circa 15 peptidi differenti che mostrano proprietà antibatteriche e insetticide. Questi peptidi
  35. 35. ~ 34 ~    prendono il nome di ponericidine e condividono similarità di sequenza con le cecropine, le mellitine e le dermaseptine [44]. Le defensine degli insetti sono state isolate inizialmente dalle culture cellulari del volatile Sarcophaga peregrina e dalle larve di Phormia terranovae. Da allora, un grande numero di defensine è stato caratterizzato da varie specie di insetti . La tanatina è un peptide antibatterico formato da 21 aminoacidi isolato dall’insetto Podisus. Dall’emolinfa del coleottero Acalolept luxuriosa sono stati estratti AMP chiamati acaloleptina A1, A2 e A3 con un ampio spettro d’azione[45]. Un altro gruppo di peptidi, le lycotossine sono stati isolati dal veleno del ragno Lycosa Carolinensis, hanno struttura ad elica ed esibiscono attività antimicrobica, insetticida e lievemente emolitica[46]. AMP da altri invertebrati Oltre agli insetti, altri invertebrati da vari Phyla presentano ampie risorse di peptidi antimicrobici. Le tachiplesine sono peptidi lunghi 17-18 aminoacidi isolati dagli emociti del granchio giapponese Tachypleus tridentatus. La polifemusina, un’isoforma della tachiplesina, è stata purificata dagli emociti del Limulus polyphemus, un granchio. Un altro peptide, la defensina, è stata purificata dai granuli degli emociti di T. tridentatus, una caratteristica importante di questo peptide è che la parte N-terminale della molecola mostra attività contro i batteri G+, mentre la porzione C-terminale è più attiva contro i batteri G-. L’androctonina, estratta dallo scorpione Androctonus australis è un peptide attivo su G+, G- e funghi [47]. Dall’emolinfa del gamberetto Penaeus vannamei sono stati isolati le penidine, AMP che esibiscono una forte attività contro i funghi filamentosi [48]. AMP dai vertebrati Le defensine, piccoli peptidi antimicrobici e cationici, sono stati scoperti inizialmente nei granulociti del coniglio e del maiale [49]. E’ noto che gli esseri umani possiedono 6 differenti forme di α-defensine; quattro di questi peptidi neutrofili (HNP 1-4) sono espressi dai granulociti, mentre gli altri due (HD-5 e 6) sono espressi dalle cellule intestinali. Le β-
  36. 36. ~ 35 ~    defensine presenti umane sono di quattro tipi (HBD 1-4) e vengono espresse dalle cellule epiteliali della pelle e dalle squame psoriasiche [50]. Le catelicidine, inizialmente isolate dai leucociti del maiale, vengono conservate come propeptidi inattivi nei granuli secretori dei neutrofili per essere rilasciate dopo stimolazione cellulare attraverso un processo proteolitico. Negli esseri umani, le catelicidine CAP-18 e LL-37 sono state identificate nei testicoli, nell’epitelio squamoso e in differenti popolazioni di linfociti. Le bactenecine (Bac-5 e Bac-7) isolate dai neutrofili bovini sono peptidi che esibiscono differenti attività antimicrobiche [51, 52]. Le protegrine, isolate dai neutrofili di maiale sono in grado di distruggere la membrana e conservare l’attività anche in presenza di concentrazioni fisiologiche di cloruro di sodio [53] Un’altra famiglia di peptidi è quella delle istatine, proteine ricche di istidina isolate dalla saliva umana che mostrano un’attività moderata contro C. albicans. Caratteristiche generali degli AMP I peptidi antimicrobici sono genericamente definiti AMP (antimicrobial peptides), ma anche CAP (cationic antimicrobial peptides) dal momento che si tratta prevalentemente di proteine cationiche. Sono molecole di piccole dimensioni (da 12 a 50 aminoacidi) ma con un ampio spettro di attività contro virus, batteri, funghi e protozoi patogeni [54]. Molti dei peptidi studiati derivano da scissione di molecole più grandi. Alcuni esempi sono gli istoni, le emocianine, i precursori dei neuropeptidi, le proteine ribosomiali e le RNAasi. Gli AMP derivano da prepropeptidi di circa 60-170 aminoacidi, rilasciati in forma matura da specifiche proteasi [55]. La maggior parte dei precursori contiene: − una sequenza segnale per il reticolo endoplasmatico; − una prosequenza anionica, di lunghezza variabile, che avrebbe la funzione di neutralizzare le cariche positive del peptide rendendolo inattivo; − la sequenza del peptide maturo [56]. Alcuni AMP vengono prodotti in maniera costitutiva mentre altri vengono sintetizzati in risposta all’attacco microbico [57] in tempi che sono centinaia di volte più brevi rispetto a quelli richiesti per la sintesi proteica da parte del sistema immunitario [58]. Questa immediata disponibilità di AMP riveste
  37. 37. ~ 36 ~    un’importanza cruciale nella risposta del sistema immunitario innato, rendendo gli AMP una difesa di prima linea altamente efficace negli animali. L’inizio dell’attività di sintesi degli AMP, nel corso del processo di embriogenesi, è un fenomeno decisamente precoce. Ogni peptide può adattarsi e assumere diversi ruoli nella protezione dell’ospite, a seconda del contesto specifico nel quale viene sintetizzato. Il contesto può essere uno specifico tessuto, uno specifico istante temporale nello sviluppo dell’organismo, una specifica fase evolutiva dell’infezione, la presenza di recettori, la presenza di enzimi di modificazione delle proteine o la presenza di altre molecole messaggere o effettrici (inclusi altri peptidi). Alcuni AMP possono giocare ruoli più ampi agendo anche come segnali immunomodulatori e attenuando le risposte antimicrobiche del sistema immunitario acquisito [59]. Molti peptidi mostrano una elevata omologia nel cDNA e nelle sequenze aminoacidiche interspecie e spesso anche in Phyla diversi evolutivamente [60]. Oltre ad avere un ruolo diretto nella distruzione dei patogeni, gli AMP aumentano le difese immunitarie, sono attivi nel reclutamento di neutrofili e fibroblasti, agiscono sulla degranulazione delle mast-cellule, determinano l’attivazione della fagocitosi e la diminuzione della fibrinolisi. Molti peptidi antimicrobici manifestano spesso sinergie con altri peptidi o con altri meccanismi difensivi innati. L’espressione dei CAP è stata dimostrata anche nelle cellule immunitarie circolanti di diverse specie animali. I CAP sono in grado di fornire un collegamento tra sistema immunitario specifico e aspecifico attraverso una varietà di meccanismi, inclusi la stimolazione della produzione di mediatori chimici e molecole segnale [61]. Tra tutti gli organismi multicellulari che occupano ambienti ricchi di microbi, gli invertebrati e i vertebrati inferiori evidenziano un considerevole successo nell’eliminare infezioni primarie. Questo perché possiedono potenti peptidi antimicrobici come parte attiva del loro sistema immunitario. Il principale requisito degli AMP è che sono piccole molecole sintetizzabili in poche ore e possono eliminare due o più patogeni contemporaneamente senza richiedere lo specifico riconoscimento di ognuno. In seguito allo sviluppo di ceppi batterici antibiotico-resistenti e alla ridotta disponibilità di antibiotici efficaci, è aumentata la necessità di identificare peptidi antimicrobici naturali come terapia alternativa.
