4. Acid lactic
Đại cương
- Do nhà hóa học Thụy điển Carl Wihelm Scheele phân
lập lần đầu tiên năm 1870
- Có 02 dạng đồng phân quang học L(+) và D (-)
C OH
H
COOH
CH3
C H
OH
COOH
CH3
D-lactic acid L- lactic acid
5. Acid lactic
Vai trò
- Ngành thực phẩm và nước giải khát: điều chỉnh pH,
bảo quản, điều chỉnh hương vị, phomat,…
- Ngành dược phẩm:
• Dung dịch tiêm truyền cung cấp năng lượng, cân
bằng pH, bổ sung thể tích máu (Lactat Ringer),…
• Dạng muối lactat có khả năng hòa tan, hấp thu,
chuyển hóa tốt (ciprofloxacine)
- Ngành mỹ phẩm: chất làm ẩm
- Ngành công nghiệp: túi sinh học, an toàn môi trường
7. Acid lactic
Sản xuất công nghiệp
- Được sản xuất lần đầu tiên do Charles E. Avery
(Littleton, Massachusetts, USA), năm1881
- Có 02 phương pháp:
1. Tổng hợp hóa học
2. Lên men carbohydrate
8. Acid lactic
Sản xuất bằng pp hóa học
- Dựa trên lactonitril:
• Hydrogen cyanide được thêm vào acetaldehyde có sự
có mặt của kiềm
• Pư xảy ra ở dạng lỏng, áp suất cao
- Tinh chế lactonitril thô bằng pp chưng cất
- Thủy phân lactonitril thành acid lactic bằng acid HCl đậm
đặc hoặc H2SO4
- Ester hóa acid lactic bằng MeOH, tạo methyl lactate
- Tinh chế methyl acetate bằng pp chưng cất
- Thủy phân methyl lactate bằng acid, tạo acid lactic
Sản phẩm là hỗn hợp racemic (+), (-) acid lactic
9. CH3CHO + HCN
catalyst
CH3CHOHCN
acetaldehyde hydrogen cyanide lactonitrile
CH3CHOHCOOH + CH3CHOHCOOCH3 + H2O
lactic acid
CH3CHO
methanol methyl lactate
CH3CHOHCOOCH3 + H2O CH3CHOHCOOH CH3OH
+
methyl lactate lactic acid methanol
CH3CHOHCN + H2O + 1/2H2SO4 CH3CHOHCOOH + 1/2
Lactonitrile lactic acid ammonium salt
(NH4)2SO4
Cộng hợp hydrogen cyanide
Thủy phân bằng acid sulfuric
Ester hóa
Thủy phân bằng nước
CH3OH
Acid lactic
Sơ đồ quá trình tổng hợp acid lactic bằng pp hóa học
10. Acid lactic
Sản xuất bằng pp hóa học: 1 số qui trình khác
- Oxy hóa propylene glycol
- Thủy phân acid chloropropionic
- Oxy hóa propylene
- Pư giữa acetaldehyde, carbon monoxide và nước ở
nhiệt độ và áp suất cao
11. Acid lactic
Sản xuất bằng pp lên men:
- Lên men carbohydrate
- Có thể tạo dạng L(+) hay D (-) tùy theo chủng vi
khuẩn sử dụng
- Gồm các bước chính:
• Lên men carbohydrate tạo calcium lactate
• Thủy phân calcium lactate
• Tinh chế acid lactic
12. Acid lactic
Gđ lên men carbohydrate và trung hòa acid
C6H12O6 + Ca (OH)2 (2CH3CHOHCOO- ) Ca2+ 2H2O
Carbohydrate Calcium lactate
Thủy phân calcium lactate
2(CH3CHOHCOO-) Ca2 + H2SO4 2 CH3CHOHCOOH + Ca SO4
Calcium lactate Lactic acid
Tinh chế acid lactic: giống pp hóa học
- Ester hóa bằng MeOH
- Thủy phân methyl lactate, thu acid lactic
13. Acid lactic
Tóm tắt các giai đoạn sản xuất bằng pp lên men:
- Lên men carbohydrate
- Lọc dịch nuôi cấy để loại bỏ tế bào
- Calcium sulfate không hòa tan được lọc bỏ
- Tinh chế acid lactic bằng thủy phân, ester hóa, chưng
cất
15. Acid lactic
Cơ chế lên men: 02 cơ chế
- Lên men lactic đồng hình: acid lactic chiếm đa số
• Phân giải đường theo con đường EM, sử dụng
enzyme aldolase acid pyruvic
• Acid pyruvic acid lactic
- Lên men lactic dị hình: acid lactic chiếm tỉ lệ thấp, hỗn
hợp sản phẩm gồm acid acetic, acid formic, CO2
• Phân giải đường theo con đường
hexosomonophosphate (HMP), sử dụng enzyme
phosphoketolase
16. Acid lactic
Cơ chế lên men lactic đồng hình:
- Mono hoặc disaccharide acid pyruvic theo con
đường phân Embden - Mayerhoff (EM)
- Trong điều kiện kỵ khí, acid pyruvic acid lactic do
enzyme lactate dehydrogenase (LDH) xúc tác
- LDH qui định sản phẩm lên men là L(+) hay D(-) acid
lactic (do gen ldhL hay ldhD, tùy theo chủng vi khuẩn)
• Gen mã hóa enzyme L(+) LDH được nghiên cứu ở
L. plantarum
• Gen mã hóa enzyme D(-) LDH được nghiên cứu ở
L. johnsonii
17. Acid lactic
Nguyên liệu
