Covid -19 Varianti e vaccini

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Articolo
Prove di fuga della variante B.1.351 di SARS-
CoV-2 dai sieri naturali e vaccinali
Astratto grafico
In evidenza
d Ridotta neutralizzazione di B.1.351 da parte di mAbs e sieri
indotti dai primi isolati di SARS-CoV-2
d B.1.351 titolo di neutralizzazione ridotto da 8 a 9 volte per
i vaccinati Pfizer e AstraZeneca
d E484K, K417N e N501Y causano una diffusa fuga dai
mAbs
d La delezione NTD in B.1.351 abroga la neutralizzazione
da parte di un potente mAb umano neutralizzante
Autori
Daming Zhou, Wanwisa Dejnirattisai,
Piyada Supasa, ..., Jingshan Ren,
David I. Stuart, Gavin R. Screaton
Corrispondenza
jmongkol@well.ox.ac.uk (J.M.),
ren@strubi.ox.ac.uk (J.R.),
dave.stuart@diamond.ac.uk (D.I.S.),
gavin.screaton@medsci.ox.ac.uk (G.R.S.)
In breve
L'analisi struttura-funzione della variante
B.1.351 del CoV-2 della SARS
utilizzando campioni di siero di individui
convalescenti e vaccinati rivela come le
mutazioni nella proteina spike virale
risultino in un legame più stretto con il
recettore ACE2 e consentano di sfuggire
alla neutralizzazione dell'anticorpo
monoclonale.
Zhou et al., 2021, Cell 189, 1-14
29 aprile 2021ª2021 L'autore/i. Pubblicato da Elsevier Inc.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037 ll

Si prega di citare questo articolo in stampa come: Zhou et al., Prove di fuga di SARS-CoV-2 variante B.1.351 da sieri naturali e
vaccinati, Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037
ll
ACCESSO APERTO
Articolo
Prove di fuga della variante B.1.351 di SARS-CoV-2 dai
sieri naturali e vaccinali
Daming Zhou,1,21 Wanwisa Dejnirattisai,2,21 Piyada Supasa,2,21 Chang Liu,2,3,21 Alexander J. Mentzer,2,4,21
Helen M. Ginn,20 Yuguang Zhao,1 Helen M.E. Duyvesteyn,1 Aekkachai Tuekprakhon,2 Rungtiwa Nutalai,2 Beibei
Wang,2 Guido C. Paesen,1 Cesar Lopez-Camacho,2 Jose Slon-Campos,2 Bassam Hallis,5 Naomi Coombes,5 Kevin
Bewley,5 Sue Charlton,5 Thomas S. Walter,2 Donal Skelly,4,6,7 Sheila F. Lumley,4,8 Christina Dold,9,10 Robert Levin,11
Tao Dong,3,8,12 Andrew J. Pollard,9,10 Julian C. Knight,2,3,4,9 Derrick Crook,8 Teresa Lambe,13 Elizabeth Clutterbuck,9,10
Sagida Bibi,9,10 Amy Flaxman,13 Mustapha Bittaye,13 Sandra Belij-Rammerstorfer,13 Sarah Gilbert,13 William James,14
Miles W. Carroll,2,5 Paul Klenerman,4,6,9,15 Eleanor Barnes,4,6,9,15 Susanna J. Dunachie,4,6,8,16,17 Elizabeth E. Fry,1
Juthathip Mongkolsapaya,2,3,18,* Jingshan Ren,1,* David I. Stuart,1,3,19,20,22,* e Gavin R. Screaton2,3,*
1Divisione di Biologia Strutturale, Dipartimento Nuffield di Medicina, Università di Oxford, The Wellcome Centre for Human Genetics, Oxford,
UK 2Wellcome Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, Università di Oxford, Oxford, UK
3Accademia cinese delle scienze mediche (CAMS), Istituto di Oxford (COI), Università di Oxford, Oxford, Regno Unito
4Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, Oxford, Regno Unito
5National Infection Service, Public Health England (PHE), Porton Down, Salisbury, UK
6Peter Medawar Building for Pathogen Research, Oxford, Regno Unito
7Dipartimento Nuffield di Neuroscienze Cliniche, Università di Oxford, Oxford, Regno Unito
8Dipartimento di Medicina di Nuffield, Università di Oxford, Oxford, Regno Unito
9NIHR Oxford Biomedical Research Centre, Oxford, Regno Unito
10Oxford Vaccine Group, Dipartimento di Pediatria, Università di Oxford, Oxford, Regno Unito
11Worthing Hospital, Worthing, Regno Unito
12MRC Human Immunology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford,
Oxford, UK
13Jenner Institute, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, Oxford, UK 14Sir
William Dunn School of Pathology University of Oxford, Oxford, UK 15Translational
Gastroenterology Unit, University of Oxford, Oxford, UK
16Centro di Medicina Tropicale e Salute Globale, Dipartimento di Medicina Nuffield, Università di Oxford, Oxford, Regno Unito
17Mahidol-Oxford Tropical Medicine Research Unit, Bangkok, Thailandia
18Siriraj Center of Research Excellence in Dengue & Emerging Pathogens, Dean Office for Research, Faculty of Medicine Siriraj Hospital,
Mahidol University, Thailandia
19Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, Didcot, UK
20Instruct-ERIC, Oxford House, Parkway Court, John Smith Drive, Oxford, UK
21Questi autori hanno contribuito in egual misura
22Contatto principale
*Corrispondenza: jmongkol@well.ox.ac.uk (J.M.), ren@strubi.ox.ac.uk (J.R.), dave.stuart@diamond.ac.uk (D.I.S.),
gavin.screaton@medsci. ox.ac.uk (G.R.S.)
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037
SOMMARIO
La corsa alla produzione di vaccini contro il coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS -
CoV-2) è iniziata quando è stata pubblicata la prima sequenza, e questa costituisce la base dei vaccini
attualmente impiegati a livello globale. Di recente sono stati segnalati lignaggi dipendenti della SARS-
CoV-2: Regno Unito, B.1.1.7; Sudafrica, B.1.351; e Brasile, P.1. Queste varianti hanno cambiamenti
multipli nella proteina spike immunodominante che facilita l'ingresso delle cellule virali attraverso il
recettore dell'enzima di conversione dell'angiotensina-2 (ACE2). Le mutazioni nel sito di riconoscimento
del recettore sullo spike sono di grande preoccupazione per il loro potenziale di fuga immunitaria. Qui,
descriviamo un'analisi struttura-funzione di B.1.351 usando una grande coorte di campioni di siero di
convalescenti e vaccinati. Le mutazioni del dominio recettore-legante forniscono un legame più stretto
all'ACE2 e una diffusa fuga dalla neutralizzazione degli anticorpi monoclonali in gran parte guidata da
E484K, anche se K417N e N501Y agiscono insieme contro alcune importanti classi di anticorpi. In un
certo numero di casi, sembrerebbe che il siero convalescente e alcuni vaccini offrano una protezione
limitata contro questa variante.
INTRODUZIONE
I rapporti di una sindrome respiratoria acuta grave (SARS)
sono emersi nel dicembre 2019, con casi e morti in rapido
aumento in
Wuhan, Cina. Il virus, SARS-coronavirus 2 (CoV-2) è stato
rapidamente identificato, con la sequenza pubblicata nel
gennaio 2020 (Lu et al., 2020), e la malattia che ha causato
successivamente denominata malattia da coronavirus 2019
(COVID-19). Il SARS-CoV-2 è stato

Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021 ª 2021 Gli autori. Pubblicato da Elsevier Inc. 1
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si stima che abbia infettato almeno 118 milioni di persone, con
2,6 milioni di morti in tutto il mondo
(https://www.worldometers.info/ coronavirus).
Uno sforzo scientifico globale senza precedenti è stato
condotto da più aziende farmaceutiche e laboratori accademici
per produrre vaccini contro la SARS-CoV-2
(https://www.who.int/ publications/m/item/draft-landscape-of-
covid-19-candidate-va ccines), visto da molti come l'unico
modo realistico per liberare le popolazioni dalle dure misure di
isolamento sociale attuate in molti paesi e dal conseguente
grave dissesto economico (Keogh-Brown et al., 2020). Sono
stati sviluppati molti candidati vaccinali, tutti volti a generare
risposte anticorpali (e delle cellule T) contro la proteina spike
del SARS-CoV-2. Questi sono stati sviluppati utilizzando
sequenze di spike derivate dal primo ceppo di Wuhan e
comprendono proteine ricombinanti, virus inattivati, RNA e
piattaforme vettoriali virali (Krammer, 2020). Con prove
accelerate, i primi risultati di efficacia sono stati forniti circa 10
mesi dopo la prima pubblicazione della sequenza di SARS-
CoV-2 (Polack et al., 2020; Voysey et al., 2021a; Baden et al.,
2021).
Risultati impressionanti sono stati ora riportati da una varietà
di produttori: Novavax-recombinant spike e Janssen-
adenoviral-vectored vaccini hanno recentemente riportato
buona efficacia
(https://www.novavax.com/sites/default/files/2021-02/
20210202-NYAS-Novavax-Final.pdf; https://www.medscape.
com/viewarticle/944933), mentre i vaccini Moderna-RNA,
Pfizer/Bio- NTech-RNA, e Oxford-AstraZeneca-chimp
adenoviral- vectored hanno già ricevuto l'autorizzazione all'uso
di emergenza (EUA) in un certo numero di paesi e saranno
distribuiti su larga scala nel 2021.
Nelle ultime settimane, ci sono state segnalazioni di ceppi
variegati di SARS-CoV-2 che emergono in diverse parti del
mondo.
B.1.1.7 è stato identificato per la prima volta nel Regno Unito
da un campione ottenuto nell'ottobre 2020, B.1.351 è stato
identificato nell'ottobre 2020 in Sud Africa, e P.1 è stato
identificato in Brasile nel dicembre 2020
(https://www.cogconsortium.uk/wp-content/uploads/2021/01/
Report-2_COG-UK_SARS-CoV-2-Mutations.pdf). Questi ceppi
varianti hanno raccolto cambiamenti multipli (delezioni e
sostituzioni) nella proteina spike, 9 in B.1.1.7, 10 in B.1.351, e
12 in P.1, rispetto alla sequenza di Wuhan. Le più preoccupanti
sono le mutazioni nel dominio di legame al recettore (RBD)
della proteina spike. L'RBD è contenuto nella subunità S1 di
spike ed è responsabile dell'interazione con il recettore cellulare
SARS-CoV-2 dell'enzima di conversione dell'angiotensina-2
(ACE2) (Hoffmann et al., 2020). La superficie di interazione di
ACE2 della RBD è una zona relativamente piccola di 25
amminoacidi sulla punta della RBD (Shang et al., 2020), e a
causa del suo ruolo cruciale nell'attacco virale, è anche il sito di
legame di molti potenti anticorpi neutralizzanti (Cerutti et al.,
2021). Si pensa che il blocco dell'interazione RBD-ACE2 svolga
un ruolo importante nella protezione naturale e indotta dai
vaccini dall'infezione da SARS-CoV-2. Un certo numero di tali
anticorpi monoclonali (mAbs) sono stati combinati in cocktail
che sono in sperimentazione avanzata per il trattamento e la
profilassi della SARS-CoV-2 (Yang et al., 2020).
La superficie legante ACE2 è in qualche misura il tallone
d'Achille del virus, poiché può essere bloccata da alcuni
anticorpi neutralizzanti; tuttavia, poiché è così piccola, minaccia
anche la fuga immunitaria, poiché piccoli cambiamenti possono
far saltare gli anticorpi neutralizzanti, quindi