  38. 38. ~ 37 ~    Diverse caratteristiche dei peptidi antimicrobici li rendono particolarmente interessanti come potenziali strumenti terapeutici: − dimostrano ampio spettro di attività contro virus, batteri, funghi e protozoi; − uccidono rapidamente (99,9% dei batteri trattati in 20 minuti) [62] e manifestano sinergie con gli antibiotici convenzionali [54]; − sono efficaci contro famiglie di batteri resistenti agli antibiotici; − non consentono la selezione di mutanti resistenti [63]. Contrariamente agli antibiotici classici, prodotti da batteri e funghi e sintetizzati mediante passaggi successivi, ciascuno catalizzato da uno specifico enzima, gli AMP sono codificati da geni e prodotti per sintesi proteica ribosomiale, dapprima in forma di precursori. Pur variando considerevolmente nella dimensione e struttura secondaria, molti di essi presentano caratteristiche comuni, quali una carica netta positiva a pH neutro e la tendenza a formare strutture anfipatiche in ambiente idrofobico. Molteplici studi sul meccanismo d'azione degli AMP hanno fornito una chiara evidenza che una tappa comune è rappresentata dalla loro interazione con la membrana batterica. AMP come fattori dell’immunità innata conservati nel corso dell’evoluzione Gli AMP sono stati a lungo considerati dagli immunologi come un retaggio dell’evoluzione caratteristico delle piante e degli animali meno evoluti [64], recentemente il loro ruolo è stato rivalutato come parte integrante delle risposte immunitarie innate, condivise tra i regni animale e vegetale, a dimostrazione della loro grande importanza nel processo evolutivo di organismi multicellulari sempre più complessi. E’ indubbio che moltissime specie non si sarebbero preservate fino ad oggi senza quei processi biologici che la Natura ha conservato con meccanismi e modalità molto simili, a dispetto dell’enorme variabilità e diversità esistenti fra i vari Phyla. Gli AMP hanno un’importanza doppia: proteggono circa l’80% delle specie animali e tutte le piante, ma giocano un ruolo importante anche nell’immunità degli animali superiori, fornendo una sorta di prima linea di
  39. 39. ~ 38 ~    difesa che stimola e coopera attivamente con le risposte immunitarie adattative [64]. L’azione antimicrobica dei peptidi naturali è caratterizzata da alcuni fattori: − assenza di specificità, in quanto sono attivi contro un largo spettro di microrganismi; − assenza di memoria; − velocità di risposta, dovuta all’immediata disponibilità dei peptidi immagazzinati e alla loro rapida sintesi e diffusione; − assenza di un meccanismo di riconoscimento del "self": l’autodistruzione è evitata dalla compartimentalizzazione cellulare dei peptidi in granuli e/o sotto forma di propeptidi; − basso costo energetico, in quanto la loro sintesi necessita di una quantità di energia inferiore a quella richiesta all’animale per la complessa attivazione dell’immunità acquisita [65]. Meccanismi d’azione degli AMP Tutti gli AMP sono in grado di interagire con la membrana e mentre l’azione antimicrobica di alcuni sembra coinvolgere l’attacco di target intracellulari, nella maggior parte dei casi il meccanismo d’azione principale di questi peptidi è rappresentato dall’attacco diretto alla membrana microbica [2, 66]. Sono stati proposti numerosi modelli d’azione dei peptidi antimicrobici si pensa che l’uccisione del batterio comprenda una o più delle seguenti fasi: 1. depolarizzazione della membrana; 2. inserimento del peptide nella membrana; 3. formazione di pori con conseguente perdita del contenuto intracellulare; 4. danni specifici ad organuli intracellulari fondamentali; 5. aggregazione di diverse eliche per formare un poro. Tali effetti generalmente sono mediati dall’interazione non-specifica degli AMP con la matrice lipidica della membrana piuttosto che con le proteine di membrana [67, 68]. Per la lisi di un batterio è sufficiente una quantità micromolare di peptidi antimicrobici, i quali formano un monostrato attorno
