17. I tempi di ritenzione crescono con il logaritmo dell’abbassamento di temperatura della colonna Equazione di Clausius-Clapeyron p = tensione di vapore v H = variazione di entalpia di vaporizzazione TEMPERATURA PROGRAMMATA IN GLC
18. CROMATOGRAFIA LIQUIDA … .forense: vediamo Catherine mentre prepara campioni per HPLC…. (da CSI, M. Helgenberger) La Cromatografia Liquida è diventata una tecnica analitica indispensabile in molti settori: farmaceutico, biologico, biomedico, clinico e …..
19. HPLC CROMATOGRAFIA LIQUIDA Durante il processo cromatografico la velocità con la quale ciascun analita procede lungo la colonna dipende dalle interazioni che stabilisce con la fase mobile e stazionaria, quindi la separazione è dovuta alla differenza nei coefficienti di distribuzione delle singole molecole nelle due fasi . La definizione HPLC ( H igh P ressure L iquid C hromatography) in origine riferita alle elevate pressioni di esercizio caratteristiche di questa tecnica, è stata oggi sostituita con H igh P erformance L iquid C hromatography o semplicemente L iquid C hromatography ( LC ).
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21. IL SISTEMA HPLC Contenitori dei solventi che costituiscono la fase mobile miscelatore pompa sistema di introduzione del campione precolonna e colonna rivelatore computer raccoglitore di frazioni
25. LA COLONNA LC Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi . Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe 15-25 cm , hanno diametro interno di 2-5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5-10 m . Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3-5 cm e sono riempite con materiali di 3-5 m . Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm , diametro interno di 1 mm e materiali di 10 m. Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7 .
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27. LC DI SCAMBIO IONICO (IEC) La fase stazionaria presenta gruppi ionici sulla superficie, di carica opposta rispetto a quella degli analiti . Questa tecnica viene utilizzata per analiti di tipo ionico o ionizzabili . Quanto è più forte la carica del campione, tanto più verrà trattenuto all’interno della colonna. La fase mobile è un tampone acquoso in cui il pH e la concentrazione vengono regolati per controllare il tempo di eluizione degli analiti. + + - - - - + flusso
28. La separazione è basata sulla dimensioni e massa molecolari degli analiti. La fase stazionaria è costituita da materiale di porosità controllata . Le molecole grandi eluiscono prima di quelle piccole . Infatti le molecole che sono troppo grandi per entrare nei pori della fase stazionaria hanno un percorso più breve nella colonna, rispetto a quelle che entrano nei pori. La porosità della fase stazionaria può essere controllata per ottenere la separazione di molecole in uno specifico intervallo di dimensioni. LC DI ESCLUSIONE DIMENSIONALE (SEC) flusso
32. LC DI ADSORBIMENTO La fase stazionaria è un solido . La separazione è dovuta all’alternarsi di fenomeni di adsorbimento e desorbimento . CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE La fase stazionaria è un liquido . La separazione è basata sulla partizione degli analiti tra la fase stazionaria e la fase mobile ( solubilità relativa ). Le specie che hanno più affinità per la fase stazionaria rispetto alla fase mobile saranno maggiormente ritenute. flusso flusso
33. LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO Spesso non è possibile definire in maniera chiara se la separazione degli analiti avvenga in base ad un processo di adsorbimento o di ripartizione, ovvero entrambi. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento/ripartizione , che viene suddivisa, in base alle polarità relative delle due fasi : Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria è polare (ad es. silice), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari. Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile è polare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari. Utilizzando uno o l’altro metodo, l’ordine di eluizione dei composti si inverte , anche se non sempre in maniera esattamente speculare. FASE NORMALE E IN FASE INVERSA