riducendo la capacità dell'immunità naturale o acquisita
tramite vaccino di contenere la replicazione virale. La
pressione selettiva per i cambiamenti nella superficie di
interazione dell'ACE2 può quindi avere due motori
completamente separati. In primo luogo, poiché la SARS-CoV-
2 ha recentemente attraversato una barriera zoonotica, ci si
può aspettare che l'evoluzione della superficie di interazione di
ACE2 possa avvenire per aumentare l'affinità con ACE2 e
quindi aumentare la trasmissibilità virale. In secondo luogo, al
contrario, i cambiamenti della superficie di interazione di ACE2
possono anche ridurre la protezione offerta da precedenti
infezioni o vaccinazioni, portando potenzialmente alla fuga
dall'immunità preesistente indotta dall'infezione naturale o dai
vaccini.
Tutti e tre i ceppi di SARS-CoV-2 recentemente identificati
hanno acquisito mutazioni nella superficie di interazione ACE2
della RBD: N501Y in B.1.1.7; K417N, E484K, e N501Y in
B.1.351; e
K417T, E484K e N501Y in P.1. Tutte e tre le varianti possono
portare ad un aumento della trasmissibilità, con buone prove
per questo con
B.1.1.7 nel Regno Unito. Questi si sono rapidamente espansi
fino a diventare i ceppi dominanti nelle regioni in cui sono stati
identificati per la prima volta e la diffusione globale, in
particolare per B.1.1.7 e B.1.351, sta causando notevole
preoccupazione.
Qui esaminiamo la neutralizzazione di un isolato virale
B.1.351 e la confrontiamo con la neutralizzazione di Victoria
(SARS-CoV-2/human/ AUS/VIC01/2020), un primo isolato
legato a Wuhan. I test di neutralizzazione vengono eseguiti su
un ampio pannello di mAbs (Dejnirattisai et al., 2021), sieri di
convalescenti dei primi tempi della pandemia, sieri di pazienti
affetti da B.1.1.7, e infine sieri di destinatari dei vaccini Oxford-
AstraZenca e Pfizer-BioNTech. C'è l'evidenza di una diffusa
fuga dai mAbs, di cui forniamo una descrizione strutturale e
biofisica. La neutralizzazione di B.1.351 da parte dei sieri di
individui infettati naturalmente o vaccinati è significativamente
ridotta, portando in alcuni casi a una completa incapacità di
neutralizzare il virus B.1.351.
RISULTATI
Cambiamenti mutazionali in B.1.351 Sono stati descritti diversi
isolati di B.1.351, tutti con le mutazioni chiave K417N, E484K e
N501Y nella RBD. Tegally et al. (2021) hanno riportato un
isolato che contiene 10 cambiamenti rispetto alla sequenza di
Wuhan: L18F, D80A, D215G, L242-
244 eliminate, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G, e
A701V. Il sequenziamento del ceppo usato in questo rapporto,
da un caso nel Regno Unito, mostra solo 8 cambiamenti e
manca L18F e R246I rispetto all'isolato di Tegally et al. (2021).
Le sequenze del genoma di Coronavi- rus sono state
analizzate sia nel Regno Unito, acquisite dal database COVID-
19 Genomics UK (COG-UK) (Tatusov et al., 2000), che in Sud
Africa, acquisite dalla Global Initiative on Sharing Avian
Influenza Data (GISAID) (https://www.gisaid. org). Sembra che
B.1.1.7 e B.1.351 siano diventati rapidamente dominanti nel
Regno Unito e in Sud Africa, rispettivamente. Nell'evoluzione
sia della variante B.1.1.7 nel Regno Unito che della
La variante B.1.351 in Sudafrica, una popolazione sostanziale
di mutanti di sola delezione del dominio N-terminale (NTD)
(D69-70 in B.1.1.7 e D242-244 in B.1.153), e mutanti di sola
N501Y sono stati osservati in entrambi i paesi prima della
crescente dominanza di ceppi che ospitano sia delezioni che
501Y (Figure 1A e 1B). I conteggi di entrambe le varianti
''single-mutant'' sono poi diminuiti. Le mutazioni caratteristiche
per B.1.351 come trovate in Sud Africa
2 Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021

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Figura 1. Evoluzione della variante B.1.351
(A e B) Finestra scorrevole di 7 giorni che mostra
la proporzione di sequenze con wild-type (grigio),
solo mutazione 501Y (verde), solo delezione
NTD (viola), e variante a doppia mutazione (nero)
per (A) sequenze selezionate contenenti UK,
delezione NTD 69-70 e
(B) Sudafrica, cancellazione NTD 241-243.
(C) Grafico della struttura che mostra la
distribuzione delle mutazioni delle sequenze di
varianti sudafricane definite da N501Y e dalla
delezione 241-243; le mutazioni puntuali sono
segnate in giallo e le delezioni in grigio scuro. I
grafici della struttura usano la struttura della
proteina spike (struttura originale dal PDB: 6ZWV)
dove è stata modellata, e i modelli sono stati
estesi in Coot per i loop mancanti.
(D) Le posizioni dei principali cambiamenti nella
proteina spike sono evidenziate nella NTD e nella
RBD.
(E) Posizioni delle mutazioni K417N, E484K, e
N501Y (giallo-basso) all'interno della superficie di
interazione con ACE2 (verde scuro) di RBD. La
vista è scelta per chiarezza ed è correlata a
quella mostrata in (C) da una rotazione di 45○
intorno all'asse che esce dalla pagina (per
rendere la RBD verticale rispetto a C) e una
rotazione di quasi 180○ intorno all'asse lungo del
dominio RBD.
(F) Una rappresentazione lineare del picco
B.1.351 con i cambiamenti segnati. Si noti che il
ceppo utilizzato in questo rapporto non ha
mutazioni L18F e R246I.
sono mostrati nelle figure 1C-1E. Inoltre, al 2 febbraio 2021, nel
database COG-UK, 21 delle sequenze B.1.1.7 sono state
osservate per aver acquisito indipendentemente la mutazione
484K (ma non la 417N) trovata nella variante B.1.351, e 90
sequenze mostrano queste mutazioni nel background di
B.1.351 (come definito dal portare la caratteristica delezione
D242-244 NTD).
Neutralizzazione di B.1.351 da parte del plasma
convalescente
Abbiamo raccolto plasma da una coorte di pazienti infetti
durante la prima ondata di infezione da SARS-CoV-2 nel
Regno Unito. I campioni sono stati raccolti da casi
convalescenti 4-9 settimane dopo l'infezione nel giugno 2020,
prima della comparsa di B.1.1.7 (Dejnir- attisai et al., 2021).
Abbiamo anche incluso una recente raccolta di plasma da
pazienti infettati da B.1.1.7 (Supasa et al., 2021).
I titoli di neutralizzazione contro Victoria, un primo ceppo di
SARS-CoV-2 correlato a Wuhan (Caly et al., 2020; Seemann et
al., 2020), sono stati confrontati con B.1.351 usando un test di
neutralizzazione con riduzione del focus (FRNT). Per i campioni di
convalescenza precoce (n = 34), i titoli di neutralizzazione contro
B.1.351 erano, in media, ridotti di 13,3 volte