  40. 40. ~ 39 ~    alla cellula bersaglio, quattro o più peptidi possono aggregarsi e formare pori da 5-40 Å di diametro, grandi abbastanza per uccidere la cellula bersaglio. Le membrane batteriche sono ricche di fosfolipidi anionici, come fosfoserina (PS) e fosfatidilglicerolo (PG): ciò determina un’interazione elettrostatica del peptide carico positivamente con la membrana stessa, che è alla base del successivo effetto di perturbazione del doppio strato. La differente composizione delle membrane è alla base della selettività che alcuni di questi peptidi hanno per le cellule batteriche. Le cellule eucariotiche, come ad esempio gli ematociti, sono caratterizzate da un alto contenuto di fosfolipidi zwitterionici, come la fosfocolina (PC), la sfingomielina (SM) e la fosfoetanolammina (PE). Esse sono inoltre ricche di colesterolo, assente nei batteri, che sembra inibire l’azione di tali peptidi conferendo una certa resistenza alle membrane. Un altro fattore importante per la selettività è il valore del potenziale di membrana: un potenziale più negativo all’interno della cellula, tipico delle cellule batteriche (100-150 mV), facilita l’interazione del peptide con lo strato lipidico [69]. Nel caso di batteri G- è stato visto che inizialmente il peptide interagisce con le molecole polianioniche di lipopolisaccaride (LPS) della membrana esterna per poi permeabilizzare quest’ultima o essere captato all’interno del batterio stesso. Nel caso dei batteri G+, invece, il peptide è probabilmente attratto dagli acidi teicoici e teicuronici e da altri gruppi anionici che si trovano esternamente allo strato di peptidoglicano. Sono stati proposti due meccanismi principali per spiegare l’effetto conseguente all’interazione dei peptidi con la membrana citoplasmatica: − un effetto "detergente", in cui la struttura anfipatica di tali molecole interagirebbe con il doppio strato lipidico, distruggendone l’organizzazione e determinando la fuoriuscita dei componenti citoplasmatici; − la formazione di canali, dovuta all’aggregazione dei monomeri di peptide nel doppio strato lipidico. Il primo meccanismo è supportato da evidenze di permeabilizzazione del doppio strato, dall’alta stechiometria del peptide richiesta per ottenere la lisi, in contrasto con lo scarso numero di molecole richiesto per la formazione di
  41. 41. ~ 40 ~    canali, e da studi strutturali che mostrano come alcuni peptidi adottino prevalentemente una posizione parallela al piano della membrana. La formazione di un "poro" è stata invece supposta dalla presenza di effetti cooperativi tra peptidi e dal posizionamento perpendicolare del peptide nella membrana. In alcuni casi è stato proposto un processo in cui il peptide, dopo aver inizialmente ricoperto la membrana con uno strato orientato parallelamente alla superficie, si inserirebbe perpendicolarmente all’interno, una volta raggiunta una elevata concentrazione [70]. La formazione dei pori non dipende dal riconoscimento di molecole chirali, in quanto è ben noto che tutti gli enantiomeri D degli AMP sono ugualmente attivi. Vi sono comunque delle eccezioni al meccanismo generale d’azione sulla membrana: la buforina II, isolata dal Bufo bufo, è in grado di penetrare nella cellula e di inibire le funzioni cellulari legandosi al DNA e all’RNA [71]. È interessante notare che i peptidi antimicrobici possiedono meccanismi d’azione differenti rispetto ad alcuni antibiotici, pertanto possono essere utilizzati efficacemente contro quei batteri che hanno sviluppato antibiotico- resistenza. Classificazione degli AMP Il primo criterio di classificazione adottato per gli AMP si basava sulla loro origine. L’esistenza di peptidi antimicrobici, come le cecropine, presenti anche in specie filogeneticamente lontane, hanno reso questo tipo di classificazione inadeguato. Per questo motivo oggi si preferisce un approccio classificativo basato sulle caratteristiche chimiche e biochimiche dei peptidi [2]. La risonanza magnetica nucleare (NMR) è risultata la tecnica più utile per lo studio dettagliato delle strutture della maggior parte dei peptidi antimicrobici conosciuti. L’analisi della struttura tridimensionale degli AMP ha portato a una migliore comprensione della loro funzione. Essendo la maggior parte di questi peptidi piccoli in lunghezza, le loro strutture tridimensionali possono essere ottenute utilizzando metodi di NMR bidimensionali [72]. Sulla base delle strutture NMR dei peptidi conosciuti e delle analisi di sequenza, gli AMP vengono classificati in cinque gruppi: 1. Peptidi con struttura secondaria ad α-elica.