Chủng vi khuẩn: nguyên tắc lựa chọn
- Lên men nhanh chóng và hoàn toàn từ các nguyên
liệu rẻ tiền
- Sản xuất dạng đồng phân cần thiết với hiệu suất cao
- Hạn chế tối thiểu lượng sinh khối tạo ra
- Ít sản phẩm phụ
18. Acid lactic
Nguyên liệu:
Nguồn carbon: sử dụng các nguồn carbohydrate khác
nhau (5-20%, tốt nhất 12%)
Sucrose Lactose Tinh bột Galactose
L. delbreuckii
- delbreuckii
+
L. delbreuckii-
bulgaricus
+
L. amylophylus
, L. amylovirus
+
L. helveticus + +
19. Acid lactic
Nguyên liệu:
Nguồn nitơ: sử dụng các nguồn nitơ khác nhau: cao
nấm men (5-15 g/l), mầm lúa mạch, peptone, thịt bò,
casein thủy phân
Vitamin: các vitamin B (vit B6)
Nguyên tố vi lượng: P, K, Mg, S: ảnh hưởng không rõ
20. Acid lactic
Điều kiện lên men:
- Tốc độ thông khí: 50 rpm/phút
- Nhiệt độ:
• Ưa nhiệt (45 – 62 oC)
• Không ưa nhiệt (25 – 45 oC)
- pH: >4,5, tốt nhất 5,5 – 6,5. Các chất điều chỉnh pH:
NaHCO3, Na2CO3, NaOH, NH4OH
21. Acid lactic
Qui trình lên men: 02 qui trình chính cho hiệu suất cao
- Lên men liên tục
- Lên men từng lô mẻ
22. Acid lactic
Lên men liên tục
Ưu điểm:
- Năng suất cao 117 g/l/h
- Cung cấp tế bào liên tục gia tăng nồng độ acid
lactic L(+) tinh khiết
Nhược điểm:
- Nồng độ acid lactic thấp
- Mật độ tế bào cao khuấy trộn môi trường không
đều
23. Acid lactic
Thu hoạch acid lactic
- Dung dịch lên men có thể chứa acid lactic tinh khiết,
hay dạng muối hoặc cả hai dạng
- 1 số phương pháp tách chiết acid lactic:
• Dùng dung môi
• Sắc ký trao đổi ion
• Sắc ký hấp phụ
• Chưng cất chân không
• Trao đổi qua màng
24. Acid lactic
Qui trình thu hoạch acid lactic
- Lọc bỏ loại vi khuẩn
- Chuyển sang dạng muối Na+ hay Ca2+ bằng NaOH hay
Ca(OH)2, pH 5,8
- Giảm pH 1,6 và chạy cột sắc ký với nhựa trao đổi
cation, rửa cột bằng H2SO4 loãng
26. Acid gluconic
Đại cương
- Năm 1870, Hlasiwetz và Habermann phát hiện
- Năm 1880, Boutroux tìm thấy các vi khuẩn sinh acid
acetic có thể sản xuất acid gluconic
- Năm 1922, Molliard tìm thấy acid gluconic từ A. niger
- Hiện nay, acid gluconic có thể sản xuất từ nhiều chủng
như Pseudomonas, Acetobacter, Gluconobacter và
nhiều chủng nấm
27. Acid gluconic
Vai trò
- Ngành thực phẩm: điều chỉnh hương vị (E574), điều
chỉnh pH, chất bảo quản
- Ngành dược phẩm:
• Dạng muối sắt: điều trị thiếu máu
• Dạng muối calci: điều trị thiếu calci
• Dạng muối kẽm: điều trị chứng lạnh run, lành vết
thương
-Ngành công nghiệp giấy, vải sợi, thức ăn gia súc,..
28. Acid gluconic
Nhu cầu
- ~ 60.000 tấn/năm
- Dạng chủ yếu là muối Na, Ca
Sản xuất: có nhiều pp sản xuất acid gluconic
- PP hóa học
- PP điện hóa
- PP sinh hóa
- PP lên men
29. Acid gluconic
Sản xuất acid gluconic bằng pp lên men
Chủng vi sinh vật:
- A. niger được sử dụng nhiều
- Hiện nay đang nghiên cứu Gluconobacter oxydans
- Vi khuẩn Pseudomonas cũng được dùng tuy nhiên có
nhiều sản phẩm phụ như 2-ketogluconat hay 2,5-
diketogluconic acid
30. Acid gluconic
Tùy theo sản phẩm là Na hay Ca gluconat, qui trình lên
men sẽ khác nhau (nồng độ glucose, pH)
Natri gluconate Calci gluconate
Điều chỉnh pH NaOH CaCO3, vô khuẩn
Nồng độ glucose 350 g/l > 15% quá bão
hòa muối calci kết
tủa ngăn cản vận
chuyển oxy
Độ hòa tan 39,6% ở 30 oC 4% ở 30 oC
32. Acid gluconic
A. niger có khả năng sản xuất tất cả enzyme cần thiết
cho quá trình chuyển glucose acid gluconic
- Glucose oxidase: glucose glucono – lactone
- Lactonase: glucono – lactone acid gluconic
- Mutarotase: gia tăng tốc độ phản ứng
- Catalase: H2O2 là sản phẩm phụ của pư, do vậy
catalase phân hủy H2O2 thành oxy và nước
33. Acid gluconic
Sản xuất acid gluconic bằng pp lên men
- Quá trình sản xuất acid gluconic ảnh hưởng trực tiếp
bởi hoạt tính của enzyme glucose oxidase
- Tính chất glucose oxidase:
• Gia tăng hoạt tính khi nồng độ glucose cao, pH ~