34. FASE STAZIONARIA In cromatografia liquida di adsorbimento , la fase stazionaria è un solido poroso . In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase stazionaria liquida , che riveste la superficie delle particelle di supporto. La fase stazionaria liquida è oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata alla supporto, detta bonded phase (BP) . Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice : i gruppi OH della silice ( silanoli ) vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria . Le fasi legate possono essere polari (ad es. con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale ; oppure apolari (ad es. con una catena alchilica, come quella octadecilica, C18), usate in fase inversa . LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO
35. La superficie della silice presenta gruppi silanolici (Si-OH), i gruppi reattivi utilizzati per legare la fase stazionaria al supporto. La composizione in silanoli non è costante e regolare su tutta la superficie della silice. Nella silice di tipo A (di origine naturale) la presenza di metalli come impurezze causa ulteriore variabilità nella reattività dei silanoli. La silice di tipo B (di origine sintetica) ha una composizione più controllata . FASI STAZIONARIE PER LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO
38. La fase stazionaria liquida viene legata ai silanoli della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro). L’atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata come C 18 o octadecil) e a due piccoli gruppi laterali come il metile. FASI SILICEE CHIMICAMENTE LEGATE (BP) SUPPORTO SILICEO FASE STAZIONARIA LIQUIDA Si OH Si OH Si OH Si OH Si OH Si OH
39. Molti dei silanoli superficiali non reagiscono a causa dell’ingombro sterico. I silanoli che non reagiscono sono spesso chiamati “silanoli liberi” . Questo fenomeno è tanto più rilevante quanto maggiore è l’ingombro del legante(es. C18). Il grado di ricopertura , espresso in mol/m 2 , è una misura della densità di fase sulla superficie della particella. DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE Si O Si OH Si OH Si O Si OH Si O
40. I silanoli liberi sono disponibili per altre interazioni con le molecole di soluto , spesso indesiderate (sono causa dei picchi scodati). Viene quindi spesso effettuato un processo di end-capping utilizzando un silano di piccole dimensioni che si lega ai silanoli liberi. Piccoli silani come il trimetilclorosilano sono in grado di accedere a molti dei silanoli liberi rimasti dopo il legame della fase stazionaria. Il processo di end-capping rende i silanoli inacessibili alle molecole di soluto. DISATTIVAZIONE DELLA SILICE ( END-CAPPING ) Si O Si OH Si OH Si O Si OH Si O
41. FASI MOBILI IN LC In tutti i tipi di cromatografia liquida, tranne quella di esclusione dimensionale , la fase mobile gioca un ruolo fondamentale nella separazione . E’ possibile utilizzare un solvente singolo , tuttavia molto spesso è necessario utilizzare una miscela di due o più solventi per ottenere la fase mobile di composizione ottimale. Durante l’analisi è possibile effettuare un’ eluizione isocratica (mantenendo costante la composizione della fase mobile ) o un’ eluizione in gradiente ( la composizione della fase mobile varia durante l’analisi). L’eluizione in gradiente viene utilizzata quando la miscela di analiti comprende composti di caratteristiche molto diverse tra loro e serve per migliorare la separazione e ridurre i tempi di analisi.
53. Questa figura riporta un rivelatore UV/Vis a filtro (in rosso), che permette di leggere l’assorbanza ad una sola lunghezza d’onda (quella selezionata dal filtro). Sostituendo il filtro con un monocromatore, si ottiene un rivelatore a lunghezza d’onda variabile, che permette di rivelare in una sola analisi composti con spettri di assorbimento molto diversi tra loro. La cella a flusso di lettura qui rappresentata è doppia: in una delle due celle passa l’eluato della colonna, nell’altra passa la fase mobile. Questo permette di migliorare la linea di base per sottrazione del segnale del solvente RIVELATORE UV/Vis A FILTRO E A MONOCROMATORE
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59. Il rivelatore a matrice o serie di fotodiodi (photodiode array) permette di misurare contemporaneamente un intervallo di lunghezze d’onda , per ottenere lo spettro completo degli analiti eluenti. Percorso della fase mobile all’interno di una cella di misura del tipo a “Z” RIVELATORE A SERIE DI DIODI (DAD)
60. RIVELATORE A SINGOLO RAGGIO A SERIE DI DIODI reticolo lampada a deuterio fenditura cella porta campione otturatore lampada a tungsteno rivelatore a serie di diodi lente lente