  42. 42. ~ 41 ~    2. Peptidi ricchi di cisteine. 3. Peptidi con struttura a foglietto-β antiparallelo, con più ponti disolfuro, e con struttura a loop, contenente un solo ponte disolfuro. 4. Peptidi con un’alta percentuale di aminoacidi specifici. 5. Peptidi con aminoacidi rari modificati. AMP ad α-elica La maggior parte del lavoro biochimico e strutturale si è focalizzato sulle cecropine, che sono state le prime ad essere identificate e caratterizzate. Tutte le cecropine tendono a formare eliche in alcuni cosolventi organici come il trifluoroetanolo. AMP ricchi di cisteina I peptidi neutrofili umani apparteneti alla classe delle α-defensine sono stati i primi peptidi ricchi di cisteina isolati dai granuli umani [73]. La struttura NMR di un’α-defensina mostra la presenza di tre foglietti β antiparalleli con un α- elica tra i primi due foglietti. AMP a foglietto β Alcuni AMP formano una struttura a singola β-lamina e sono lunghi approssimativamente 20 residui, con uno o due ponti disolfuro. Le tachiplesine e la polifemusina II, possiedono entrambi un motivo a β-lamina stabilizzato da due ponti disolfuro. Studi NMR sulla tanatina isolata dall’insetto P. maculiventris hanno mostrato risultati simili a quelli della tachiplesina, incluso il foglietto β antiparallelo mantenuto da un singolo ponte disolfuro. La lactoferricina B, un derivato proteolitico della lactoferrina formato da 25 aminoacidi, in soluzione adotta una struttura a foglietto β stabilizzata da un singolo ponte disolfuro, come mostrato da studi NMR. AMP ricchi in aminoacidi specifici Alcuni AMP sono composti da un elevato numero di aminoacidi specifici. Le conformazioni strutturali di questi peptidi sono differenti da quelle dei peptidi ad α-elica o a β-lamina. L’istatina, un peptide isolato dalla saliva umana, è ricca di residui di istidina ed è attiva contro C. albicans. Mentre le catelicidine sono peptidi ricchi di prolina e hanno strutture irregolari, le indolicidine e la
  43. 43. ~ 42 ~    tritripticina sono ricche di triptofano. Le bactenecine Bac-5 e Bac-7, come le catelicidine, sono ricche di prolina, mentre il peptide PR-39 è ricco di residui di arginina. AMP con aminoacidi rari modificati Alcuni peptidi sono insoliti in quanto composti da aminoacidi rari modificati. I migliori esempi di questi peptidi sono rappresentati da quelli prodotti dai batteri stessi. La risina, un antibiotico, è uno di questi peptidi prodotto da Lactococcus lactis ed è composto da aminoacidi rari come la lantionina, la 3- metillantionina, la deidroalanina e la deidrobutirrina. Un altro peptide, la leucocita A, un AMP di 37 residui isolato da Leunonostoc gelidum, ha mostrato di essere in grado di formare una conformazione anfifilica adatta all’interazione con le membrane [74]. Questi peptidi vanno incontro a modifiche post-traslazionali che danno luogo a conformazioni mai viste nelle altre classi di peptidi antimicrobici. Interazione degli α-AMP con la membrana plasmatica L’arrangiamento strutturale anfipatico della maggior parte degli AMP gioca un ruolo importante nel meccanismo d’azione sulla membrana plasmatica bersaglio. Sono stati proposti numerosi modelli di attività, che riguardano in particolare la permeabilizzazione e la lisi delle membrane batteriche da parte degli α-AMP [5, 68, 75]. I peptidi antibatterici, generalmente molto basici, riconoscono i fosfolipidi acidi esposti sulla superficie della membrana batterica [76]. Nel caso dei microbi, i lipidi anionici sono presenti sulla superficie esterna della membrana mentre nelle cellule dei mammiferi i lipidi anionici sono presenti sul lato citoplasmatico della membrana. Questa caratteristica potrebbe influire sulla loro attività preferenziale contro i batteri ma non contro le cellule dei mammiferi. Studi sulla magainina hanno dimostrato che la dispersione liposomiale indotta dal peptide è relazionata alla natura del lipide anionico [77]. E’ stato dimostrato che nei liposomi di fosfatidilglicerolo, presenti in abbondanza nelle membrane cellulari batteriche, il peptide induce un’effettiva dispersione. Al contrario, nei liposomi di PS il peptide si mostra meno efficace nell’induzione della dispersione [5]. La mellitina, la paradaxina, le