5,5, nồng độ oxy tăng
• Bền tại pH ~ 4 - 6 ở 40 oC, trong 2 giờ, không bền >
50 oC
- CaCO3 gia tăng hoạt tính của glucose oxidase và
catalase
34. Acid gluconic
Nguyên liệu lên men:
Carbon: thường sử dụng glucose, có thể sử dụng rỉ
đường, dịch thủy phân tinh bột,…
Ion kim loại: Zn, Cu, Mg, Ca, Fe,…
35. Acid gluconic
Qui trình tổng quát tối ưu lên men acid gluconic
- Nồng độ glucose 110 – 250 g/l
- Nồng độ N và P thấp (20 mM)
- pH 4,5 – 6,5
- Độ thông khí cao, dùng áp suất khí (4 bar)
36. Acid gluconic
02 yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men
acid gluconic
- Độ thông khí
- pH môi trường
Oxy cần trực tiếp cho quá trình oxy hóa glucose
nhu cầu oxy cao
pH: A. niger sản xuất các acid hữu cơ yếu: a. oxalic,
a. citric, a. gluconic
• pH <3,5: sản phẩm là a. citric
• pH 4,5 – 7 (pH 5,5): sản phẩm là a. gluconic
37. Acid gluconic
Mối liên quan giữa pH và hoạt tính enzyme glucose
oxidase
- pH 2 hoạt tính enzyme là 5%
- pH 3 hoạt tính enzyme là 35%
- pH 5,6 hoạt tính enzyme là 100%
38. Acid gluconic
Thu hoạch acid gluconic
- Lọc để loại bỏ sinh khối
- Trung hòa bằng Ca(OH)2 Ca gluconate
- Tủa Ca gluconate bằng NaCl ở nhiệt độ lạnh
- Thêm H2SO4 tạo tủa CaSO4
- Dịch còn lại chạy qua cột trao đổi cation để hấp phụ Ca
2+ còn sót lại
- Kết tinh acid gluconic ở -10 oC, có hoặc không có cồn
39. Acid citric
Đại cương
- Do nhà hóa học Thụy điển Carl Wihelm Scheele phân
lập lần đầu tiên năm 1874
- Năm 1893, C. Wehmer phát hiện nấm mốc Penicillium
có khả năng sản xuất acid citric
- Năm 1917, James Currie phát hiện A. niger có thể sản
xuất acid citric hiệu quả
HOOC CH2 C CH2 COOH
OH
COOH
40. Acid citric
Vai trò
- Ngành công nghiệp thực phẩm: dùng làm chất điều
chỉnh pH, chất điều vị, bảo quản; dạng muối Na, K, Ca
dùng làm phẩm màu thực phẩm
- Ngành dược phẩm:
• Tác dụng chống oxy hóa khi dùng phối hợp với acid
ascorbic
• Điều chỉnh pH đường tiêu hóa
• Tăng độ hòa tan của thuốc phiện
41. Acid citric
Nhu cầu
- Sản xuất ~ 1,6 triệu tấn/năm
• 50% dùng trong ngành nước giải khát
• 20% dùng trong ngành thực phẩm
• 20% dùng trong các chất tẩy rửa
• 10% dùng trong các ngành khác như mỹ phẩm,
dược phẩm, công nghiệp hóa học
- Nhu cầu tăng 2 – 3%/năm
- 90% a. citric được sản xuất bằng pp lên men
42. Acid citric
Sản xuất bằng phương pháp lên men: gồm 03 giai đoạn
- Nuôi cấy giống
- Lên men
- Tinh chế sản phẩm
Sản xuất bằng phương pháp lên men: có 03 cách chính
- Lên men chìm
- Lên men bán lỏng
- Lên men trên môi trường rắn
43. Acid citric
Sản xuất acid bằng phương pháp lên men
Chủng vi sinh vật:
- Aspergillus niger, A. clavatus, A. wentii, Penicillium
luteum, Mucor periformis, A. fumaricus, A. japonicus,
Botrytis cinerea được sử dụng để sản xuất a. citric
- Chủng A. niger
• Hiệu suất cao
• Dễ bảo quản
• Có thể lên men từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền
- Khi sử dụng nấm mốc sản xuất a. citric:
• Nhược điểm: sản phẩm phụ acid iso-citric
44. Acid citric
Nguyên liệu:
- Nguồn carbon: sucrose, glucose, fructose, galactose,
tinh bột, rỉ đường,…
Nguồn carbon Hiệu suất %
Tinh bột 71,5
Glucose 72
Rỉ củ cải đường 64 - 72
Rỉ đường mía 63 - 61,9
Saccarose 72
Đường ngô 79,7
45. Acid citric
Nguyên liệu:
- Nguồn phospho:
• Nồng độ thấp tăng hiệu suất
Tác động trên hoạt tính enzyme, không ảnh
hưởng đến quá trình biểu hiện gen
• Nồng độ cao tạo sản phẩm phụ như a. gluconic
- Nguồn nitơ:
• Muối ammonium, peptone, cao mạch nha,..,
• Acid ammonium giảm pH tăng hiệu suất
• Nồng độ nitơ: 0,1 – 0,4 g/l. Nồng độ nitơ cao
VSV tăng trưởng nhanh, tiêu thụ nhiều đường nhưng
lượng a. citric tạo ra giảm
46. Acid citric
Nguyên liệu:
- Ion kim loại: Cu2+ :150 mg/l, Zn2+: 0,5 mg/l, Mn2+: 3
mg/l
- Rượu: EtOH, MeOH, n-propanol, isopropanol,..