61. Principio di funzionamento DAD Serie di diodi OTTICA INVERTITA Sorgente continua Cella a flusso Monocromatore 1 4 5 6 7 8 9 11 12 3 10 2 Istante per istante, lo strumento registra lo SPETTRO dell’analita che in quell’istante attraversa la cella. Il riferimento è lo spettro del fluido di trasporto
62. cella a flusso lampada al deuterio lampada al tungsteno combinatore di raggio lente di focalizzazione filtro specchio reticolo serie di diodi guida ottica cella a flusso DAD con cella a fibra ottica e guida ottica
65. Tecniche FFF/ P.M. > 10 4 sezione trasversale del canale FFF Pompa Iniettore Flusso Canale FFF Fase mobile 0.123 IN OUT Collettore frazioni Rivelatore UV-Vis Registratore Acquisizione dati Campo
66. spessore w Flusso Detector Flusso a profilo parabolico spessore w Campione Il dispositivo FFF Campo esterno Ingresso del campione
67. Come funziona la FFF? Cammino particella Profil o flusso B Campo P rofil o flusso A Flusso
68. Modi di operazione FFF Versatilità rispetto al peso molecolare dell’analita: Modo normale: macromolecole e nanoanaliti Modo sterico/iperstrato: sistemi microdispersi
69. parete di accumulazione trasporto i ndotto dal campo campo A B A B Modo FFF normale trasporto indotto dalla diffusione
71. Tipi di campo e tecniche FFF Versatilità rispetto al tipo di campione da analizzare: FlFFF: universale (dalle macromolecole alle microparticelle) GrFFF: nano e microparticelle
72. flusso di campione in entrata flusso di campione in uscita flusso trasversale flusso trasversale flusso trasversale in uscita profilo parabolico A B C FlFFF in modo normale V 1 /D r
81. Campione iniettato : 1.25 ng HRP e 7.5 g PS/HRP 6 m Guardiamo dentro al canale GrFFF…. CCD FM con substrato al luminolo 0.75 123
82. (b), (c) E.coli non fimbriato (a) E.coli fimbriato GrFFF di batteri interi
83. Il campo di forze che causa il trasporto differenziale e' di tipo elettrico . L'elettroforesi ha avuto il suo ideale campo di applicazione in bioanalitica. La separazione si realizza in base al rapporto carica/raggio della molecola. ELETTROFORESI CON ELETTROLITA LIBERO Problemi di convezione ELETTROFORESI CAPILLARE ELETTROFORESI CON SUPPORTO ELETTROFORESI/10 3 <P.M.<10 8
84. Aumento del rapporto superficie/volume Tipi di supporto : acetato di cellulosa carta gel di poliacrilammide (PAGE) gel di agarosio I supporti danno un effetto di setaccio per separare in base alle dimensioni, uno volta che le specie siano state caricate in ambiente tamponato Esempi di applicazioni : Analisi di proteine (Progetto “Proteoma”) Sequenziatura del DNA (Progetto “Genoma”) ELETTROFORESI SU SUPPORTO
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86. Formazione di un gel di PA Il setaccio tridimensionale si forma dalla co-polimerizzazione del monomero attivato ( acrilammide ) e del composto che forma i legami trasversali ( metilen-bis-acrilammide )
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89. L‘elettrolita e' all‘ interno di un tubo capillare , la convezione e' soppressa dato l'alto rapporto superficie volume. Il calore e' dissipato rapidamente: uso di alti voltaggi ELETTROFORESI CAPILLARE (CZE)
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92. Che cos’è la spettrometria di massa? Spettroscopia di ioni gassosi h ν ν 1 ν n Sorgente di fotoni Dispersione Spettro di frequenza Spettroscopia di fotoni Campo magnetico + – – – + + m/z Campo elettrico ( m/z ) 1 ( m/z ) 2 Spettro di massa
To be effective in FFF, a field must have three properties. First, it must be sufficiently strong to drive sample components into localized regions of the parabolic flow profile. Second, it must be adequately selective such that different components are driven to different parts of the flow profile to achieve separation. Third, it must be easily implemented to make instrument developments practical and possibly economical.
L’immagine mostra i componenti a partire dai quali assembliamo in laboratorio i canali a fibra cava. Le fibre, che sono ampiamente utilizzate per applicazioni di dialisi o ultrafiltrazione, sono disponibili commercialmente in un’ampia gamma di materiali polimerici e di cutoff di massa molecolare. Un tratto di fibra del diametro interno di circa 0.8 mm e della lunghezza di 24 cm viene inserito in un tubo in teflon e fissato alle estremità. Quando attraverso la fibra viene fatto passare un flusso, a causa della porosità della parete, il fluido in entrata si ripartisce in due componenti, una longitudinale, il flusso di eluizione, ed una radiale, che defluisce attraverso la giunzione a T qui mostrata, e che genera all’interno del canale un campo radiale di frizione idrodinamica.
