Diploma Thesis: "Study of the Interaction between Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus carbonarius in vitro and in situ on Fraoula variety grapes"

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ
ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ
Μελέτη της αλληλεπίδρασης της ζύμης Saccharomyces
cerevisiae και του μύκητα Aspergillus carbonarius
in vitro και in situ σε επιτραπέζια σταφύλια ποικιλίας
Φράουλα
Πτυχιακή Μελέτη
Κατσαρού Δανάη
Αθήνα 2019

Σταφύλι Ποικιλίας Φράουλα
 Οι ράγες της ποικιλίας είναι μεγάλες και ωοειδείς με λεπτή φλούδα
και ερυθρό χρωματισμό.
 Τα σταφύλια περιέχουν θρεπτικά συστατικά και αντιοξειδωτικά,
όπως φαινόλες, πολυφαινόλες, ρεσβερατρόλη και καροτενοειδή.
 Αποτελούν πηγή βιταμίνης Κ, χαλκού, σιδήρου, φυτικών ινών και
πολλών βιταμινών του συμπλέγματος Β.

Ο μύκητας Aspergillus carbonarius
 Παράγει μεγάλο αριθμό κονιδίων.
 Αναπτύσσεται σε φρούτα και κυρίως σε σταφύλια κατά την
ωρίμανσή τους σε υψηλές θερμοκρασίες.
 Αποτελεί πηγή Ωχρατοξίνης Α σε φρέσκα σταφύλια, σταφίδες και
στον οίνο.
 Ανάγκη βιολογικής καταπολέμησης.

Η ζύμη Saccharomyces cerevisiae
 Χρησιμοποιείται στην αρτοποιία και ζαχαροπλαστική, καθώς και
στην παραγωγή οίνου και άλλων αλκοολούχων ποτών.
 Παρουσιάζει έντονη αντιμυκητιακή δράση και ικανότητα μείωσης
των επιπέδων Ωχρατοξίνης Α.
 Χρησιμοποιείται για βιολογικό έλεγχο της αλλοίωσης των
τροφίμων, η οποία οφείλεται στην ανάπτυξη μυκήτων.

1. Πείραμα ανταγωνισμού in vitro του S. cerevisiae
και του Α. carbonarius σε υγρό μέσο
καλλιέργειας.
Σκοπός: Να εξεταστεί αν η ανάπτυξη του μύκητα A.
carbonarius παρεμποδίζεται από τα μεταβολικά
προϊόντα της ζύμης S. cerevisiae, όταν
αναπτύσσονται σε συγκαλλιέργεια.

Υλικά και Μέθοδοι
 Εμβολιασμός μικροτρυβλίου 6 θέσεων με A. carbonarius και S.
cerevisiae με εμβόλια συγκέντρωσης 105 conidia/mL και CFU/ml
αντίστοιχα, σύμφωνα με το σχέδιο:
 Επώαση του μικροτρυβλίου στους 25 οC για 6 ημέρες.
1 2 3
4
5 6

 Παρασκευή 2 φιαλών με υπόστρωμα CYbroth και εμβολιασμός
τους με S. cerevisiae και A. carbonarius, ώστε οι τελικές τους
συγκεντρώσεις να είναι 104 CFU/ml και 104 conidia/ml αντίστοιχα.
 Επώαση στους 25οC για 7 ημέρες.
 Φυγοκέντρηση στους 4 οC για 15min σε 6000g.
 Διήθηση σε Millipore φίλτρου 0,2 μm.
 Το περιεχόμενο μοιράστηκε σε πλαστικά αποστειρωμένα δοχεία και
εμβολιάστηκε με 5μL A. carbonarius.

Αποτελέσματα
 Μικροτρυβλίο S. cerevisiae και A. carbonarius:
 Από τη 2η ημέρα επώασης παρατηρήθηκε μεγάλη ανάπτυξη του A.
carbonarius στους περιέκτες.

2. Πείραμα ανταγωνισμού in vitro του S. cerevisiae
και του Α. carbonarius σε στερεό μέσο
καλλιέργειας.
Σκοπός: Mελέτη της αλληλεπίδρασης της ζύμης S.
cerevisiae FMCC Y33 έναντι του μύκητα A.
carbonarius FMCC F71.

 Εμβολιασμός τρυβλίων CYA με επίστρωση, εμβολίου S. cerevisiae
100μL συγκέντρωσης 104 CFU/ml και ενοφθαλμισμός στο κέντρο
εμβολίου Α. carbonarius 5μL συγκέντρωσης 104 conidia/mL.
 Επώαση τρυβλίων στους 25 oC για 10 ημέρες.
 Μέτρηση διαμέτρου του A. carbonarius.
 Μέτρηση κονιδίων του A. carbonarius με χρήση αντικειμενοφόρου
πλάκας Neubauer.