• Bổ sung vào nguyên liệu tinh khiết ức chế
• Bổ sung vào carbohydrate thô kích thích
• Nồng độ: 1 – 5%: tùy thuộc chủng VSV và thành
phần môi trường
48. Acid citric
Điều kiện lên men:
- pH: tùy thuộc chủng VSV
• A. niger, Penicillium sp: pH< 3
• Trichoderma, Sporotrichum: pH 4 – 5
-Độ thông khí:
• Tăng nồng độ oxy tăng hiệu suất
• Nồng độ: 25%
49. Acid citric
Lên men chìm
- 80% a. citric được sản xuất bằng pp này
- Cho môi trường vào các thùng lên men, vô trùng ở 110
– 120 oC
- Làm nguội tới 32 – 34 oC, bổ sung giống bào tử hoặc
dịch nhân giống
- Nuôi ở 32 oC, khuấy và thổi khí liên tục. Thời gian lên
men 6 - 7 ngày
-Thêm CaCO3 vào môi trường để giảm độ acid
- Sau khi kết thúc lên men, dùng H2SO4 để chuyển calci
citrat thành acid citric
50. Acid citric
Lên men bề mặt
- Là pp sản xuất a. citric đầu tiên
- Hiện nay áp dụng để sx qui mô nhỏ
• Dụng cụ lên men là khay nhôm hoặc thép không rỉ
• Buồng lên men được cung cấp khí lọc vô trùng để
đảm bảo độ ẩm, nhiệt độ, tránh ngoại nhiễm (các
nấm men, vi khuẩn lactic, Penicillium)
51. Acid citric
Lên men bề mặt
- Môi trường pha xong được lọc và vô trùng, cấy giống
bào tử, cho lên men trên các khay có lớp môi trường
dày khoảng 2 - 8 cm và có thổi khí đã lọc trên bề mặt
khay, nhiệt độ buồng lên men giữ ở 28 – 32 oC
- Có thể thực hiện qua hai bước có bổ sung đường:
• Nuôi mốc khoảng 48 - 60 giờ trên lớp môi trường 2
- 3 cm tạo thành màng mốc
• Bổ sung vào phía dưới dịch đường 12 - 13% (không
có muối khoáng) nâng lớp môi trường dày tới 8 cm
• Tiếp tục lên men 8 ngày
52. Acid citric
Lên men trên môi trường rắn
- Là pp đơn giản nhất
- Phát triển đầu tiên tại Nhật bản nơi có nhiều các chất
thải nông nghiệp, trái cây, lúa gạo
• Nguyên liệu rắn, độ ẩm ~ 70%, pH 4,5 – 6, nhiệt độ
28 – 30 oC
• Thời gian lên men ~ 4 ngày
53. Acid citric
Thu hoạch acid citric: có 03 cách
- Kết tủa: được sử dụng nhiều nhất
- Chiết tách
- Hấp phụ: dùng nhựa trao đổi ion
54. Acid citric
Thu hoạch acid citric bằng pp kết tủa:
- Tách tế bào
- Tủa acid citric: dịch chứa acid citric hòa tan được tủa
dưới dạng citrate calcium do phản ứng với đá vôi bột
mịn (lime) trong thiết bị tủa. Citrate calcium được thu hồi
khỏi dịch lỏng
- Chuyển citrate calcium trở lại thành acid citric do phản
ứng với sulfuric acid
-Tinh sạch citric acid qua các cột tẩy màu, trao đổi
cation, trao đổi anion và tẩy màu lần cuối
- Kết tinh
56. Đại cương
- Tất cả 20 acid amin đã được bán trên thị trường, nhiều
nhất là acid glutamic, methionin, lysin
• Gluctamic và lysin được sản xuất bằng pp lên men
• Methionin được sx bằng pp tổng hợp hóa học
- Vai trò của acid amin:
• Ngành chăn nuôi gia súc: dinh dưỡng bổ sung
(lysin, methionin, threonin,…)
• Ngành công nghiệp thực phẩm: điều vị
(monosodium glutamic, acid aspartic, …)
• Ngành dược phẩm: thuốc bổ
57. Đại cương
- Acid amin được sản xuất chủ yếu tại Nhật bản, Mỹ,
Trung quốc, châu Âu, Hàn quốc
• Có nguồn gốc từ Nhật bản
• Chiết xuất từ 1 loại tảo biển
• 1908, Kikunae Ikeda (ĐH Tokyo) đã chiết tách
monosodium glutamate (MSG)
MSG đã được sản xuất trên qui mô công nghiệp từ
lúa mì, đậu nành bằng cách thủy phân hiệu quả
kinh tế của phương pháp này không cao
58. Đại cương
Vào năm 1957, Kinoshita và cs đã phân lập từ mẫu
đất vi khuẩn Corynebacterium glutamicum có khả
năng sản xuất một lượng lớn acid glutamic
59. Đại cương
- 03 phương pháp sản xuất acid amin:
1. Phương pháp trích ly các acid amin từ dịch thủy
phân protein (L-cystein, L-cystin, L-leucin, L-
asparagin, L-tyrosin)
2. Phương pháp tổng hợp hóa học (glycin, alanin,
methionin, tryptophan)
3. Phương pháp lên men vi sinh vật
Phương pháp hóa học thường cho hỗn hợp
dạng đồng phân L và D-acid amin
60. Sản xuất acid amin bằng phương pháp lên men
Loại acid
amin
Chủng sử dụng
Năng
suất (g/l)
Nguồn
carbon
Dl-alanin Microbacterium ammoniphilum 60 Glucose
L-alanin Streptomyces coelicolor 3 - 19 9 Glucose
L-arginin Brevibacterium flavum 35 Glucose
L-phenylalanin Corynebacterium glutamicum 9 Glucose
L-glutamic
acid
Corynebacterium glutamicum
Brevibacterium flavum
Arthrobacter paraffineus
>100
98
82
Glucose
Acetat
n-alkans
L-histidin Brevibacterium flavum 10 Glucose
L-leucin Brevibacterium lactofermentum 28 Glucose
L-lysin
Corynebacterium glutamicum
Brevibacterium flavum FA 1 - 30
Brevibacterium flavum
39
57
75
Glucose
Glucose
Acetat
L-methionin Corynebacterium glutamicum 2 Glucose
L-ornithin Corynebacterium glutamicum 26 Glucose
L-prolin Brevibacterium flavum 29 Glucose
L-threonin
Brevibacterium flavum
E. coli K12
E. coli K12
18
27
55
Glucose
Acetat
Đường ăn
L-tryptophan Corynebacterium glutamicum Px 115-97 12 Glucose
L-tyrozin Corynebacterium glutamicum Ps 20 18 Glucose
L-valin Brevibacterium lactofermentum No 487 31 Glucose
Chủng vi sinh vật sản xuất acid amin bằng con đường lên men
61. Acid L- glutamic
Nguyên liệu:
Chủng visinh vật: Corynebacterium glutamicum,
Brevibacterium flavum, B. lactofermentum, B.
thiogenitalis, và Microbacterium ammoniaphilum
- Đặc điểm chung của các chủng này:
• Gram dương
• Không hình thành bào tử
• Không di động
• Cầu khuẩn, hoặc trực khuẩn
• Cần có biotin để phát triển
thuộc giống Corynebacterium
62. Acid L- glutamic
Nguyên liệu:
Nguồn carbon:
• Thường được dùng nhất là glucose, thu được bằng
cách dùng enzym thủy phân tinh bột bắp, khoai tây,
và sắn.
