2. Зміст
• Епігенетика – загальні відомості
загальні відомості
• Механізми епігенетики
–М
Метилування ДНК та ремоделювання хроматину
ДНК
• Модифікатори
• Гомоцистеїн як універсальний модифікатор
ц у р д ф р
– Порушення біологічних процесів метилування
– Оксидативний стрес
– Гомоцистеїнування білків
– Потенціювання естроген‐індукованого гормонального раку
– Імпринтінг
– Пріонізація бі і
і і і білків
– РНК‐опосередковані модифікації
– Інактивація Х‐хромосоми
Інактивація Х хромосоми
• Методи досліджень
2
3. Сестри Діон (нар 1934)‐ п’ять однояйцевих близнючок
(нар. 1934) п ять однояйцевих
Генетично ідентичні Різні психотипи…..
Різні хвороби…
Різні долі….
Різні долі
4. Загальна інформація
• Епігенетика (επί‐над) – розділ медико‐біологічної науки, що вивчає
закономірності змін експресії генів чи фенотипу клітини, викликаних
механізмами, що не пов’язані зі зміною послідовності ДНК.
,щ д Д
• Епігенетика характеризує процес взаємодії організму із
середовищем при формуванні фенотиву
• І
Історія питання
і
– 1942 – Конрад Уоддінгтон – термін “Епігенетика”
(похідне від “генетика” та “епігенез”) ‐ концептуальна модель взаємодії
генів зі своїм оточенням при формуванні фенотипу.
генів зі своїм оточенням при формуванні фенотипу
“…дослідження механізмів тимчасового та просторового контролю
активності генів в процесі розвитку організмів…”
Епігенетичні процеси – норма чи патологія?
і і і і
Епігенетика досліджує механізми, за допомогою котрих, на основі генетичної
інформації, що міститься в одній клітині (зиготі), за рахунок різної експресії генів в
різних типах клітин може відбуватися розвиток багатоклітинного організму, що
складається із диференційованих клітин.
і ф ій і
4
5. Епігенетичне наслідування
Імпринтінг – варіант епігенетичної спадковості, при якому
специфічний характер дференційної активності генів
фі й ф ій і і
визначається статтю організма, від кого вони успадковані.
ON OFF
Імпринтінг
І і виходить за межі
і класичних правил
Менделевського наслідування.
5
6. Ефекти епігенетики
• Геномний імпринтінг (та його порушення)
• Дифференцирование клеток
• Трансгенеративні епігенетичні ефекти
Т і і і ф
• Мутаційний процес
у ц р ц
• Новоутворення
• Старіння організму
і і
• Консерватиність генетичної інформації
р ф р ц
6
8. Метилування ДНК
S. M. Tailor. p53 and deregulation of DNA
methylation in cancer. Cellscience Reviews 2006
Vol.2 No.3
9. Термін Дефініційне визначення поняття, характеристика
Метилування Ензиматична модифікація цитозину (С), розташованого у 5’ положенні до гуанозину (G) у CpG-динуклеотиді,
ДНК що полягає у приєднанні метильної групи до вуглецю, призводячи до формування 5’-метилцитозину (5-mC)
Ступінь Загальна сума метильованих цитозинів чи CpG-динуклеотидів відносно їх загальної чисельності. Визначення
метилування цього показника має певне інформативне значення, але воно недостатнє для встановлення прогностичних та
геному діагностичних маркерів та вивчення механізмів пухлинної прогресії, формування ФЛР тощо.
Рівень Усередненений показник метилування ДНК за одним конкретним CpG-динуклеотидом в обох ланцюгах
метилування геномної ДНК отриманого зразку. Інформація стосовно рівнів метилування окремих CpG-динуклеотидів є вкрай
ДНК необхідною для встановлення кількісних відмінностей у метилуванні важливих регуляторних послідовностей.
Структура Характеристика статусу метилування певної послідовності CpG-динуклеотидів однієї спіралі ДНК. Наявність
(карта) специфічних для окремих захворювань структур метилування ДНК дає можливість використовувати цей
метилування показник з діагностичною та прогностичною метою.
ДНК
Профіль Характеристика всієї геномної ДНК за її множинними сайтами. Може бути визначена у вигляді профілю рівня
метилу-вання чи структури метилування. Надає інформацію стосовно множинності сайтів геному, забезпечуючи унікальний
ДНК підхід до молекулярної діагностики останнього.
Гіпометилува Зниження рівня метилування ДНК у зразку за будь-яким окремим CpG-динуклеотидом чи групою CpG-
ння ДНК динулеотидів (чи навіть за всім геномом) у відношенні до контрольного зразку ДНК.
ГіперметилуваПідвищення рівня метилування ДНК в зразку за будь-яким окремим CpG-динуклеотидом чи групою CpG-
ння ДНК динулеотидів у відношенні до контрольного зразку ДНК.
а) метилування геному в цілому;
Окремі б) рівень метилування ДНК;
в) структура метилування ДНК;
) ру ур у Д ;
категоріальні
категоріальні г) профіль рівня метилування;
поняття д) профіль структури метилування.