  44. 44. ~ 43 ~    dermaseptine e le cecropine sono litiche sia per le cellule batteriche che per gli eritrociti dei mammiferi. Sono stati pubblicati diversi studi sulla struttura e sulla funzione degli AMP [78-80]. Proprietà biofisiche come la struttura secondaria, la carica totale e l’idrofobicità influenzano l’interazione degli AMP con la membrana. Nel momento in cui attaccano i batteri G-, gli AMP cationici individuano come target iniziale la carica negativa dei lipopolisaccaridi (LPS) della membrana esterna portando, attraverso questa interazione, all’espansione della membrana e alla dislocazione degli ioni Ca2+ e Mg2+ che normalmente ne stabilizzano la struttura. Nel caso dei batteri G+, invece, gli AMP hanno come target la carica negativa degli acidi teicoici, teicuronici e i gruppi carbossilici degli aminoacidi presenti nella superificie esterna dello strato di peptidoglicani. Per entrambe queste classi batteriche, le interazioni iniziali con la superficie portano al passaggio degli AMP attraverso lo strato di peptidoglicano e al legame con la superficie esterna anionica della membrana citoplasmatica. Gli α-AMP possono adottare strutture ad α-elica in seguito all’interazione con la superficie esterna sia dei batteri G+ che G-, e al legame alla membrana citoplasmatica. Per spiegare l’azione letale degli α-AMP sulle membrane microbiche sono stati proposti tre modelli principali. Secondo il modello del “poro a botte” (BSPM), gli α-AMP stabiliscono inizialmente delle interazioni elettrostatiche con la regione delle teste lipidiche della membrana microbica con un’orientazione parallela alla superficie della membrana. Il successivo ri- allineamento spontaneo di questi peptidi porta ad un orientamento perpendicolare alla superficie della membrana, che a sua volta porta alla creazione di un poro transmembrana. Quest’ultimo è costruito in modo tale che la superficie idrofobica dei peptidi ad α-elica interagisca col centro lipidico della membrana, mentre la superficie idrofilica si affaccia verso l’interno formando così un poro acquoso [5, 75]. Il modello del “poro toroidale” (TPM) assume che gli α-AMP utilizzino un legame iniziale alla membrana e un orientamento simile a quello proposto da BSPM, ma secondo questo modello l’aggregazione degli α-AMP sulla superficie della membrana impone a quest’ultima una curvatura positiva, incrementando la distanza tra le teste lipidiche della membrana. Quando si
  45. 45. ~ 44 ~    raggiunge una concentrazione critica, gli α-AMP aggregati si ri-allineano, facendo in modo che la superficie della membrana si incavi verso l’interno e formi un poro toroidale. Figura 9: Rappresentazione schematica dei pori formati dagli α-AMP. La figura A mostra un poro “a botte”: le superfici idrofobiche degli α-AMP (in nero) sono in contatto diretto col centro lipidico della membrana, mentre quelle idrofiliche (in bianco) sono rivolte verso l’interno producendo un poro acquoso. La figura B mostra un poro “toroidale”: le regioni delle teste lipidiche delle superfici opposte della membrana sono continue a formare un poro acquoso, che viene tenuto allineato da gruppi di teste lipidiche polari e di α-AMP strettamente associati. In contrasto al modello BSPM, il TPM richiede che l’α-AMP resti in stretta associazione con i gruppi polari delle teste lipidiche. Si ipotizza che i pori TPM siano dei pori di transizione e che dopo la disgregazione gli α-AMP si spostino nella superficie interna della membrana, il che potrebbe spiegare la capacità di alcuni di loro di attaccare target intracellulari [68, 75]. Secondo il meccanismo “a tappeto”, molto simile al TPM, gli α-AMP formano un “tappeto” sulla superficie della membrana che rappresenta il loro target e, una volta accumulati in maniera sufficiente, creano numerosi pori toroidali che si uniscono formando “isole” nella membrana, portando in ultimo alla micellizzazione della membrana e alla lisi della cellula microbica [5, 75]. Figura 10: Il meccanismo “a tappeto” dell’azione antimicrobica degli α-AMP. La figura mostra la formazione di un tappeto sulla superficie della membrana microbica da parte
  46. 46. ~ 45 ~    degli α-AMP. Una volta raggiunta una concentrazione critica, la membrana diventa satura di peptidi e questo porta alla formazione di numerosi pori toroidali, alla micellizzazione e in ultimo alla lisi della cellula. Più recentemente, per spiegare l’azione antimicrobica degli AMP, è stato proposto un nuovo modello che incorpora aspetti di alcuni meccanismi sopra descritti. Attribuito a Shai, Huang e Matsazuki [2], il modello SHM propone che la copertura “a tappeto” della membrana microbica con gli AMP porti alla dislocazione dei lipidi di membrana, ad alterazioni della struttura e alla distruzione della membrana stessa o all’internalizzazione degli AMP [2]. La maggior parte dei modelli descritti asserisce che le orientazioni stabili adottate dagli α-AMP siano governate dalle distribuzioni di idrofobicità. La maggior parte degli α-AMP possiede strutture ad α-elica orientate in modo obliquo all’interno della membrana bersaglio [81] Queste possiedono una distribuzione asimmetrica dell’idrofobicità lungo l’asse dell’α-elica, che provoca un’orientazione e una penetrazione angolata della membrana destabilizzandone la struttura.