• Rỉ đường phế thải cũng được sử dụng vì rẻ tiền
nhưng chứa một lượng lớn biotin ngăn cản tổng
hợp glutamate
63. Acid L- glutamic
Nguồn nitơ:
• Khí hay dung dịch amoniac, muối sulfat ammonium,
urea
• Khí amoniac còn được dùng để kiểm soát pH quá
trình lên men
Vitamin và dưỡng chất khác: dịch chiết bắp cung cấp
acid amin, khoáng chất, vitamin
64. Acid L- glutamic
Quá trình lên men:
- Thường áp dụng qui trình nuôi cấy liên tục
• Qui trình nuôi cấy theo lô mẻ: tất cả nguyên liệu
cho vào từ đầu nồng độ đường cao hơn ~ 20%
oxy hóa không hoàn toàn đường giảm hiệu
suất
- Qui trình:
• Hoạt hóa giống C. glutamicum
• Nhân giống: 200 – 1.000 l 10.000 – 20.000 l
lên men 50.000 – 500.000 l
65. Acid L- glutamic
- Qui trình:
• Có thể bổ sung acid oleic (0,65 ml/l) để kích thích
xuất glutamate
• Chỉnh pH ~ 8,5 bằng khí amonia, duy trì pH ~ 7,8
suốt quá trình lên men
• Sau 14h, nhiệt độ tăng từ 32 -33 oC lên 38 oC, thời
gian lên men ~ 36h
• Cung cấp glucose với nồng độ 160 g/l
• Sản lượng 100 g/l
67. L- lysine
Đại cương:
- Lysine được dùng để bổ sung thức ăn gia súc
- Sản xuất ~ 400.000 tấn/năm
- Corynebacterium glutamicum đột biến tự dưỡng
homoserine có khả năng sản xuất L- lysine
Điều hòa sinh tổng hợp lysine
68. L- lysine
Qui trình lên men:
Tương tự quá trình lên men L- glutamate
- Nguồn carbon: mật đường, rỉ đường
- Biotin: nếu nồng độ biotin ban đầu thấp bổ sung
lượng 30 μg/l
69. L- threonine
Đại cương:
- Là acid amine cần thiết cho người và động vật được
dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm và thức ăn gia súc
- Sản xuất 13.000 – 14.000 tấn/năm
- Được sản xuất từ chủng E. coli tái tổ hợp, có khả năng
đề kháng chất tương tự L- threonin là α-amino-β-
hydroxyvaleic acid (AHV)
71. L- aspartic
- Được dùng trong dược phẩm, thực phẩm
- Từ 1973, L- aspartic đã được sản xuất bằng pp nuôi
cấy cố định tế bào E. coli tái tổ hợp trên các giá mang
polyacrylamide, polyurethane
- Aspartic được sản xuất từ fumarate và amonia, do
enzyme aspartase xúc tác, pH 8,5
72. L- alanine
- L-alanine được dùng trong dịch truyền dinh dưỡng,
chất phụ gia có vị ngọt và tác dụng kiềm khuẩn
- L-alanine được tạo ra từ L-aspartate bằng phương
pháp một giai đoạn sử dụng enzyme aspartate β-
decarboxylase
L-aspartate L-alanine + CO2
Aspartate β- d e c a r b o x y l a s e
73. L- alanine
- Vi khuẩn Pseudomonas dacunhae được chọn làm
chủng vi khuẩn sử dụng trong sản xuất L-alanine vì có
hoạt tính aspartate β-decarboxylase cao
• L-alanine được sản xuất bằng cách cố định P.
dacunhae trên K-carageenan
• Các vi khuẩn sau khi cố định được nhồi vào cột
Quá trình được tiến hành ở áp suất cao, ngăn ngừa
khí carbonic thoát ra
• Cột này được nối tiếp với hệ thống sản xuất L-
aspartate sản xuất L-alanine trực tiếp từ
fumarate
74. - Tuy nhiên trong hệ thống này, phản ứng phụ gây ra bởi
fumarase và alanine racemase ở cả hai vi khuẩn E. coli
và P. dacunhae tạo sản phẩm phụ malate và D-
alanine giảm hiệu suất
Các enzym này bị bất hoạt bằng cách xử lý riêng tế
bào hai vi khuẩn ở nhiệt độ cao và pH thấp
L- alanine
L-aspartate L-alanine + CO2
Aspartate β- d e c a r b o x y l a s e
Fumarate + NH3
aspartase
malate D-alanine
75. L- cystein
- L-cystein được dùng làm hóa chất, dưỡng tóc, chất
phụ gia thực phẩm
- L-cystein có thể sản xuất :
• Chiết xuất lông tóc
• Bằng enzyme từ L-cysteine từ DL-2-amino-Δ2-
thiazoline-4-carboxylate (DL-ATC)
• Vi khuẩn Pseudomonas thiazolinophilum
76. L- cystein
- Sản xuất L-cystein bằng enzyme DL-ATC racemase, L-
ATC hydrolase, S-carabamoyl-L-cysteine (SCC)
hydrolase
S-carabamoyl-L-cystein L-cystein
SCC hydrolase
L-ATC
L-ATC hydrolase
D-ATC
ATC racemase
77. L- cystein
- P. thiazolinophilum có khả năng sản xuất L-cystein từ
DL-ATC
- Thêm Fe2+ và Mn2+ vào môi trường tăng hoạt tính
enzyme
- Thêm hydroxylamine (chất ức chế các enzyme phụ
thuộc vitamin B6) ngăn cản sự thoái hóa L- cystein do
ức chế cysteine desulfhydrase
Vi khuẩn đột biến thiếu enzym này được dùng để sản
xuất L- cystein
- L-cystein tạo ra bị oxi hóa thành L-cystine do sự thông
khí trong quá trình phản ứng và kết tủa ở dạng tinh thể
78. L- DOPA
- L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) là tiền chất
của chất trung gian dẫn truyền thần kinh dopamine
- Được dùng trong điều trị bệnh Parkinson, bệnh do sự
thiếu hụt dopamin trong não
- L-DOPA được sản xuất khoảng 250 tấn/năm
- Phương pháp sản xuất:
• Phương pháp hóa học: gồm 8 giai đoạn phản ứng
• Phương pháp dùng enzym là phương pháp một giai
đoạn đơn giản và kinh tế nhất
79. L- DOPA
- L- DOPA được sản xuất từ pyrocathechol, pyruvate và
ammonia bằng phản ứng enzym một giai đoạn sử dụng
tyrosine phenol-lyase
Pyrocatechol + pyruvate + NH3 L-DOPA
Tyrosine phenol-lyase
• Tyrosine phenol-lyase (TPL) là enzym phụ thuộc
pyridoxal 5’-phosphate
• TPL xúc tác quá trình thoái hóa tyrosine thành phenol,
pyruvate và amonia. Đây là phản ứng thuận nghịch
khi thay pyrocatechol cho phenol trong phản ứng
nghịch tạo ra L- DOPA.