rispetto a Victoria (p < 0,0001) (Fig.
2A; Tabella S1A). Alcuni campioni
convalescenti, ad esempio 4, 6 e 15
hanno mantenuto una buona
neutralizzazione di B.1.351, ma per la
maggior parte, i livelli sono stati
notevolmente ridotti.
Significativamente, 18 dei 34
campioni non sono riusciti a
raggiungere il 50% di neutralizzazione
ad una diluizione plasmatica di 1:20,
con un certo numero che mostra una
riduzione quasi totale dell'attività di
neutralizzazione. Complessivamente,
nei 34 campioni di plasma
convalescente c'era un 13,3 volte
(media geometrica)
riduzione del titolo di neutralizzazione tra Victoria e B.1.351
(p <0,0001) (Figura 2C).
La neutralizzazione è stata eseguita anche utilizzando il
plasma recentemente raccolto, in diversi punti temporali, da
pazienti affetti da
B.1.1.7 (n = 13). Tutti questi casi avevano S-gene knockout
sulla PCR diagnostica (Thermo Fisher Scientific TaqPath,
caratteristica di B.1.1.7), e 11 avevano sequenziamento virale
che confermava B.1.1.7 (Fig. 2B; Tabella S1B). I titoli di
neutralizzazione erano bassi nei primi tempi sia per Victoria
che per B.1.351, ma un caso (B.1.1.7 P4), un campione preso
1 giorno dopo l'ammissione in ospedale, ha mostrato un titolo
molto alto contro Victoria (1:136,884) e B.1.351 (1:81,493). Noi
ipotizziamo che questo possa rappresentare una reinfezione
con
B.1.1.7. Nel complesso, c'era una riduzione di 3,1 volte (media
geometrica) dei titoli tra Victoria e B.1.351 nei sieri dei pazienti
infettati da B.1.1.7 (Figura 2D).
Neutralizzazione di B.1.351 da parte del siero del vaccino
Abbiamo poi misurato la neutralizzazione di Victoria e B.1.351
utilizzando il siero vaccinale ottenuto da individui vaccinati con il
vaccino Pfizer-BioNTech BNT162b2 o il vaccino Oxford-
AstraZe- neca AZD1222. Per Pfizer-BioNTech, il siero
vaccinato
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è stato ottenuto da operatori sanitari (n = 25) 4-17 giorni dopo
la seconda dose di vaccino, somministrata 3 settimane dopo la
prima dose (Figura 3A; Tabella S2). Per il vaccino
AstraZeneca, i campioni (n = 25) sono stati ottenuti 14 o 28
giorni dopo la seconda dose di vaccino, con un intervallo di
dosaggio di 8-14 settimane (Figura 3B; Tabella S2). Per il siero
del vaccino Pfizer-BioNTech, i titoli medi geometrici per
B.1.351 erano 7.6-fold inferiori a quelli per Victo- ria (p <
0.0001) (Figura 3C). Per il siero del vaccino Oxford-
AstraZeneca, i titoli medi geometrici di B.1.351 erano 9 volte
inferiori a quelli di Victoria (p < 0.0001) (Figura 3D;Tabella S2).
Il plasma prelevato prima della prima dose del vaccino Oxford-
AstraZeneca ha mostrato, come previsto, una neutralizzazione
minima o assente dei virus Victoria o B.1.351 (Figura S1).
Il siero del vaccino Pfizer-BioNTech ha indotto titoli di
neutralizzazione 3,6 volte superiori contro il ceppo Victoria
rispetto al vaccino Oxford-As- traZeneca (p < 0,0001). Anche
se la riduzione complessiva dei titoli era abbastanza simile, 7,6
volte contro 9 volte, rispettivamente, perché i titoli AstraZeneca
iniziavano da una base più bassa, più campioni non sono
riusciti a raggiungere il 50% di titoli FRNT contro B.1.351 (9/25)
che per il vaccino Pfizer (2/25), anche se uno di questi (Pfizer
2) ha anche mostrato bassi titoli di neutralizzazione contro il
virus Victoria.
Neutralizzazione di B.1.351 da parte di un ampio pannello di
mAbs Abbiamo prodotto e caratterizzato un pool di 377 mAbs
umani diretti alla proteina spike, cresciuti da campioni
convalescenti ottenuti da pazienti infettati durante la prima
ondata di SARS- CoV-2 nel Regno Unito prima di giugno 2020;
pertanto, non sono stati indotti in risposta all'infezione con
ceppi recenti di SARS-CoV-2 (Dejnirattisai et al., 2021).
Abbiamo selezionato i 20 mAbs più potenti (titoli FRNT50 < 100
ng/mL, 19 anti-RBD e 1 anti-NTD) e abbiamo eseguito test di
neutralizzazione contro i ceppi Victoria e B.1.351 (Figura 4;
Tabella S3A).
Gli effetti sulla neutralizzazione mAb sono stati gravi, 14 di
20 anticorpi avevano >10 volte caduta in titoli di
neutralizzazione, con la maggior parte di questi mostrando un
knockout completo di attività. Questo è in linea con i ruoli
chiave di K417, E484, e N501, in particolare E484, nel
riconoscimento anticorpale della superficie di interazione ACE2
del RBD descritto di seguito e nelle figure 5A-5G.
È interessante notare che il singolo potente anticorpo legante
NTD incluso in queste analisi, mAb 159, ha anche mostrato un
knockout completo dell'attività contro B.1.351, che include la
delezione degli aminoacidi 242-244 nella NTD, parte
dell'epitopo per mAb 159. Come si può vedere dalle figure 5H e
5I, l'anello RBD 246-253 interagisce con la catena pesante
(HC) di mAb 159 e anche quella di 4A8, un altro potente
legante neutralizzante NTD con una struttura riportata (Chi et
al., 2020). La delezione 242-244 altera senza dubbio la
presentazione di questo ciclo, compromettendo il legame con
questi mAb. Il legame a questo cosiddetto ''supersito'' è stato
segnalato come di potenziale rilevanza terapeutica (McCallum
et al., 2021). Il
I lignaggi B.1.1.7, B.1.351, e P.1 sono tutti convergenti con
delezioni o cambiamenti sistematici nella NTD. Anche se P.1
non ospita delezioni NTD, ci si aspetta che i cambiamenti
L18F, T20N e P26S (Faria et al., 2021) abbiano un impatto
marcato sul legame all'epitopo NTD. Poiché queste
caratteristiche convergenti possono essere sorte prima di una
forte pressione selettiva da parte delle risposte anticorpali,
sembra probabile che ci sia un driver biologico sottostante
ancora da scoprire, come l'aumento del legame del recettore e
la potenziale maggiore trasmissibilità impartita dalle mutazioni
RBD, che può causare questo epitopo per essere
estremamente suscettibile alla mutazione e alla fuga dal
legame anticorpale.
Neutralizzazione di B.1.351 da parte di mAbs in studi
clinici in fase avanzata
Un certo numero di mAbs sono in fase avanzata di
sperimentazione clinica come terapia o profilassi contro la
SARS-CoV-2 (Ku et al., 2021; Baum et al., 2020). Regeneron e
AstraZeneca usano cocktail di 2 mAbs per dare resistenza alla
fuga mutazionale dei virus (Kemp et al., 2021). Abbiamo
eseguito saggi di neutralizzazione con la coppia Regeneron
REGN10933 e REGN10987 e la coppia AstraZeneca AZD106 e
AZD8895 (Figura 4B; Tabella S3B). La neutralizzazione di
REGN10987 non è stata influenzata da B.1.351, mentre
REGN10933 è stata gravemente compromessa (773 volte)
(Figura 4B; Tabella S2). La neutralizzazione da parte della
coppia di anticorpi AZ era poco influenzata da B.1.351 rispetto
a Victoria.
Comprendere l'abrogazione della neutralizzazione:
ACE2 che si lega a B.1.351 RBD
La tripla mutazione K417N, E484R e N501Y è caratteristica del
B.1.351 RBD. Questi residui sono situati all'interno
dell'impronta di ACE2 (Figura 1E), e l'evoluzione in vitro per
ottimizzare l'affinità per ACE2 ha suggerito che conferiscono
una maggiore affinità per il recettore (Starr et al., 2020;
Zahradnı´k et al., 2021). Per indagare questo effetto, abbiamo
misurato la cinetica del legame di ACE2 solubile a RBD
ricombinante mediante interferometria a biolayer (BLI) (Figure
6A e 6B). Come previsto, l'affinità per B.1.351 RBD è alta;
infatti, è 19 volte superiore a quella della Victoria RBD e 2,7
volte superiore a quella di B.1.1.7 ((Dejnirattisai et al., 2021);
Supasa et al., 2021). Il KD è 4,0 nM, Kon è 4,78E4/ Ms, e Koff è
1,93E-4/s; quindi, il tasso di spegnimento è circa
Questo esacerberà ulteriormente il declino della potenza
osservato nei saggi di neutralizzazione, dal momento che gli
anticorpi di minore af- finità lotterà per competere con ACE2 a
meno che non hanno un molto lento off-rate o mostrare un
effetto avidità per bloccare l'attaccamento. Così, mentre tutta la
nostra serie di potenti leganti RBD hanno un'affinità superiore a
quella tra ACE2 e Victoria o B.1.1.7 RBD (KDs di 75,1 e 10,7
nM, rispettivamente), cinque dei 19 hanno affinità inferiore o
uguale a quella per ACE2 e B.1.351 RBD. Un piccolo ulteriore
Figura 2. Neutralizzazione dei virus Victoria e B.1.351 da parte del plasma convalescente
Il plasma è stato raccolto nel Regno Unito prima di giugno 2020, durante la prima ondata di SARS-CoV-2, nella prima fase di convalescenza, 4-9 settimane