Il meccanismo separativo realizzato dall’azione combinata di questi due flussi è quello classico del frazionamento in campo flusso: la componente longitudinale, a causa del diametro capillare della fibra, assume un regime laminare con profilo parabolico di velocità, massima sull’asse della fibra e nulla sulla parete. Il rapporto di ritenzione di un analita dipenderà quindi dalla sua distanza media dalla parete durante l’eluizione. Va innanzitutto osservato che la separazione avviene per effetto idrodinamico, senza coinvolgere alcuna interazione chimica dell’analita con la fase mobile ed in assenza di fase stazionaria. Questo consente un’ampia flessibilità nella scelta della fase mobile, che può essere resa biocompatibile o compatibile con altre tecniche analitiche da applicare a valle del frazionamento. Gli analiti, inoltre, non subendo interazioni forti durante il frazionamento vengono eluiti mantenendo il loro stato originario. Per analiti di dimensioni macromolecolari e nanoparticelle, fino ad alcune centinaia di nanometri, la distanza dalla parete viene determinata dall’equilibrio tra la forza di trascinamento idrodinamico generata dal flusso radiale, che trascina l’analita verso la parete, ed i moti browniani che ne determinano la diffusione verso il centro della fibra. Si dimostra quindi che in base a questo meccanismo, detto normale o browniano, il tempo di ritenzione è determinato dal coefficiente di diffusione, e l’ordine di eluizione va dalle particelle più piccole a quelle più grandi. Vediamo ora i risultati dell’applicazione di questo modo di eluizione a campioni di proteine intere.
Let’s see now two examples that show capabilities of HF FlFFF with intact proteins . The first example show d ifferent intact proteins of a broad molecular weight range fractionated at different retention times. We can observe fractionation at very high molar mass range, like in the case of HSF, the dimer of which is almost 900 KDa in molar mass . The second example shows separation between a mixture of myoglobin and BSA . We know that efficiency in terms of number of plate s is, in general, relatively poor in FFF. However, HF FlFFF selectivity is relatively high. So, resolution turns out to be generally lower than resolution in LC or CZE because peaks in HF FlFFF are quite broader due the high D -base selectivity. In other words, HF FlFFF is able to “sort” protein molecules according to even very small differences in D. This makes particularly interesting use of HF FlFFF with ESI/MS since, in general, ESI/MS is itself more resolving in terms of molar mas s than a separation technique like chromatography .
Lo canale a fibra cava è applicabile anche al frazionamento di particelle microniche, quali sono le cellule. In questo caso il meccanismo è leggermente diverso, perché per particelle di queste dimensioni la diffusione è trascurabile, e ad opporsi al campo sono forze di sollevamento idrodinamico che dipendono dalle caratteristiche morfologiche della particella stessa, fra cui le dimensioni, la forma, la rigidità e le caratteristiche superficiali. Questo meccanismo è detto gaussiano o ipersitrato, e siccome a parità di altri fattori gli analiti eluiscono in ordine inverso di dimensione ripetto al modo normale, si parla anche di FFF in modo inverso. Per questo modo non esiste una relazione analitica tra tempo di ritenzione e caratteristiche delle particelle, in quanto non esiste un modello generale per la descrizione delle forze di sollevamento, per cui un’eventuale conversione del tempo di ritenzione in dimensioni dell’analita va realizzata in modo empirico Abbiamo applicato questo modo di eluizione al frazionamento di cellule batteriche.
In questa diapositiva vediamo qualche esempio di alcune separazioni possibili tra batteri di tipo diverso e tra batteri di una stessa specie in diverse condizioni di vitalità. Vediamo che, ad un certo tempo di eluizione e raccolta frazioni, la possibilità di arricchimento di una specie rispetto all’altra è notevole. Vediamo che e’ possibile ottenere frattogrammi diversi anche per uno stesso tipo di batterio se posto in condizioni di crescita su piastra o se allo stato liofilizzato. La fase mobile che abbiamo usato risulta compatibile con il MALDI TOF in quanto costituita da componenti volatili non in grado di dare addotti stabili con le proteine.