80. L- DOPA
- Vi khuẩn Erwinia herbicola có hoạt tính cao TPL được
dùng để sản xuất L-DOPA
- E. herbicola được nuôi cấy ở 28 oC, 28h trong môi
trường chứa 0,2% L-tyrosine, 0,2% K2HPO4 và 0,1%
MgSO4.7H2O (pH 7,5).
• Bổ sung cao nấm men, cao thịt, polypepton, và dịch
thủy phân protein đậu nành gia tăng sự phát
triển tế bào cũng như sự hình thành TPL
• Thêm glucose, pyruvate, và α-ketoglutarate với
nồng độ cao ức chế dị dưỡng sinh tổng hợp TPL
81. L- DOPA
- Nguồn carbon thích hợp cho sự phát triển của tế bào
cũng như sự tích tụ enzyme là glycerol.
• Lượng enzyme gia tăng đáng kể khi glycerol được
cho vào môi trường cùng với succinate, fumarate
hoặc maleate.
• TPL là enzyme cảm ứng thêm L-tyrosine sẽ kích
thích tạo thành enzyme.
• L-phenylalanine không phải là chất cảm ứng cho
sinh tổng hợp TPL nhưng có tác dụng hiệp lực với
L-tyrosine hoạt tính TPL tăng lên 5 lần khi thêm
L-phenylalanine và L-tyrosine vào môi trường
82. D-p-Hydroxyphenylglycine
- D-p-Hydroxyphenylglycine (D-HPG) là nguyên liệu đầu
trong bán tổng hợp các penicillin và cephalosporine
(amoxcillin, cephadoxel)
- D-HPG được sản xuất từ DL-p-
hydroxyphenylhydantoin (DL-HPH) bằng pp enzyme hai
giai đoạn:
• DL-HPH được tổng hợp từ sự amidoalkyl hóa
phenol
• DL-HPH được thủy phân hoàn toàn thành N-
carbamoyl-D-p-HPG bằng hydantoinase của VK
• N-carbamoyl-D-p-HPG sau đó được thủy phân tạo
D-HPG bằng N-carbamoyl-D-p-HPG hydrolase của
VK
83. D-p-Hydroxyphenylglycine
N-carbamoyl-D-p-HPG
D-p-OH-phenylhydantoin
hydantoinase
Racemic hóa tự nhiên
L-p-OH-phenylhydantoin
D-carbamoylase
D-p-HPG
- D-hydantoin hydrolase hoạt tính cao được tìm thấy ở
các vi khuẩn thuộc họ Bacillus, Pseudomonas,
Aerobacter, Agrobacterium, Corynebacterium và các xạ
khuẩn thuộc chi Streptomyces, Actinoplanes
- D-carbamylase hoạt tính cao được tìm thấy ở vi khuẩn
thuộc chi Agrobacterium, Pseudomonas, Comamonas,
và Blastobacter
- Gen mã hóa hai enzym này được tạo dòng và chuyển
vào E. coli dùng làm nguồn cung cấp enzym
84. Hydroxy-L-Proline
- 4-Hydroxy-L-proline được dùng làm nguyên liệu đầu
trong tổng hợp hóa học bất đối, nguyên liệu sản xuất
thuốc, mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm
- Trans-4-Hydroxy-L-Proline hay cis-3-hydroxy-L-Proline
được sản xuất từ L-proline do enzym L-proline 4-
hydrolase hay 3-hyrolase
2-Oxoglutarate được cung cấp khi thêm glucose
vào hỗn hợp phản ứng
L-Pro + 2-oxo-glutarate + O2
4-hydroxylase
4-OH-Pro + succinate + CO2
L-Pro + 2-oxo-glutarate + O2
3-hydroxylase
3-OH-Pro + succinate + CO2
85. Hydroxy-L-Proline
- L-Proline 4-hydroxylase được tìm thấy ở các xạ khuẩn
tạo etamycin thuộc chi Streptomyces,
Dactylosporangium, Amycolatopsis
- L-Proline 3-hydrolase được tìm thấy ở các xạ khuẩn
tạo telomycin thuộc họ Streptomyces, và vi khuẩn thuộc
chi Bacillus
- Các gen của proline hydrolase được tạo dòng trên E.