dopo il ricovero in ospedale.
(A) Saggi FRNT che confrontano la neutralizzazione di Victoria (arancione) e B.1.351 (verde) (n = 34).
(B) Test di neutralizzazione di Victoria e B.1.351 con plasma ottenuto da pazienti affetti da infezione da B.1.1.7 nei tempi indicati dopo l'infezione.
(C e D) Confronto dei titoli FRNT50 tra i ceppi B.1.351 e Victoria per il plasma convalescente e B.1.1.7, rispettivamente. Il test Wilcoxon matched-pairs signed
rank sum è stato utilizzato per l'analisi e sono stati calcolati i valori p a due code; i valori medi geometrici sono indicati sopra ogni colonna. I dati alla base
delle curve di neutralizzazione di Victoria sono stati precedentemente riportati (Supasa et al., 2021). I singoli valori FRNT50 sono riportati nella tabella S1.
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aumento dell'affinità (ad esempio, 2 volte) batterebbe quasi tutti
gli anticorpi ((Dejnirattisai et al., 2021); Supasa et al., 2021).
L'influenza delle mutazioni RBD sull'affinità dei mAb
Per capire l'ordine di grandezza dell'abrogazione nella
neutralizzazione di più di due terzi dei 19 mAbs potenti che
legano la RBD, abbiamo misurato il KD per il legame alla RBD
recombi- nante da BLI (Figure 6C e 6D; Tabella S3). I risultati
sono netti: mentre per i frammenti leganti l'antigene (Fabs)
testati contro Victoria, 17 avevano KD inferiori a 4 nM (l'affinità
di ACE2 per B.1.351) contro B.1.351, questo si riduce a 4 (o 2
se le versioni a catena leggera [LC] di 253 vengono rimosse
[(Dejniratti- sai et al., 2021)]), con 7 Fabs che non riescono a
raggiungere un'affinità quasi micromolare. Questi risultati
seguono ampiamente i risultati di neutralizzazione (confrontare
i pannelli C e D della Figura 6; vedi Tabella S3), suggerendo
che il modello osservato di effetti sulla neutralizzazione è in
gran parte dovuto alle sostituzioni di aminoacidi nel RBD, cioè,
K417N, E484K, e N501Y.
La base strutturale per la perdita del legame mAb
Cerchiamo di capire la base di questi effetti nel contesto di una
descrizione anatomica della RBD. In termini di torso umano,
abbiamo definito quattro epitopi strutturali quasi contigui: spalla
sinistra, collo, spalla destra e fianco destro, con un epitopo
separato sul fianco sinistro (Dejnirattisai et al., 2021) (Figura
6E). In questo contesto, il sito di legame di ACE2 si estende
attraverso il collo ed entrambe le spalle. N501Y è sulla spalla
destra, K417N sul retro del collo, e E484R sulla spalla sinistra.
Anche se le tre mutazioni sono nominalmente in epitopi diversi,
la natura sovrapposta di questi epitopi significa che i residui
sono sufficientemente vicini in modo che più di uno potrebbe
influenzare direttamente il legame di qualsiasi anticorpo.
Inoltre, ci possono essere effetti allosterici (l'equivalente
strutturale dell'epistasi in genetica) per cui gli effetti possono
estendersi su una certa distanza. Nonostante questi caveat, la
maggior parte degli effetti osservati sono direttamente spiegati
dal riferimento alla conoscenza strutturale precedente.
L'effetto di N501Y e K417N sul legame mAb
Molti dei complessi Fab/SARS-CoV-2 RBD riportati sono per gli
anticorpi che utilizzano la regione pubblica
dell'immunoglobulina HC variabile (IGHV) IGHV3-53
((Dejnirattisai et al., 2021); Yuan et al., 2020), e questi sono
ben rappresentati nel nostro set da cinque anticorpi che sono
potenti contro il virus Victoria. Quattro di questi, 150, 158, 175 e
269, hanno le loro capacità di neutralizzazione e di legame
gravemente compromesse o abolite, mentre 222 è
un'eccezione, poiché il suo legame non è influenzato dalla
variante B.1.351 (figure 6F e 6G). La famiglia di anticorpi
IGHV3-53 si lega allo stesso epitopo nella parte posteriore del
collo della RBD, con orientamenti di approccio molto simili
condivisi anche dai Fabs IGHV3-66. La maggior parte di questi
stabilisce contatti diretti con K417 e
N501, ma nessuno di loro contatta E484. Le regioni
determinanti la complementarità-3 (CDR3s) piuttosto corte di
queste Fabs sono solitamente posizionate direttamente sopra
K417 (Dejnirattisai et al., 2021), formando legami a idrogeno o
ponti salini così come interazioni idrofobiche, mentre N501
interagisce con il loop CDR1 LC (Figura 5) (Supasa et al.,
2021). Tuttavia, il mAb 150 è un po' diverso, formando sia un
ponte salino tra K417 e il LC CDR3 D92 che un legame
idrogeno tra N501 e S30 nel LC CDR1 (Figura 5B), mentre 158
è più tipico, formando un legame idrogeno dall'ossigeno
carbonilico di G100 del HC CDR3 e K417 e contatti idrofobici
da S30 del LC CDR1 a N501. Ci aspetteremmo quindi che gli
effetti combinati delle mutazioni K417N e N501Y
compromettessero gravemente il legame della maggior parte
dei mAbs della classe IGHV3-53 e IGHV3-66. Tuttavia, un
membro di questa classe, 222, non è influenzato né dalla
variante B.1.1.7 (Supasa et al., 2021) né da quella B.1.351.
Fortunatamente, fino ad oggi non siamo stati in grado di
ottenere una struttura del 222 Fab con RBD o spike. Tuttavia,
abbiamo precedentemente notato che il p2c-2f11 Fab (PDB:
7CDI [Wajnberg et al., 2020]) il cui LC è più simile in sequenza,
e ha le stesse lunghezze CDR- L1, L2, e L3, al mAb 222 non fa
alcun contatto con N501 (Supasa et al., 2021).
Esaminando da vicino le strutture dei complessi Fab e RBD
IGHV3-53 e IGHV3-66, abbiamo scoperto che Fab CB6 (PDB:
7C01 [Shi et al., 2020]) ha le stesse lunghezze CDR-H1-3 e fa
solo contatti idrofobici a K417 da Y33, Y52, e D104 del HC.
Cambiando il K in N a 417 in questa struttura complessa e
selezionando uno dei rotamers favorevoli della catena laterale
si vede che N417 potrebbe fare legami idrogeno sia a Y33 che
a Y52, compensando la perdita di contatto con D104 (Figure 5F
e 5G). In 222, Y33 e Y52 sono conservati e D104 è ri-posto da
un N. Noi ipotizziamo che l'interazione di 222 con K417
potrebbe essere simile a CB6, spiegando la sua resistenza al
B.1.351 variante.
Gli effetti della mutazione E484K Fab 88 lega RBD nella parte
posteriore della spalla sinistra, i residui G104 e K108 del HC
CDR3 contattano E484, e il LC CDR2 fa ampie interazioni
idrofobiche e un legame idrogeno catena principale da Y51 e
un ponte salino da D53 a K417 (Figura 5A). Il cambiamento di
carica a E484 da negativo a positivo e l'accorciamento della
catena laterale del residuo 417 da K a N dovrebbero abolire
tutte queste interazioni, spiegando la perdita di diverse
centinaia di volte in KD. Il mAb 384 è uno dei più potenti mAb
neutralizzanti che abbiamo trovato contro il virus Victo- ria.
Questo mAb si avvicina al sito di legame dalla parte anteriore
della spalla sinistra, seppellendo l'82% dell'area accessibile al
solvente di E484 attraverso il legame a idrogeno con Y50, T57
e Y59 e facendo un ponte salino con R52 del LC CDR2 (Figura
5D),
Figura 3. Neutralizzazione di B.1.351 da parte del siero del vaccino
(A e B) Curve di neutralizzazione FRNT per i ceppi Victoria e B.1.351 da (A) 25 sieri prelevati 7-17 giorni dopo la seconda dose del vaccino Pfizer-BioNTech e
(B) 25 sieri prelevati 14 o 28 giorni dopo la seconda dose del vaccino Oxford-AstraZeneca.
(C e D) Confronto dei titoli FRNT50 tra i ceppi B.1.351 e Victoria per i vaccini Pfizer-BioNTech e Oxford-AstraZeneca, rispettivamente. Il test Wilcoxon

matched-pairs signed rank sum è stato utilizzato per l'analisi e sono stati calcolati i valori p a due code; i valori medi geometrici sono indicati sopra ogni
colonna. I dati alla base delle curve di neutralizzazione di Victoria sono stati precedentemente riportati (Supasa et al., 2021). I singoli valori FRNT50 sono
riportati nella tabella S2. Vedi anche la Figura S1.
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spiegando così l'impatto catastrofico della mutazione E484K
sul legame (Tabella S3).
Anticorpi resistenti a K417N, E484K e N501Y Il mAb 222 non
era l'unico anticorpo a mostrare resistenza a B.1.351. Anche i
titoli FRNT50 per i mAb 55, 165, 253 e 318 erano relativamente
uguali tra Victoria e B.1.351, indicando che i loro epitopi non
sono perturbati dalle mutazioni K417N, E484K e N501Y. Gli
anticorpi 55, 165 e 253 sono imparentati tra loro, e abbiamo
precedentemente dimostrato che la combinazione delle LC di
55 o 165 con l'HC di 253 porta a un aumento >1 logdei titoli di
neutralizzazione (Dejnirattisai et al., 2021). Le chimere
253H/55L e 253H/165L possono entrambe neutralizzare
B.1.351, con titoli FRNT50 di 9 e 13 ng/mL, rispettivamente.
Strutture di 253 e queste chimere Fabs con RBD o spike
mostrano che si legano quasi iden- ticamente allo stesso
epitopo e non contattare nessuno dei tre residui del sito di
mutazione, correlando bene con la neutralizzazione e BLI dati
vincolanti (Figura 5C).
DISCUSSIONE
I coronavirus sono virus RNA a filamento positivo e, sebbene la
RNA polimerasi possieda una limitata capacità di proofreading,
sono intrinsecamente inclini al cambiamento mutazionale.
L'evoluzione della SARS-CoV-2 da una probabile introduzione
zoonotica in un singolo punto a Wuhan nel novembre o
dicembre 2019 è stata ampiamente contrastata e ha portato
all'istituzione di una sorveglianza delle sequenze virali come il
COG-UK nel Regno Unito. Simili sforzi di sorveglianza sono
stati avviati in un certo numero di paesi, ma globalmente la
copertura è insufficiente, con grandi popolazioni a rischio con
poca o nessuna capacità.
La recente comparsa di tre ceppi di SARS-CoV-2, B.1.1.7,
B1.351, e P.1, che possono conferire una maggiore
transmissibilità, è avvenuta indipendentemente nel Regno
Unito, in Sud Africa e in Brasile, dove sono diventati
rapidamente ceppi dominanti e si stanno ora diffondendo a
livello globale. Mentre le sequenze sono marcatamente diverse,
ciascuna contenente 9-12 cambiamenti, ci sono due temi
comuni. Il primo tema coinvolge la superficie di interazione
ACE2 della RBD: tutti condividono la mutazione N501Y, mentre
B.1.351 e P.1 condividono E484K e N501Y ed entrambi
B.1.351 e P.1 hanno cambiamenti a 417, 417T in P.1 e 417N in
B.1.351. Il secondo tema è quello delle cancellazioni nella
NTD: 69-70 e 144 in
B.1.1.7 e 242-244 in B.1.351, entrambi i quali interromperanno
i siti di legame degli anticorpi neutralizzanti anti-NTD, come
dimostrato qui dal fallimento della neutralizzazione del mAb 159
anti-NTD. Anche se P.1 non possiede delezioni NTD, è
costellato di mutazioni puntiformi in questa regione che
possono conferire proprietà funzionali simili. Nonostante i
cambiamenti in B.1.351, la capacità neutralizzante residua è
presente in molti sieri convalescenti e vacini, con alcuni
individui che mostrano una riduzione minima dei titoli rispetto al
ceppo Victoria.
Anche se la maggior parte dei potenti mAbs ha subito una
sostanziale riduzione o eliminazione dell'attività, un certo
numero è stato in grado di
neutralizzare B.1.351, tra cui 222, 318, 253/55, e 353/165, la
coppia AstraZeneca AZD1061 e AZD889, e Regeneron
REGN10987, che non contatta nessuno dei siti di mutazione,
mentre REGN10933 contatti sia 417 e 484 e legame è
abrogato. Analizzando le strutture note dei comlessi Fab/RBD,
siamo in grado di razionalizzare gli effetti su tutti i potenti
leganti del virus Victoria in termini di interazioni con i tre residui
mutati nel RBD.
Quanta ulteriore mutazione nella RBD questi anticorpi
saranno in grado di sopportare non è noto, ma l'uso di cocktail
di anticorpi per proteggersi dalle varianti virali che si verificano
sia durante una singola infezione, sia a livello di popolazione,
sembra essere una strategia valida. Tuttavia, si deve
riconoscere che l'uso della terapia o della profilassi con mAb, in
particolare per periodi prolungati in individui
immunocompromessi con infezione cronica, è probabile che
guidi l'emergere di mutazioni di resistenza.
L'emergere diffuso di ceppi varianti, in particolare con la
mutazione E484K, può rendere prudente lo sviluppo di mAb
per colpire il cambiamento 484K. Potrebbe anche essere
possibile ri-ingegnerizzare gli anticorpi terapeutici candidati
esistenti; un esempio di come sottili cambiamenti possano
conferire resilienza è mostrato dal mAb 222, che possiede la
regione V di IGHV3-53. Mentre tutti gli altri anticorpi IGHV3-53
sono gravemente compromessi nel legare B.1.351, un leggero
cambiamento nella lunghezza dell'HC CDR3 e una scelta
adeguata di LC permettono al mAb 222 di mantenere la
potenza contro
B.1.1.7 e B.1.351.
Recentemente sono stati riportati esperimenti di evoluzione
in vitro (Starr et al., 2020) in cui il virus vivo è stato indotto a
evolversi di fronte alla pressione immunitaria di mAbs o siero
policlonale. È interessante notare che l'uso ripetuto della
terapia con plasma in un individuo immu- nocompromesso ha
portato all'emergere transitorio della mutazione N501Y così
come la delezione 69-70 nell'NTD, che è caratteristica di
B.1.1.7 (Kemp et al., 2021). Inoltre, il passaggio se- riale del
virus in concentrazioni sub-neutralizzanti di plasma im- mune
ha portato alla comparsa della delezione di F140 e alla
creazione di una nuova sequenza di glicosilazione N-linked
nell'NTD insieme alla mutazione E484K RBD (Andreano et al.,
2020). In alternativa, la visualizzazione su lievito di librerie di
mutanti RBD è stata utilizzata per selezionare varianti per la
fuga dal legame al siero immunitario o in alternativa per una
maggiore affinità di legame al recettore ACE2 (Zahradn'ık et al.,
2021). Di grande interesse è il fatto che tutti questi approcci
hanno portato all'identificazione di un insieme comune di
mutazioni trovate nei virus varianti che sono ora in circolazione.
Le principali sono N501Y trovate in tutte le linee B.1.1.7,
B.1.351 e P.1 e E484K trovate in B.1.351 e P.1. Queste
mutazioni aumentano l'affinità della RBD per ACE2 di 2,7 volte
per B.1.1.7 (Su-Pasa et al., 2021) e di 19 volte per B.1.351, il
che è compatibile con l'osservazione che i virus che portano le
mutazioni E484K e N501Y
le mutazioni hanno probabilmente una maggiore trasmissibilità.
Qui, dimostriamo che il ceppo B.1.351 CoV-2 è molto più
difficile da neutralizzare rispetto ai ceppi parentali; 14 su 20 di
un pannello di mAbs sono seriamente compromessi o la
neutralizzazione è completamente eliminata. Su siero