Οπτική Παρατήρηση
ΧΡΟΝΟΣ ΕΠΩΑΣΗΣ
(ΗΜΕΡΕΣ)
ΜΑΡΤΥΡΑΣ
(F71)
ΣΥΓΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ
(Y33 + F71)
1
4
7
10

Αποτελέσματα
Επιφάνεια (cm2): Αριθμός κονιδίων (log con*cm2):
Μονοκαλλιέργεια του A. carbonarius
Συγκαλλιέργεια του A.carbonarius με τον S.cerevisiae
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Επιφάνεια
(cm
2
)
Ημέρες
0
2
4
6
8
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Αριθμός
κονιδίων
log(con*cm
2
)
Ημέρες

3. Πείραμα ανταγωνισμού in situ του S. cerevisiae
και του Α. carbonarius σε σταφύλια
Σκοπός: Εξέταση της αλληλεπίδρασης του S.
cerevisiae και του Α. carbonarius in situ σε
επιτραπέζια σταφύλια.

 Δημιουργία δειγμάτων σταφυλιών με:
i. Φυσική χλωρίδα, χωρίς καμία επέμβαση
ii. Εμβολιασμό με S. cerevisiae συγκέντρωσης 103 CFU/ml
iii. Εμβολιασμό με Α. carbonarius συγκέντρωσης 103 conidia/mL
iv. Εμβολιασμό με την συγκαλλιέργεια A. carbonarius και S.
cerevisiae συγκέντρωσης 103 conidia/mL και 103 CFU/ml
αντίστοιχα.
 Τα δείγματα επωάστηκαν στους 25 oC για 22 ημέρες.

 Οι δειγματοληψίες έγιναν σε χρόνο 0 και τη 1η, 2η, 5η, 7η, 9η, 13η,
16η, 19η και 22η ημέρα επώασης.
 25g σταφυλιού και 25 mL διαλύματος Ringer ομογενοποιήθηκαν σε
σακούλα Stomacher για 2 λεπτά.
 Απαρίθμηση της μικροχλωρίδας σε τρυβλία PCA, PCA με
κυκλοεξαμίδιο και DRBC με την τεχνική της επιφανειακής
επίστρωσης.
Μικροβιολογικές Αναλύσεις

Μοριακές Αναλύσεις
 Οι δειγματοληψίες έγιναν σε χρόνο 0 και τη 1η, 7η, 13η, 16η και 22η
μέρα επώασης.
 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) με το ζεύγος
εκκινητών pks F-R.
 Real Time PCR με το ζεύγος εκκινητών pks F-R.

Οπτική Παρατήρηση
ΧΡΟΝΟΣ
ΕΠΩΑΣΗΣ
(ΗΜΕΡΕΣ)
ΣΤΑΦΥΛΙΑ
ΧΩΡΙΣ ΚΑΜΙΑ
ΕΠΕΜΒΑΣΗ
ΣΤΑΦΥΛΙΑ
ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΕΝΑ
ΜΕ Υ33
ΣΤΑΦΥΛΙΑ
ΜΕ F71
ΣΤΑΦΥΛΙΑ
ΜΕ Υ33 + F71
1
7
13
22

Αποτελέσματα Μικροβιολογικών Αναλύσεων
Σταφύλι χωρίς καμία επέμβαση: Σταφύλι εμβολιασμένο με S. cerevisiae:
: ΟΜΧ : Ζύμες : ΟΒΧ : Μύκητες
Γενικός τύπος
log
CFU/g
Ημέρες
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
log
CFU/g
Ημέρες

Σταφύλι εμβολιασμένο με A. carbonarius: Σταφύλι εμβολιασμένο με την συγκαλλιέργεια
A. carbonarius και S. cerevisiae:
: ΟΜΧ : Ζύμες : ΟΒΧ : Μύκητες
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
log
CFU/g
Ημέρες
log
CFU/g
Ημέρες
D

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
500 bp
200 bp
100 bp
Ladder 100bp:1 Φυσική Χλωρίδα (NC) 0, 16, 7, 13, 22, 1 ημέρες: 2-7 Φυσική Χλωρίδα
Εμβολιασμένη με A. carbonarius (NF) 13, 16, 22, 1, 7 ημέρες: 8-12 H2O: 13.
Αποτελέσματα ποιοτικής ανίχνευσης του DNA του Α.
carbonarius με χρήση της Αλυσιδωτής Αντίδρασης
Πολυμεράσης (PCR)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
500 bp
200 bp
100 bp
Ladder 100 bp:1 NC 0,7,16,22 ημέρες:2,3,5,7,4 NF χρόνος 0:6 NYF 16, 13, 1, 22
ημέρες: 8-11 H2Ο:12 Ladder 100 bp:13.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
500 bp
200 bp
100 bp
Ladder 100 bp:1 NC1,7,16,22 ημέρες: 6,7,9,10,4 Φυσική Χλωρίδα Εμβολιασμένη
με A. carbonarius και S. cerevisiae (NYF) 7,13,16,22 ημέρες: 11,8,5,2,3 H2O: 12.