coli cung cấp proline hydrolase cho công nghiệp sản
xuất L-hydroproline
87. Đại cương
- Vitamin là chất chuyển hóa sơ cấp giữ vai trò quan
trọng trong các quá trình trao đổi chất của cơ thể sống,
dưới dạng các coenzym
- Vitamin được sản xuất bằng các phương pháp:
• Chiết xuất từ động vật, thực vật
• Tổng hợp hoặc bán tổng hợp hóa học
• Tổng hợp bằng vi sinh vật hoặc kết hợp pp hóa học
- Phần lớn vitamin được tổng hợp hoặc bán tổng hợp
bằng phương pháp hóa học
- Các vitamin tổng hợp bằng phương pháp vi sinh:
vitamin B12, vitamin B2 (riboflavin)
88. Vitamin B12
Đại cương
-Năm 1948, vitamin B12 (5,6-dimethylbenzilmidazol
cobamid cyanid hoặc 5,6- dimethylbenzimidazol
cyanocobamid hoặc cobalamin, cobamide) được Rickes
và cs phân lập từ gan động vật
- Vitamin B12 kết tinh màu đỏ sẫm, không mùi vị, tan
trong nước, trong các dung dịch trung tính, trong cồn,
không tan trong ether, benzen… Bền trong môi trường
acid, chịu được tác động ánh sáng trong môi trường
kiềm, trong môi trường có kim loại nặng bị phân hủy
nhanh chóng
- Vai trò: sử dụng điều trị bệnh thiếu máu
89. Vitamin B12
Phân tử gồm 2 phần:
- Phần mang màu cấu trúc giống
porphirin, có chứa nguyên tố
cobalt
- Phần ribonucleotid với gốc base
nhân purine là 5,6-
dimethylbenzimidazol. Nếu thay
phần base này bằng các base
khác sẽ được các dẫn chất gần
với vitamin B12 nhưng không có
tác dụng sinh học
90. Vitamin B12
-Trước đây, vitamin B12 được chiết từ gan động vật (~
10 mg/1 tấn gan)
- Hiện nay, vitamin B12 được sản xuất chủ yếu bằng con
đường lên men vi sinh vật Propionibacterium shermanii
ATCC 13673, Propionibacterium freudenreichii ATCC
6207 hay Pseudomonas denitrificans. Các vi khuẩn này
chứa một lượng lớn vitamin B12
91. - Ngoài ra trong quá trình lên men streptomycin bằng xạ
khuẩn Streptomyces griseus và lên men
chlorotetracyclin bằng S. aureofaciens cũng cho sản
phẩm phụ là vitamin B12 (~ 2 mg/l)
- Quá trình lên men bã rượu cũng thu được sản phẩm
giàu vitamin B12 dùng cho mục đích chăn nuôi
Vitamin B12
92. Lên men vitamin B12 bằng P. shermanii
- Vi khuẩn P. shermanii: tăng trưởng mạnh ở pH 4,5 -
7,5 nhưng tạo vitamin B12 nhiều nhất ở 5,8 – 7,5. Nhiệt
độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp vitamin là
28 – 30 oC
- Các bước chủ yếu trong quá trình tạo vitamin B12:
• Tạo porphyrin
• Gắn phần ribonucleotid vào
93. - Lên men:
• Vitamin B12 là coenzym của nhiều enzym trong quá
trình sinh tổng hợp nucleotid và tham gia vào các
quá trình xảy ra trong giai đoạn sinh trưởng của tế
bào vitamin B12 được tạo thành cùng với sự gia
tăng sinh khối của vi khuẩn
• P. shermanii: nuôi cấy kỵ khí ~ 3 ngày, bổ sung tiền
chất dimethybenzimidazole ngăn cản tổng hợp
vitamin B12 tích tụ các chất trung gian giai
đoạn nuôi cấy hiếu khí và thêm
dimethybenzimidazole để biến đổi thành vitamin
Lên men vitamin B12 bằng P. shermanii
94. Lên men vitamin B12 bằng P. shermanii
Nguyên liệu
- Nguồn cacbon: glucose, cao ngô
- Nguồn nitơ: amoni sulphat
- Các chất khác :
• Muối cobalt (3-5 g /l) tăng hiệu suất
• Sắt, kẽm, sulphat mangan ức chế sinh tổng hợp
vitamin B12
• Vitamin có tác dụng kích thích tăng trưởng và tăng
hiệu suất sinh tổng hợp: thiamin, biotin, acid
nicotinic, acid folic…
• 5,6- dimethylbenzimidazole (1-10 mg/l) tăng tạo
vitamin B12
95. Lên men vitamin B12 bằng P. shermanii
Điều kiện lên men:
-pH:
• pH của môi trường nhân giống và lên men ~ 6,8-7
• Trong quá trình lên men điều chỉnh pH bằng
CaCO3, NH4OH
• pH tối ưu cho tăng trưởng và tạo vitamin ~ 6,3-7,5
-Oxy:
• 3 ngày đầu tạo môi trường kỵ khí vì nếu 50 giờ đầu
hiếu khí giảm sinh khối và hiệu suất tổng hợp
• 3-4 ngày sau thổi khí nhẹ
- Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu cho sự lên men là 28-30 oC,
giới hạn tối đa cho sự sinh tổng hợp là 32 oC
96. Lên men vitamin B12 bằng P. shermanii
Tách sản phẩm:
- Ly tâm 10.000 vòng/ phút
- Sấy khô sinh khối ở 80-120 oC trong 10-30 phút ở pH
6,5-8,5
- Tán nhỏ thu dạng chế phẩm thô giàu vitamin (> 1.000
mcg/g) dùng cho chăn nuôi
- Hoặc hòa tan, với sự hiện diện của KCN và sodium
nitrite, cobalamine thu được ban đầu sẽ chuyển thành
cyanocobalamine (vitamin B12) tinh khiết cao
97. Riboflavin
Đại cương:
- Năm 1933, Kulm chiết riboflavin (vitamin B2) từ trứng
- Là thành phần của flavinase, một enzym có trong tất
cả các tế bào, tham gia vào quá trình dinh dưỡng và hô
hấp của sinh vật
- Có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi hydrat
cacbon, lipid và protein
- Phân tử riboflavin cấu tạo từ 3
nhân isoaloxazin và 1 phân tử
đường ribose
98. Riboflavin
Đại cương:
- Sản xuất riboflavin:
• Phương pháp hóa học
• Phương pháp lên men:
o Nấm Eremothecium ashbyii: ký sinh trên thực
vật
o Nấm Ashbyi gossypii: ký sinh ở nụ bông, café,
chanh, cà chua
99. Sản xuất riboflavin bằng phương pháp lên men
Vi sinh vật: Eremothecium ashbyii, Ashbyi gossypii
Nguyên liệu:
- Nguồn carbon: glucose, saccarose, levulose,
mannose, ngoài ra có thể dùng maltose, glycerin…, trên
môi trường tinh bột lượng vitamin sinh ra ít.