convalescente, il
Figura 4. Neutralizzazione da parte di potenti mAbs
(A) Curve di neutralizzazione per Victoria e B.1.351 usando 22 anticorpi monoclonali umani (mAbs).
(B) Curve di neutralizzazione dei ceppi Victoria e B.1.351 utilizzando coppie di mAb di Regeneron e AstraZeneca. I dati alla base delle curve di
neutralizzazione Victoria sono stati precedentemente riportati (Supasa et al., 2021). I singoli valori FRNT50 sono riportati nella tabella S3.
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Figura 5. Interazioni di siti di mutazione resi
con una selezione di RBD-binding mAbs (A-D)
Interazioni di (A) Fab 88 con K417 e E484 della
RBD (PDB: 7BEL), (B) 150 con N501 e K417
(PDB: 7BEI), (C) 253 non ha contatto con
nessuno dei tre siti di mutazione (PDB: 7BEN), e
(D) Fab 384 con solo E484 (PDB: 7BEP).
(E) Strutture dei Fabs IGHV3-51 e IGHV3-66
sovrapponendo le dorsali Ca della RBD.
(F) Interazioni di K417 con CB6 Fab (PDB: 7C01
[Wajnberg et al., 2020]).
(G) La mutazione K417N è modellata nel
complesso RBD/ CB6. In (A) a (G), la catena
leggera Fab, la catena pesante e RBD sono in
blu, salmone e grigio, rispettivamente. Le dorsali
Ca sono disegnate in
e le catene laterali in quelle più spesse. I contatti
(%4 Å
) sono mostrati come linee tratteggiate gialle
e i legami idrogeno e i ponti salini come linee
tratteggiate blu.
(H e I) Posizioni delle mutazioni e la delezione nel
NTD spike della variante B.1.351 rispetto agli
anticorpi legati (H) 159 (PDB: 7NDC) e (I) 4A8
(PDB: 7C2L); la delezione 242-244 sarebbe pre-
previsto per interrompere l'interazione di 159 e
4A4. I domini variabili della catena pesante e della
catena leggera (Vh e Vl) dei Fabs sono mostrati
come superfici salmone e blu, rispettivamente, e
l'NTD come bastoncini grigi. I siti di mutazione
sono disegnati come sfere verdi e le delezioni
come sfere magenta.
I titoli di neutralizzazione sono ridotti di 13,3 volte per B.1.351
rispetto al ceppo Victoria, con 14 su 34 che non riescono a
raggiungere un NT50 a una diluizione 1:20 e un certo numero
che mostra quasi un completo abbattimento dell'attività. Resta
da determinare se questo riflette una focalizzazione della
risposta immunitaria in questi individui, come è stato visto, per
esempio, per il picor- navirus enterovirus-71 (Huang et al.,
2020). I titoli di neutralizzazione per i vaccini Oxford-
AstraZeneca e Pfizer sono stati ridotti in modo simile con
B.1.351 da 9 volte e 7.6 volte, rispettivamente. Per

il vaccino Oxford-AstraZeneca rispetto
al vaccino Pfizer, più sieri non sono
riusciti a raggiungere FRNT50 alla
diluizione 1:20, e poiché la riduzione dei
titoli FRNT50 tra i due vaccini era
abbastanza simile, questo effetto era
dovuto ai titoli di partenza 3,6 volte
inferiori per il vaccino Ox- ford-
AstraZenca rispetto al vaccino Pfizer-
BioNTech .
Tuttavia, entrambi i vaccini Oxford-
AstraZeneca e Pfizer danno una
sostanziale efficacia iniziale dopo una
singola dose di vaccino contro i ceppi
parentali (~76 e 89%, rispettivamente)
(https://assets.publishing.service.gov.
uk/government/uploads/system/uploads/
attachment_data/file/961287/Greenbook_
chapter_14a_v7_12Feb2021.pdf; Baden
et al, 2021; Polack et al., 2020, (Voysey et
al., 2021b)), il che implica che i titoli
anticorpali neutralizzanti richiesti per questo
livello di protezione sono modesti.
Dati molto recenti suggeriscono che il vaccino Novavax, che
ha raggiunto il 95,6% di efficacia contro i precedenti ceppi di
SARS-CoV-2 e l'85,6% contro B.1.1.7 nel Regno Unito, ha
avuto un'efficacia ridotta del 60% in Sud Africa, dove si stima
che il 92,6% delle infezioni sia stato B.1.351
(https://www.novavax.com/sites/default/ files/2021-
02/20210202-NYAS-Novavax-Final.pdf). Inoltre, i dati dello
studio Novavax in Sudafrica indicano che circa un terzo dei
partecipanti allo studio erano sieropositivi al momento
dell'arruolamento; tuttavia, nel braccio placebo dello studio,
c'era
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Figura 6. Interazione RBD dell'anticorpo e
modellazione strutturale
(A e B) grafici BLI che mostrano una serie di
titolazione del legame ad ACE2 (vedi metodi
STAR) per (A) Wu- han RBD e (B) K417N,
E484K, e N501Y
B.1.351 RBD. Si noti il tasso di spegnimento
molto più lento per B.1.351.
(C e D) KD di interazione RBD/mAb misurata da
BLI per WT Wuhan RBD (punti di sinistra) e
K417N, E484K, e N501Y B.1.351 RBD (punti di
destra).
(E) Epitopi definiti dal clustering dei mAbs sulla
RBD (grigio).
(F) BLI dati mappati sulla RBD utilizzando il
metodo descritto in (Dejnirattisai et al., 2021). Le
viste anteriore e posteriore della RBD sono
rappresentate con le sfere che rappresentano i siti
di legame degli anticorpi colorati secondo il
rapporto (KDB.1.351/ KDWuhan). Per il bianco, il
rapporto è 1; per il rosso, è <0.1 (cioè, almeno 10
volte riduzione). I punti neri si riferiscono agli
anticorpi mappati non inclusi in questa analisi;
verde scuro alla superficie di legame RBD ACE2;
e giallo ai mutati K417N, E484K, e N501Y.
(G) Come per la coppia di sinistra, ma colorati
secondo il rapporto dei titoli di neutralizzazione
(concentrazione inibitoria semimassima
[IC50]B.1.351/[IC50]Victoria). Per il bianco, il
rapporto è 1; per il rosso, è <0,01 (cioè, almeno
100 volte la riduzione). Si noti la forte
concordanza tra i due effetti, con il 269 che è il
più fortemente colpito. Gli anticorpi rosa vicini
sono principalmente gli anticorpi IGHV3-53 e
IGHV3-66.
nessuna differenza nel tasso di infezione nei volontari
sieronegativi rispetto a quelli sieropositivi (3,9 contro 3,9%), il
che implica una mancanza di protezione della precedente
esposizione alla SARS-CoV-2 rispetto all'infezione con
B.1.351. Il vaccino monodose COVID-19 della Janssen ha
mostrato un'efficacia del 72% nel prevenire la malattia
moderata e grave, che è stata ridotta al 57% in Sudafrica.
Infine, un recente rapporto dal Sudafrica su un campione di
piccole dimensioni suggerisce una sostanziale perdita di
efficacia per il vaccino Oxford-AstraZeneca contro l'infezione
da B.1.351 (10,6% di efficacia contro la malattia lieve-moderata
[Madhi et al., 2021]). Non ci sono ancora rapporti sull'efficacia
del vaccino Pfizer-Bio- NTech contro B.1.351; tuttavia, i titoli di
neutralizzazione qui riportati suggeriscono che un certo grado
di efficacia sarà mantenuto. Nel complesso, questi risultati
suggeriscono che una precedente infezione o vaccinazione con
ceppi ancestrali di SARS-CoV-2 potrebbe non fornire una
protezione adeguata contro B.1.351.
Ciò che sta guidando l'evoluzione di B.1.351 è difficile da
disen- trarre. Da un lato, qui mostriamo un aumento di circa 20
volte dell'affinità per ACE2 rispetto a Wuhan RBD, che può
influenzare la trasmissibilità. D'altra parte, la sostanziale fuga
immunitaria anticorpale da B.1.351 sta probabilmente giocando
un ruolo in paesi come il Sud Africa, dove i tassi di infezione
precedente sono relativamente alti (stima >30%). Il compromesso
tra l'aumento dell'affinità e della trasmissibilità di ACE2 e la fuga
immunitaria è probabilmente complesso; come l'immunità della
popolazione aumenta a causa della vaccinazione