Αποτελέσματα ποσοτικής ανίχνευσης του DNA του Α.
carbonarius με χρήση της Real Time PCR
 Πρότυπη Καμπύλη DNA του μύκητα A. carbonarius 5010:
 To εύρος του απλοειδούς γονιδιώματος της πρότυπης καμπύλης ήταν
από 24 έως 24*103 απλοειδές γονιδίωμα/g σταφυλιού.
Efficiency (E) 2
%Efficiency (%E) 100,04
Slope (a) -3,32
y = -Γενικός τύποςx + Γενικός τύπος
R² = Γενικός τύπος
-Γενικός τύπος
Ct
values
log C

 Το εύρος του απλοειδούς γονιδιώματος για τα δείγματα σταφυλιού ήταν από 28,25
έως 19,3*103 απλοειδές γονιδίωμα/g σταφυλιού.
Συγκέντρωση DNA του A. carbonarius (pg/g σταφυλιού) σε δείγματα σταφυλιού
εμβολιασμένα με αυτόν:
[]
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Συγκέντρωση
DNA
μύκητα
(pg/g)
Ημέρες
A

Συγκέντρωση DNA του A. carbonarius Συγκέντρωση DNA του A. carbonarius
(pg/g σταφυλιού) σε δείγματα σταφυλιού (pg/g σταφυλιού) σε δείγματα σταφυλιού
εμβολιασμένα με την συγκαλλιέργια χωρίς καμία επέμβαση:
A. carbonarius και S. cerevisiae:
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
DNA
μύκητα
(pg/g)
Ημέρες
B
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
Γενικός
τύπος
DNA
μύκητα
(pg/g)
Ημέρες
C

Συζήτηση Αποτελεσμάτων
 H ανάπτυξη του Α. carbonarius δεν παρεμποδίστηκε από κάποιο
μεταβολικό προϊόν του S. cerevisiae.
 Η ζύμη S. cerevisiae Υ33, ανέστειλε την ανάπτυξη του μύκητα A.
carbonarius στο εργαστηριακό θρεπτικό μέσο CYA στους 25οC. Σύμφωνα
με τους Tryfinopoulou et al. (2019), η ανάπτυξη του A. carbonarius
αναστέλλεται πλήρως παρουσία του S. cerevisiae Υ33, ανεξάρτητα από τη
θερμοκρασία, υποδεικνύοντας έτσι το δυναμικό αυτού του είδους ζύμης ως
μέσο βιολογικού ελέγχου.

 Η στατιστική ανάλυση με βάση τη δοκιμή Tukey, έδειξε ότι υπήρξαν
στατιστικά σημαντικές διαφορές (p>0,05) μεταξύ των τιμών των
λογαρίθμων (conidia*cm2) που καταμετρήθηκαν για τη
μονοκαλλιέργεια του A. carbonarius και την συγκαλλιέργειά του με τον
S. cerevisiae, από τη 2η έως τη 10η ημέρα επώασης.
 Η ζύμη S. cerevisiae ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του μύκητα A.
carbonarius στα δείγματα σταφυλιού. Σύμφωνα με τους Kapetanakou
et al. (2012), η προσθήκη ζυμών, συμπεριλαμβανομένου του S.
cerevisiae, μπορεί να είναι μια αξιόπιστη μέθοδος αναστολής της
ανάπτυξης του A. carbonarius σε τρόφιμα με χαμηλό pH(3,5).

 Με την Real Time PCR ανιχνεύθηκε ποσότητα DNA του A. carbonarius
σε όλα τα δείγματα σταφυλιού, ακόμα και στις περιπτώσεις όπου η
κλασική PCR δεν έδωσε θετικό αποτέλεσμα και οι τιμές του A.
carbonarius σύμφωνα με τις μικροβιολογικές τεχνικές ήταν κάτω από το
όριο ανίχνευσης.
 Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της Real Time PCR, φαίνεται ότι η ζύμη S.
cerevisiae έδρασε παρεμποδιστικά έναντι στον μύκητα A. carbonarius. Οι
Cubaiu et al. (2012) αναφέρουν ότι η παρουσία του S. cerevisiae
παρεμπόδισε την ανάπτυξη του μυκηλίου του A. ochraceus και A.
carbonarius, ενώ παρατηρήθηκε μείωση της μεταγραφής του γονιδίου pks
παρουσία ζώντων κυττάρων της ζύμης στην καλλιέργεια του μύκητα.

Diploma Thesis: "Study of the Interaction between Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus carbonarius in vitro and in situ on Fraoula variety grapes"

Diploma Thesis: "Study of the Interaction between Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus carbonarius in vitro and in situ on Fraoula variety grapes"

Recommended

Recommended

More Related Content

Featured

Featured (20)

Diploma Thesis: "Study of the Interaction between Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus carbonarius in vitro and in situ on Fraoula variety grapes"