Phối hợp với maltose hiệu suất sinh tổng hợp cao
nhất, vi sinh vật chậm già hơn sử dụng 1 đường glucose
100. Sản xuất riboflavin bằng phương pháp lên men
- Nguồn nitơ: có thể là các hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ
• Tốt nhất là các protein động vật giàu chất keo,
casein, globulin
• Glycin: thêm 0,1% glycin tăng hiệu suất lên 33%.
• Dịch tự phân nấm men, nước chiết đậu, lòng trắng
trứng, cao thịt,…
• Các nguồn nitơ vô cơ cho sinh khối phát triển tốt
nhưng hiệu suất sinh tổng hợp vitamin thấp
101. Sản xuất riboflavin bằng phương pháp lên men
- Các chất tăng trưởng:
• Thiamin, biotin có ảnh hưởng rõ tới sự sinh
tổng hợp
• Dịch thủy phân men, nước chiết mầm lúa
kích thích tăng trưởng
• Pyrimidin và purin có trong môi trường có tác
dụng như tiền chất của riboflavin.
• Xanthin, guanin, adenin, acid uric hypoxanthin
nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp.
• Uraxin, Fe có tác dụng kìm hãm sự sinh tổng
hợp
102. - Lipid:
• Đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp
vitamin, thay thế một phần nguồn cacbon
• Bổ sung 0,6 -1,2% chất béo tăng hiệu suất
gấp đôi
Sản xuất riboflavin bằng phương pháp lên men
103. Lên men vitamin B2 bằng nấm E . ashbyii
- Quá trình lên men
• Phương pháp lên men bề mặt
• Phương pháp lên men chìm hiệu suất cao
- Điều kiện nuôi cấy:
• 5% saccharose , 3% dịch thủy phân protein, 0,3%
cao thịt, 1% mầm lúa mì, 0,35 KH2PO4, 0,25% NaCl
• pH ban đầu là 6
• Nhiệt độ duy trì ở 28 oC- 30 oC
• Tỷ lệ giống cấy vào là 10%
• Thời gian lên men là 7 ngày
• Hiệu suất 1.800 mcg/l
104. Lên men vitamin B2 bằng nấm A. gossypii
- Điều kiện lên men
• Môi trường lên men chứa 2% glucose, 2% cao
ngô, bổ sung ion Fe từ máu động vật (1%)
• Nhiệt độ để tạo thành riboflavin là 26-28 oC
• pH lên men ban đầu ~ 6 -7. Nếu pH đầu là 4,5 -5,5
nấm phát triển tốt nhưng không tốt cho sinh
tổng hợp riboflavin
• Tỷ lệ giống cấy vào là 1%
• Quá trình lên men ~ 4 - 5 ngày, sục khí
• Hiệu suất: 500-600 mcg /ml
105. Thu hoạch riboflavin
- Chỉnh pH ~ 4,5
- Đun môi trường nuôi cấy sau khi kết thúc ở 60 oC
trong 3 giờ với bacterial alkaline protease
- Giảm nhiệt độ về 25 oC và pH 7
- Ly tâm thu sản phẩm thô
Sản xuất riboflavin bằng phương pháp lên men
106. Vitamin C
Đại cương:
- Năm 1928, nhà sinh hóa người Hungaria A. Szent-
Gryorgyi lần đầu phân lập được
- Vai trò: sử dụng nhiều trong ngành dược, hóa học,
công nghệ thực phẩm
• Thiếu vitamin C ảnh hưởng đến nhiều quá trình
chuyển hóa trong cơ thể, đặc biệt ở tế bào gan như
tổng hợp collagen, acid amin, đáp ứng miễn dịch
107. Vitamin C
Đại cương:
- Trong tự nhiên, vitamin C có 02 dạng:
• Dạng khử (ascorbic acid)
• Dạng oxy hóa (dehydro ascorbic acid)
• Ascorbic acid dạng khử hay oxy hóa có thể chuyển
đổi qua lại dưới tác dụng chất oxy hóa-khử
Nhưng khi có sự hiện diện chất kiềm 2,5-
diketogluconic acid (2,5-DKG) không có hoạt
tính điều trị bệnh do thiếu vitamin C
109. Vitamin C
Sản xuất: 02 phương pháp
- Phương pháp vi sinh vật: qua nhiều giai đoạn với
nhiều vi sinh vật khác nhau
- Phương pháp bán tổng hợp: biến đổi 2-keto-L-gluconic
acid (2-KLG) acid ascorbic
• D-glucose L-sorbose (Acetobacter, Alcaligenes,
Aerobacter, Azotobacter, Pseudomonas, Serratia và
Xanthomonas)
• Oxy hóa sinh học chuyển L-sorbose thành 2-KLG
(Gluconobacter melanogenus IFO 3293 hoặc
Pseudomonas aeroginosa IFO 3839)
• Sản phẩm tiết ra trong môi trường nuôi cấy hoặc
trong tế bào vi sinh vật
110. Vitamin C
Tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp
Erwinia herbicola
ATCC 31626
D-glucose
2,5-diketo-D-gluconic
acid (2,5-DKG)
2-keto-L-gulonic acid
(2-KLG)
Corynebacterium sp.
(ATCC 31090)
Erwinia
herbicola tái tổ
hợp