e l'infezione naturale, la pressione
evolutiva per le varianti virali da
selezionare aumenta. La capacità di
generare varianti RBD ad altissima
affinità per ACE2 nell'intervallo sub-
picomolare mediante evoluzione in
vitro
(Zahradnı´k et al., 2021), un'affinità più alta di quasi tutti i
mAbs descritti finora, è motivo di preoccupazione. Se tali
virus con estrema affinità ACE2/RBD siano vitali è
chiaramente sconosciuto, e l'estrema cautela dovrebbe
essere esercitata se questo sce- nario dovrebbe mai essere
testato usando virus vivi.
In sintesi, la recente comparsa di molteplici ceppi di
varianti della SARS-CoV-2 ha sconvolto la fiducia sulla
possibilità che l'attuale generazione di vaccini fornisca una
protezione a lungo termine contro l'infezione. La possibilità
di sfuggire all'immunità naturale e indotta dal vaccino ha spinto
a capire le conseguenze di questi cambiamenti e a sviluppare
nuovi costrutti di vaccino su misura per le varianti, in particolare
incorporando la mutazione E484K. Come gli individui
precedentemente infettati o vaccinati rispondono a questi nuovi
vaccini varianti sarà oggetto di un intenso studio nei prossimi
mesi, poiché c'è la consapevolezza generale che il problema
attuale non è finito. Tuttavia, anche se le risposte anticorpali
alle nuove varianti non sono in grado di prevenire l'infezione,
possono moderarne la gravità. Inoltre, le risposte delle cellule T
allo spike potrebbero non essere interrotte dai cambiamenti
mutazionali ed essere in grado di limitare la diffusione al tratto
respiratorio inferiore e prevenire la malattia grave.
Devono essere implementati sistemi di sorveglianza
intensiva per monitorare l'emergere di nuove varianti e, in
particolare, essere mirati alla ricerca di infezioni rivoluzionarie
in
Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021 11

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ACCESSO
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Articol
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vaccinati. Il lavoro sui vaccini di seconda e anche terza
generazione per colpire i virus varianti e più in generale per
sviluppare immunogeni per obiettivi meno dipendenti dalla
superficie di interazione ACE2-RBD meritano ulteriori studi.
Limiti dello studio
I campioni di vaccino e di convalescenza usati negli studi di
neutralizzazione in questo rapporto sono stati prelevati presto e
i titoli potrebbero aumentare ulteriormente; al contrario, è
anche probabile che i titoli diminuiscano con il tempo e che la
protezione da B.1.351 offerta dalle risposte anticorpali ai primi
ceppi di SARS-CoV-2 possa ridursi. Sarà anche importante
sapere come il siero degli individui infettati da B.1.351 sia in
grado di neutralizzare i primi ceppi legati a Wuhan e le varianti
B.1.1.7 e P.1 recentemente ri-portate. Inoltre, dato che E484K
sembra essere una mutazione così importante per quanto
riguarda il legame anticorpale e la neutralizzazione, gli studi
futuri possono cercare di definire i mAbs da individui infettati da
virus E484K per fornire protezione da questi ceppi di virus che
sono sotto pressione per emergere, crediamo principalmente
attraverso una maggiore fitness impartita dalla maggiore affinità
di RBD per ACE2. Infine, sarà importante determinare se la
vaccinazione o l'infezione naturale con i primi ceppi di SARS-
CoV-2 offrono ancora protezione dalla malattia grave e
dall'ospedalizzazione, i parametri più importanti del successo
del vaccino.
STELLA+METODI
I metodi dettagliati sono forniti nella versione online di questo
documento e comprendono quanto segue:
d TABELLA DELLE RISORSE CHIAVE
d DISPONIBILITÀ DELLE RISORSE
B Contatto principale
B Disponibilità dei materiali
B Disponibilità di dati e codici
d MODELLO SPERIMENTALE E DETTAGLI DEL
SOGGETTO
B Scorte virali
B Ceppi batterici e coltura cellulare
B Partecipanti
B Siero dei vaccini Pfizer
B Procedure di studio del vaccino AstraZeneca-
Oxford e trattamento dei campioni
d DETTAGLI DEL METODO
B COG-UK Analisi delle sequenze
B Test di neutralizzazione della riduzione del fuoco
(FRNT)
B Clonazione di RBD nativo, ACE2 e RBD K417N,
E484K, N501Y
B Produzione di proteine
B Interferometria a bio-strato
d QUANTIFICAZIONE E ANALISI STATISTICA
INFORMAZIONI SUPPLEMENTARI
Informazioni supplementari possono essere trovate online su
https://doi.org/10.1016/j.cell. 2021.02.037.
RICONOSCIMENTI
Questo lavoro è stato supportato dal Chinese Academy of Medical Sciences
(CAMS) Innovation Fund for Medical Science (CIFMS), Cina (grant 2018-I2M-
2-002) a

D.I.S. e G.R.S. H.M.E.D. e J.R. sono sostenuti dal Wellcome Trust
(101122/Z/13/Z), Y.Z. dal Cancer Research UK (C375/A17721), e D.I.S. e
E.E.F. dal Medical Research Council del Regno Unito (MR/N00065X/1).
D.I.S. è un investigatore Jenner. Siamo grati per una sovvenzione Fast
Grants, Mercatus Center, per sostenere l'isolamento di mAbs umani contro
SARS-CoV-2 e Schmidt Futures per il supporto di questo lavoro. G.R.S. è
anche sostenuto come Wellcome Trust Senior Inves- tigator grant
095541/A/11/Z. Questo è un contributo del centro UK Instruct-ERIC. Il
Wellcome Centre for Human Genetics è sostenuto dal Wellcome Trust
(grant 090532/Z/09/Z). Il virus usato per i test di neutralizzazione è stato un
dono di Julian Druce, Doherty Centre, Melbourne, Australia. Chanice
Knight, Emily Chiplin, Ross Fothergill e Liz Penn hanno contribuito ai saggi.
Riconosciamo il Diamond Light Source per il tempo sulla Beamline I03 sotto
la proposta lb27009 per COVID-19 Rapid Access. Un enorme
ringraziamento ai team, specialmente al Diamond Light Source e al
Dipartimento di biologia strutturale dell'Università di Oxford, che hanno
permesso di continuare il lavoro durante la pandemia. Gli aspetti
computazionali di questa ricerca sono stati supportati dal Wellcome Trust
Core Award Grant 203141/Z/16/Z e dal NIHR Oxford BRC. Il lavoro di
Oxford Vaccine è stato sostenuto da UK Research and Innovation, Coalition
for Epidemic Preparedness In- novations, National Institute for Health
Research (NIHR), NIHR Oxford Biomedical Research Centre, e Thames
Valley and South Midland's NIHR Clinical Research Network. Ringraziamo il
team clinico Oxford Protective T-cell Immunology for COVID-19 (OPTIC)
per la raccolta dei campioni dei partecipanti e l'Oxford Immunology Network
COVID-19 Response T cell Consortium per il supporto di laboratorio.
Riconosciamo la rapida condivisione della variante B.1.351, che è stata iso-
lata dagli scienziati del National Infection Service di PHE Porton Down.
Questo lavoro è stato supportato dal Dipartimento della Salute e
dell'Assistenza Sociale del Regno Unito come parte del Consorzio PITCH
(Protective Immunity from T cells to COVID-19 in Health Workers), il
Consorzio di Immunologia dei Coronavirus del Regno Unito (UK-CIC) e la
Huo Family Foundation. E.B. e P.K. sono NIHR Senior Investigators, e P.K.
è finanziato da WT109965MA e NIH (U19 I082360). J.C.K. è un Wellcome
Investigator (WT204969/Z/16/Z) ed è sostenuto dal NIHR Oxford
Biomedical Research Centre e dal CIFMS. D.S. è un NIHR Academic
Clinical Fellow, e
S.F.L. è finanziato come ricercatore clinico del Wellcome Trust. Le opinioni
ex-
premuto in questo articolo sono quelli degli autori e non necessariamente
quelli del Servizio Sanitario Nazionale (NHS), il Dipartimento della Salute e
dell'Assistenza Sociale (DHSC), il NIHR, il Medical Research Council (MRC),
o la Salute Pubblica, Inghilterra.
CONTRIBUTI DELL'AUTORE
D.Z. ha eseguito le analisi di interazione BLI. J.R., E.E.F., H.M.E.D. e D.I.S.
hanno analizzato i risultati strutturali. G.R.S., J.M., P.S., Y.Z., D.Z., G.C.P. e
C.L. ha preparato i costrutti spike, RBD, ACE2 e gli anticorpi. W.D. ha
formato saggi di neutralizzazione con B.W., R.N., A.T., J.S.-C. e C.L.-C.
B.H., N.C., K.B., S.C., N.B., I.S., H.H., K.G., N.G., e A.S. hanno fornito il virus
B.1.351 e hanno contribuito al disegno sperimentale. D.C. e W.J. hanno
fornito i materiali.
H.M.G. ha scritto mabscape e ha eseguito la mappatura e l'analisi dei
cluster, comprese le analisi delle sequenze. A.J.M., S.F.L., E.B., S.J.D.,
D.S., C.D., R.L., T.D., A.J.P., J.C.K., P.K., M.W.C., T.L., S.B., A.F., M.B.,
S.B.-R.
S.G. ha assistito con i campioni dei pazienti e le prove del vaccino. E.B.,
M.C., S.J.D., P.K., e D.S. hanno concepito lo studio degli operatori sanitari
vaccinati e hanno supervisionato lo studio OPTIC sugli operatori sanitari e la
raccolta/elaborazione dei campioni.
G.R.S. e D.I.S. hanno scritto la bozza iniziale del manoscritto con altri autori
che hanno fornito commenti editoriali. Tutti gli autori hanno letto e approvato
il manoscritto.
DICHIARAZIONE DI INTERESSI
G.R.S. fa parte del comitato consultivo scientifico di GSK Vaccines.
L'Università di Oxford detiene la proprietà intellettuale relativa al vaccino
Oxford-AstraZeneca. A.J.P. è presidente del Comitato congiunto per la
vaccinazione e l'immunizzazione (JCVI) del Ministero della Salute e
dell'assistenza sociale del Regno Unito (DHSC), ma non partecipa al
comitato COVID-19 del JCVI, ed è un membro del SAGE dell'OMS. Le
opinioni espresse in questo articolo non rappresentano necessariamente le
opinioni del DHSC, del JCVI o dell'OMS. L'Università di Oxford è entrata in
una partnership con AstraZeneca sullo sviluppo del vaccino contro il
coronavirus. L'Università di Oxford ha protetto la proprietà intellettuale
divulgata in questa pubblicazione.
12 Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021