  47. 47. ~ 46 ~      Figura 11: Panoramica dei modelli di interazione di un peptide antimicrobico con il doppio strato lipidico. In nero sono etichettati i possibili stati termodinamici (stabili o metastabili), le vie cinetiche di collegamento sono rappresentate da frecce grigie e le etichette in rosso chiariscono le modalità d’azione antimicrobica. Le frecce nere, più brevi, rappresentano ulteriori inter-percorsi di conversione tra modelli. All’esterno della membrana bersaglio, monomeri del peptide e piccoli aggregati sono in equilibrio. A livello della membrana i peptidi si legano all’ l'interfaccia per adsorbimento. Gli α- AMP ricoprono come un tappeto la superficie esterna della membrana microbica ed è a questo punto può avvenire l’incorporazione dei peptidi all’interno della membrana, accompagnata dall’assottigliamento dello strato esterno e dall’aumento della sua area superficiale, portando a una tensione del bilayer. A questo punto può avvenire una transizione di fase della membrana con formazione di pori (sia di natura toroidale che a botte) dai quali fuoriesce materiale citoplasmatico. Le lesioni sulla membrana facilitano la traslocazione dei lipidi e degli α-AMP verso lo strato interno. In alcuni casi può verificarsi la diffusione degli α-AMP verso target intracellulari mentre in altri casi la frammentazione e la distruzione fisica della membrana della cellula microbica per formazione di micelle. Formazione del canale ionico Oltre a perturbare la membrana, gli AMP possiedono anche la capacità di formare canali ionici [82]. La maggior parte dei peptidi policationici ad elica meglio studiati (dermaseptine, cecropine, magainine e alameticina) forma pori o canali che possono essere analizzati mediante studi di conduttanza [82, 83]
  48. 48. ~ 47 ~    [84]. Questi peptidi inducono anche la perdita di K+ e di altri componenti cellulari [84]. Altre modalità d’azione degli AMP Oltre alla formazione di canali ionici, gli AMP possiedono altri meccanismi per la soppressione dei patogeni. La seminalplasmina, isolata dal plasma seminale bovino, provoca la lisi batterica attivando la cascata dell’autolisi all’interno delle cellule batteriche [5]. I peptidi PP-39 e il corrispondente dell’apidecina nel mammifero hanno mostrato la capacità di uccidere i batteri mediante un meccanismo che non prevede la lisi cellulare. Essi inibiscono la sintesi proteica e inducono anche la degradazione delle proteine richieste per la replicazione del DNA. Mentre i peptidi Bac-5 e Bac-7 interferiscono col trasporto e il metabolismo energetico delle cellule batteriche. Sia la proteina-1 microbicida indotta dalla trombina che la defensina-1 umana sono piccoli peptidi cationici che si sono rivelati in grado di modificare la struttura e la funzione della membrana citoplasmatica e sono coinvolti nell’inibizione della sintesi del DNA e delle proteine [68]. Un altro peptide, l’atacina, inibisce la sintesi delle proteine della membrana esterna senza entrare nelle cellule batteriche, mentre la diptericina aumenta la permeabilità delle membrane interne ed esterne di E. coli. L’anfifilicità come strategia nell’azione antimicrobica degli AMP Le minime concentrazioni inibenti (MIC) di tutti gli AMP sono dell’ordine micromolare, qusto rafforza la tesi che la loro interazione con la membrana microbica non è un processo mediato da recettori [85] [68]. Per interagire con la matrice lipidica della membrana plasmatica, gli AMP hanno sviluppato una varietà di strutture anfifiliche. La manipolazione dell’anfifilicità è una strategia utilizzata dagli AMP per facilitare l’invasione della membrana microbica. Gli AMP vengono generalmente raggruppati sulla base della loro struttura secondaria [3, 86] e tra le varie strutture si distinguono tre tipologie di anfifilicità [87]. L’indolicidina ad esempio, mostra un’anfifilicità primaria con un segmento centrale composto da una breve sequenza apolare compresa

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