Articol
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ACCESSO
APERTO
Ricevuto: 8 febbraio 2021
Rivisto: 16 febbraio 2021
Accettato: 17 febbraio 2021
Pubblicato: 23 febbraio 2021
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ACCESSO
APERTO
Articol
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14 Cell 189, 1-14, 29 aprile 2021

SARS-CoV-2
(Australia/VIC01/2020)
SARS-CoV-2/B.1.1.7
Batteri DH5a
Caly et al., 2020
Salute pubblica in
Inghilterra
In Vitrogen
N/A
N/A
Cat#18263012
Articol
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STELLA+METODI
TABELLA DELLE RISORSE CHIAVE
REAGENTE o IDENTIFICATORE DI RISORSE
Anticorpi
Fab(Dejnirattisai et al., 2021 )N/A
IgG(Dejnirattisai et al., 2021 )N/A
Anti-NP umano (mAb 206)(Dejnirattisai et al., 2021 )N/A
Regeneron mAbsAstraZenecaCat#REGN10933, e
REGN10987
AstraZeneca mAbsAstraZenecaCat#AZD1061,
AZD8895
Anti-IgG umane (Fc specifiche)-
PerossidasiSigmaCat#A0170 RRID: AB_257868 Ceppi batterici e virali
Campioni biologici
Prodotti chimici, peptidi e proteine ricombinanti
(Continua nella pagina seguente)
RBD di SARS-CoV-2 legato a His
SARS-CoV-2 RBD legato a His
K417N, E484K, N501Y
ACE2 umano legato a lui
ACE2 umano-hIgG1Fc
Compresse di soluzione salina
tamponata al fosfato
Dulbecco's Modified Eagle Medium, alto
glucosio
Dulbecco's Modified Eagle Medium, a
basso contenuto di glucosio
FreeStyle 293 Expression Medium
L-Glutamina-Penicillina-
Streptomicina soluzione
Siero bovino fetale
Polietilenimina, ramificata
Carbossimetilcellulosa
Strep-Tactin®XT
HEPES
Cloruro di sodio
brodo LB
Mem Neaa (100X)
Tripsina-EDTA
L-Glutammina 200 mM (100X)
SYPROorange (5000X in DMSO)
Isopropyl b-d-1-thiogalactopyranoside
Kanamicina
Questo
document
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document
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N/A
N/A
Questo
documento
Questa carta
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
N/A
N/A
Cat#P4417
Cat#D5796
Sigma-Aldrich Cat#D6046
GIBCO
Sigma-Aldrich
Cat#12338018
Cat#G1146
GIBCO
Sigma-Aldrich
Sigma
IBA Lifesciences
Melford
Honeywell
Fisher Scientific UK
GIBCO
GIBCO
GIBCO
Thermo
Meridian Bioscience
Melford
Cat#12676029
Cat#408727
Cat#C4888
Cat#2-1206-025
Cat#34587-39108
Cat#SZBF3340H
Cat#51577-51656
Cat#2203945
Cat#2259288
Cat#2036885
Cat#S6651
Cat#BIO-37036
Cat#K22000
Siero di individui vaccinati alla Pfizer
Siero di individui vaccinati da
AstraZeneca-Oxford
Plasma di pazienti con SARS-CoV-2
Università di Oxford
Università di Oxford
N/A
N/A
Ospedale John Radcliffe di Oxford
UK
N/A

Cell 189, 1-14.e1-e5, 29 aprile 2021 e1

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ACCESSO
APERTO
Articol
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Continua
Modelli sperimentali: linee cellulari
Cellule HEK293S GnTI-
ATCCCat#CRL-3022 RRID: CVCL_A785
Cellule HEK293ATCCCat#CRL-3216 RRID:
CVCL_0063
Expi293F CellsGIBCO,Cat#A14527
Criceto: ExpiCHO cellsThermo FisherCat#A29133
Cellule VeroATCCCat#CCL-81RRID:
CVCL_0059
DNA ricombinante
Vettore: pNEO(Aricescu et al., 2006 )N/A
Vettore: pOPING-ET(Nettleship et al., 2008 )N/A
ACE2 umano cDNASourcebiosciencesCat#5297380
Vettore: catena pesante IgG1
umanaGermanCancer
Research Center, Heidelberg,
Germania (H. Wardemann
Vettore: catena leggera umana
lambdaGermanCancer Research
Center,
Heidelberg, Germania (H.
Wardemann
Vettore: catena leggera kappa
umanaGermanCancer
Research Center, Heidelberg,
Germania (H. Wardemann
N/A
N/A
N/A
Vettore: Fab umanoUniversità di OxfordN/A
Software e algoritmi
PyMOLSchrodinger https://pymol.org/2/; RRID: SCR_000305
Software di acquisizione dati 11.1.0.11Fortebiohttps://www.sartorius.com/en/products/ protein-analysis/octet-
systems-software
Software di analisi dei dati HT 11.1.0.25Fortebiohttps://www.sartorius.com/en/products/ protein-analysis/octet-
systems-software
Prisma 8.0GraphPadhttps://www.graphpad.com/ scientific-software/prism/ RRID:
SCR_002798
mabscapeQuesta cartahttps://github.com/helenginn/mabscape
https://snapcraft.io/mabscape
IBM SPSS Software 26 IBM https://www.ibm.com/us-en/?ar=1 RRID:
SCR_019096
Vettore: ScFv
umano
Università di Oxford, NDM (G. Screaton) N/A
Lisozima
Tris-base
Imidazolo
Triton X-100
Turbonucleasi
RNase A
NaCl
MgSO4
Na2HPO4
NaH2PO4
Sigma-Aldrich
Melford
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
QIAGEN
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Melford
Melford
Cat#L6876
Cat#T60040
Cat#56750
Cat#8787
Cat#T4330
Cat#158922
Cat#S9888
Cat#746452
Cat#S23100
Cat#S23185
Vettore:
pHLsec
(Aricescu et al.,
2006)
N/A

Altro
(Continua nella pagina seguente)
e2 Cell 189, 1-14.e1-e5, 29 aprile 2021
TALON® Superflow Metal Affinity Resin
HiLoad® 16/600 Superdex® 200 pg
Superdex 200 increase 10/300 GL column
HisTrap HP 5-ml column
Colonna HiTrap Heparin HT da 5 ml
Clontech
Cytiva
Cytiva
Cytiva
Cytiva
Cytiva
Cat#635668
Cat#28-9893-35
Cat#28990944
Cat#17524802
Cat#17040703

Articol
o
ll
ACCESSO
APERTO
Continua
Biosensori amminici reattivi di seconda
generazione (AR2G)
FortebioCat#18-5092
DISPONIBILITÀ DI RISORSE
Contatto principale Le risorse, i reagenti e le ulteriori informazioni richieste devono essere inoltrate al contatto principale, David I
Stuart (dave@strubi.ox.ac.uk).
Disponibilità dei materiali
I reagenti generati in questo studio sono disponibili presso il contatto principale con un accordo di trasferimento dei materiali
completato.
Disponibilità dei dati e del codice Mabscape è disponibile presso https://github.com/helenginn/mabscape,
https://snapcraft.io/mabscape. I dati che supportano i risultati di questo studio sono disponibili su richiesta presso gli autori
corrispondenti.
MODELLO SPERIMENTALE E DETTAGLI DEL SOGGETTO
Azioni virali
SARS-CoV-2/human/AUS/VIC01/2020 (Caly et al., 2020) e SARS-CoV-2/B.1.351, forniti dal Public Health England, sono stati
entrambi coltivati in cellule Vero (ATCC CCL-81). Le cellule sono state infettate con il virus SARS-CoV-2 usando un MOI di
0,0001. Il virus contenente il super-natante è stato raccolto all'80% di CPE e centrifugato a 2000 rpm a 4○C prima della
conservazione a -80○C. I titoli virali sono stati determinati da un saggio di focalizzazione su cellule Vero. Sia Victoria passaggio 5
e B.1.351 passaggio 4 stock sono stati sequenziati per verificare che conteneva la sequenza prevista proteina spike e senza
modifiche ai siti di furina scissione. Il virus B1.351 utilizzato in questi studi conteneva le seguenti mutazioni: D80A, D215G, L242-
244 cancellato, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V.
Ceppi batterici e coltura cellulare
Le cellule Vero (ATCC CCL-81) sono state coltivate a 37○C in Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) ad alto contenuto di
glucosio (Sigma-Aldrich) sup- pletato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM GlutaMAX (GIBCO, 35050061) e 100 U/ml di
penicillina-streptomicina. I mAbs umani sono stati espressi in cellule HEK293T coltivate in UltraDOMA PF Protein-free Medium
(Cat# 12-727F, LONZA) a 37○C con 5% CO2. I batteri E.coli DH5a sono stati utilizzati per la trasformazione del plasmide pNEO-
RBD K417N, E484K, N501Y. Una singola colonia è stata raccolta e coltivata in brodo LB con 50 mg mL-1 Kanamicina a 37○C a
200 rpm in un agitatore per una notte. Le cellule HEK293T (ATCC CRL-11268) sono state coltivate in DMEM alto glucosio
(Sigma-Aldrich) integrato con 10% FBS, 1% 100X Mem Neaa (GIBCO) e 1% 100X L-Gluta- mine (GIBCO) a 37○C con 5% CO2.
Per esprimere RBD, RBD K417N, E484K, N501Y e ACE2, le cellule HEK293T sono state coltivate in DMEM ad alto contenuto di
glucosio (Sigma) integrato con 2% FBS, 1% 100X Mem Neaa e 1% 100X L-Glutamina a 37○C per la trasfezione.
Partecipanti
I partecipanti sono stati reclutati attraverso tre studi: Sepsis Immunomics [Oxford REC C, riferimento:19/SC/0296]), ISARIC/WHO
Clin- ical Characterization Protocol for Severe Emerging Infections [Oxford REC C, riferimento 13/SC/0149] e il Gastro-intestinal
illness in Oxford: COVID sub studio [Sheffield REC, riferimento: 16/YH/0247]. La diagnosi è stata confermata attraverso la
segnalazione di sintomi coerenti con COVID-19 e un test positivo per SARS-CoV-2 utilizzando la reazione a catena della
polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) da un tampone del tratto respiratorio superiore (naso/gola) testato in laboratori
accreditati. Un campione di sangue è stato prelevato, previo consenso, almeno 14 giorni dopo la comparsa dei sintomi. Le
informazioni cliniche tra cui la gravità della malattia (infezione lieve, grave o critica secondo le raccomandazioni
dell'Organizzazione Mondiale della Sanità) e i tempi tra l'insorgenza dei sintomi e il campionamento e l'età del partecipante sono
stati raccolti per tutti gli individui al momento del campionamento.
Siero dei vaccinati Pfizer
Il siero del vaccino Pfizer è stato ottenuto 7-17 giorni dopo la seconda dose di vaccino che è stata somministrata 3 settimane dopo
Ottetto
RED96e
Fortebio
Sistema di scambio tampone
''QuixStand
Sonics vibra-cell vcx500 sonicator
GE Healthcare
VWR
https://www.sartorius.com/en/products/
proteina-analisi/sistemi di
rilevamento senza etichetta a
ottetto
Cat#56-4107-78
Cat#432-0137

la prima dose (i partecipanti erano al meglio delle loro conoscenze sieronegativi all'ingresso).
Cell 189, 1-14.e1-e5, 29 aprile 2021 e3

ll
ACCESSO
APERTO
Articol
o
Lo studio è stato approvato dall'Oxford Translational Gastrointestinal Unit GI Biobank Study 16/YH/0247 [comitato etico di
ricerca (REC) dello Yorkshire & The Humber - Sheffield]. Lo studio è stato condotto secondo i principi della Dichiarazione di
Helsinki (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-
subjects/) e le linee guida della International Conference on Harmonization (ICH) Good Clinical Practice (GCP). Il consenso
informato scritto è stato ottenuto per tutti i pazienti arruolati nello studio. I vaccinati erano operatori sanitari, con sede presso
l'Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, non noti per avere una precedente infezione da SARS-CoV-2. Ognuno ha
ricevuto due dosi di vaccino COVID-19 mRNA BNT162b2, 30 mg, somministrato per via intramuscolare dopo diluizione in una
serie di due dosi (0,3 mL ciascuna) a distanza di 18-28 giorni. L'età media dei vaccini era di 43 anni (range 25-63), 11 maschi e 14
femmine.
Procedure di studio del vaccino AstraZeneca-Oxford e trattamento dei campioni
Tutti i dettagli dello studio controllato randomizzato di ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222), sono stati precedentemente pubblicati
(PMID: 33220855/PMID: 32702298). Questi studi sono stati registrati presso ISRCTN (15281137 e 89951424) e ClinicalTrials.gov
(NCT04324606 e NCT04400838). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti, e lo studio è stato fatto in
conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki (2008) e la buona pratica clinica. Gli studi sono stati sponsorizzati
dall'Università di Oxford (Ox- ford, UK) e l'approvazione è stata ottenuta da un comitato etico nazionale (South Central Berkshire
Research Ethics Committee, riferimento 20/SC/0145 e 20/SC/0179) e da un'agenzia di regolamentazione nel Regno Unito
(Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency). Un DSMB indipendente ha esaminato tutte le relazioni intermedie sulla
sicurezza. Una copia dei protocolli è stata inclusa nelle pubblicazioni precedenti (PMID: 33220855/PMID: 32702298).
I dati dei volontari vaccinati che hanno ricevuto due vaccinazioni sono inclusi in questo documento. Le dosi del vaccino erano 5
3 1010
particelle virali (dose standard; coorte SD/SD n = 21) o metà dose come prima dose (dose bassa) e una dose standard
come seconda dose (coorte LD/SD n = 4). L'intervallo tra la prima e la seconda dose era nell'intervallo di 8-14 settimane. I
campioni di sangue sono stati raccolti e il siero separato il giorno della vaccinazione e in giorni prestabiliti dopo la vaccinazione,
ad esempio, 14 e 28 giorni dopo la spinta.
DETTAGLI DEL METODO
Analisi delle sequenze COG-UK
Le sequenze COG-UK del 2 febbraio 2021 (Tatusov et al., 2000), e le sequenze GISAID (https://www.gisaid.org/) del Sud Africa
del 30 gennaio 2021 sono state scaricate e la sequenza della proteina Spike è stata ottenuta dopo il nucleotide 21000, seguita
dall'allineamento di sequenza e dal riconoscimento delle mutazioni. La variante B.1.351 è stata filtrata utilizzando i criteri di
selezione 501Y e D242. La variante B.1.1.7 è stata filtrata usando i criteri di selezione 501Y e D69. Le posizioni strutturali delle
mutazioni sono state modellate in rosso (mutazioni a punto singolo), nero (delezioni) o blu (aggiunte) sulla struttura Spike con la
dimensione proporzionale al logaritmo dell'incidenza, e le mutazioni con incidenza superiore al 5% nella popolazione sono state
esplicitamente etichettate.
Focus Reduction Neutralization Assay (FRNT) Il potenziale di neutralizzazione dell'Ab è stato misurato usando il Focus Reduction
Neutralization Test (FRNT), dove la riduzione del numero di focolai infetti viene confrontata con un pozzo di controllo negativo
senza anticorpo. In breve, l'Ab o il plasma diluito in serie è stato mescolato con il ceppo SARS-CoV-2 Victoria o B.1.351 e
incubato per 1 ora a 37○C. Le miscele sono state poi trasferite in micropiastre a fondo piatto a 96 pozzetti, trattate per la coltura
cellulare, contenenti monostrati di cellule Vero confluenti in duplicato e incubate per altre 2 ore, seguite dall'aggiunta di un mezzo
di copertura semisolido all'1,5% di carbossimetilcellulosa (CMC) ad ogni pozzetto per limitare la diffusione del virus. Un focus
form-ing test è stato poi eseguito colorando le cellule Vero con umano anti-NP mAb (mAb206) seguita da perossidasi coniugata
capra anti-human IgG (A0170; Sigma). Infine, i foci (cellule infettate) circa 100 per pozzetto in assenza di anticorpi, sono stati
visualizzati aggiungendo il substrato TrueBlue Peroxidase. I foci delle cellule infettate dal virus sono stati contati sul classico
lettore AID EliSpot utilizzando il software AID ELISpot. La percentuale di riduzione dei focolai è stata calcolata e l'IC50 è stata
determinata utilizzando il programma probit del pacchetto SPSS.
Clonazione di RBD nativo, ACE2 e RBD K417N, E484K, N501Y
I costrutti di RBD nativo e ACE2 sono gli stessi di (Zhou et al., 2020). Per clonare RBD K417N, E484K, N501Y, un costrutto di
RBD con la mutazione N501Y (Supasa et al., 2021) è stato usato come modello e quattro primer di RBD (K417N primer Forward 50-
CAGGGCAGACCGGCAATCGCCGACTACAATTAC-30, K417N primer reverse 50-GTAATTGTAGTCGGCGATGCCGGTCT
GCCCTG-30, E484K Forward primer 50-CACCGTGTAATGGCGTGAAGGGCTTCAATTGCTAC-30
e E484K reverse primer 50-
GTAGCAATTGAAGCCCTTCACGCCATTACGGTG-30) e due primer del vettore pNEO (Forward primer 50-
CAGCTCCTGGG-
CAACGTGCT-30 e reverse primer 50-CGTAAAAGGAGCAACATAG-30
) sono stati usati per fare la PCR. I frammenti di DNA amplificati sono stati digeriti
con gli enzimi di restrizione AgeI e KpnI e poi legati al vettore pNEO digerito. Questo costrutto codifica esattamente la stessa
proteina come RBD nativo tranne le mutazioni K417N, E484K e N501Y, come confermato dal sequenziamento.

e4 Cell 189, 1-14.e1-e5, 29 aprile 2021

Articol
o
ll
ACCESSO
APERTO
Produzione di proteine
Produzione di proteine è stato come descritto in (Zhou et al., 2020). Brevemente, i plasmidi che codificano le proteine sono stati
espressi transitoriamente in cellule HEK293T (ATCC CRL-11268). Il mezzo condizionato è stato dializzato e purificato con una
colonna di nichel HisTrap 5 mL (GE Healthcare) e ulteriormente lucidato utilizzando una colonna di filtrazione gel Superdex 75
HiLoad 16/60 (GE Healthcare).
Interferometria a bio-strato
Gli esperimenti BLI sono stati eseguiti su una macchina Octet Red 96e (Fortebio). Per misurare l'affinità di anticorpi monoclonali e
ACE2 con RBD nativo e RBD K417N, E484K, N501Y, ogni RBD è stato immobilizzato su un biosensore AR2G (Fortebio). Gli
anticorpi monoclonali (Dejnirattisai et al., 2021) sono stati utilizzati come analiti o diluizioni seriali di ACE2. Tutti gli esperimenti
sono stati eseguiti a 30○C. I dati sono stati registrati utilizzando il software Data Acquisition 11.1 (Fortebio) e Data Analysis HT
11.1 (Fortebio) con un modello di adattamento 1:1 utilizzato per l'analisi.
QUANTIFICAZIONE E ANALISI STATISTICA
Le analisi statistiche sono riportate nei risultati e nelle legende delle figure. La neutralizzazione è stata misurata tramite FRNT. La
percentuale di riduzione del fuoco è stato calcolato e IC50 è stato determinato utilizzando il programma probit dal pacchetto
SPSS.The Wilcoxon matched-pairs signed rank test è stato utilizzato per l'analisi e due code P valori sono stati calcolati e valori
medi geometrici. I dati BLI sono stati analizzati utilizzando Data Analysis HT 11.1 (Fortebio) con un modello di adattamento 1:1.

Cell 189, 1-14.e1-e5, 29 aprile 2021 e5

Articolo
Cifre supplementari
ll
ACCESSO
APERTO
Figura S1. Neutralizzazione di Victoria e B.1.351 da parte del siero raccolto prima della vaccinazione, relativa alla Figura 3
Neutralizzazione per i ceppi Victoria e B.1.351 da parte di 50 sieri prelevati al giorno zero prima della prima dose di vaccino AstraZeneca. Tutti i sieri sono stati
analizzati in diluizioni triplicate a 1:20 e 1:60 per le diluizioni finali.

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