Микитенко Д. О., 2008
9
11. Поширення в геномі
У нормальних клітинах метилування
зустрічається, в основному, в повторюваних COMPOSITION OF GENOME
CpG DISTRIBUTION
фрагментах ДНК (сателітна ДНК, генетичні CpG Island/1st Exons Overlap 0.11% Other Ensembl Exons 1 83%
1.83%
елементи, такі як LINES, SINES, ендогенні Ensembl 1st Exons (Non-overlapping)
0.2%
DNA Transposons 3.6%
CpG Island (Non-overlapping)
ретровіруси) та в кодуючій частині генів, за 0.57%
LINE
виключенням першого екзону. LINE
22.9%
22.9%
Other
Other
38.7%
38.7% LTR
LTR
9.3%
У геномі ссавців зустрічаються короткі ділянки SINE
9.3%
Low Complexity
SINE
10.1%
(фрагменти) довжиною 0,5‐4 kB, які збагачені 10.1% Repeats 1.3%
Other Repeats
вмістом CG‐динуклеотидів і розміщені, в Simple Repeats
0.15%
Alpha Satellite
Rollins et al., 1.7% Classical Satellite 2.07%
основному, в проксимальній частині Genome Res., 2006 2.1%
регуляторної ділянки генів, відомі як CpG‐
острівці. Їх метилування призводить до
і і Ї
репресії промотору, а отже, й інактивації
функції всього гена.
11
12. Organization of Tissue Specific‐
N Chromatin in Active and Methylation
O Inactive States
Inactive States
R
M
A X‐Chromosomes
Inactivation Genomic
G i
L Imprinting
C
E DNA
Silencing of Foreign
Sil i fF i Methylation
L
DNA Sequences
L
C
Hypermethylation of
A Gene‐specific
CpG Islands of Tumor
CpG Islands of Tumor hypomethylation
h th l ti
N Suppressor Genes Global Genomic
C Hypomethylation
E
R
C
Disruption of the p16INK4a/Rb, Activation of
E p53/p14ARF and APC/ß‐catenin oncogenes, loss of
L Pathways, Defects in Mutation Repair
Pathways Defects in Mutation Repair Chromosomal
Chromosomal imprinting
Networks (hMLH1,BRCA1, MGMT) Instability, Aneuploidy
L and Generation of Mutations, Loss of Activation of
Adapted from J Pathol (2002) 196: 1-7
Apoptosis and Adherence Transposons, Gene Up‐
Mechanisms Regulation
14. Втрата метилування ДНК в ембріоні (миша)
ДНК в ембріоні (миша)
призводить до його загибелі на 10 день розвитку
Li et al, 1992, Cell
Метилування ДНК є необхідним інструментом
Регуляції геному для нормального розвитку організму
Значення диференційного метилування окремх сайтів ДНК?
17. ДНК‐метилтрансферази
• редокс‐чутливі ферменти.
редокс чутливі ферменти
• DNMT1 ‐ підтримувальне метилування in vivo, відповідає за
правильний розвиток ембріону, імпринтінг, інактивацію Х‐хромосоми
та відновлення структури метилування ДНК після її реплікації. Вона в
та відновлення структури метилування ДНК після її реплікації. Вона в
найбільшій кількості присутня в соматичних клітинах і локалізується у
фокусах реплікації ДНК, взаємодіє з ядерним антигеном
проліферуючих клітин (PCNA).
• DNMT3а та DNMT3b ‐ метилування de novo. Експресуюються в
ембріональних клітинах і на низькому рівні в соматичних клітинах
дорослої особини.
• DNMT 3L наявна в статевих клітинах і взаємодіє з DNMT3a та DNMT3b
DNMT 3L і і і DNMT3 DNMT3b
за їх спільної участі в імпринтінгу батьківських генів.
• DNMT2 виявляється в усіх типах клітин, але не проявляє
ферментативної активності, тому її функція ще має бути встановлена.
ферментативної активності тому її функція ще має бути встановлена
Взаємовідношення між різними
видами метилтрансфераз (de novo та
підтримувальними) й процесами
демдля встановлення порушень
шляхів епігенетичного
регулюванняетилування є важливим.
17
18. Порушення функції ДНК‐метилтрансфераз
1. Порушення балансу‐окисно‐відновних процесів в організмі
2. Дефіцит субстрату
3. Ефект дози гену (анеуплоідії, незбалансовані геномні
3 Ефект дози гену (анеуплоідії незбалансовані геномні
перебудови в локусах, де картовані одноіменні кодуючі гени)
4. Мутації генів
Мутації генів
мутація гена DNMT3B викликає розвиток синдрому ICF (Immunodeficiency–
centromeric instability–facial anomalies) :
y )
•нестабільность центромерних ділянок хромосом,
•Імунодефіцит
•аномалії обличчя.
Синтез мутованого ферменту сприяє порушенням метилування de novo і в результаті
викликає гіпометилування юкстаце‐нтромерного гетерохроматину, в першу чергу, 1‐
ої, 16‐ої та Х‐хромосоми, спричиняючи чисельні хромосомні порушення, наприклад,
аномальну деконденсацію хроматину, спарювання, розділення та розпад
перицентромерних ділянок хромосом.
18
19. Механізми репресії транскрипції генів
• метилування безпосередньо інгібує зв язок транскрипційних факторів з
метилування безпосередньо інгібує зв’язок транскрипційних факторів з
їхніми сайтами впізнання, що містять CpG‐острівці, які найчастіше
знаходяться в районах промоторів генів, поширюючись на перший
екзон гена;
• залучення метил‐зв’язуючих білків чи білкових комплексів, відповідно
MeCP2 та MeCP1, які, специфічно зв’язуючись з метильованими CpG‐
ділянками, можуть непрямим шляхом інгібувати зв’язування
транскрипційних факторів, обмежуючи їх доступ до регуляторних
елементів.
19
30. Історія відкриття
р д р
Гомоцистеїн – сірковмісна амінокислота, що не зустрічається
в природних білках, які вживаються з їжею, а є проміжним
продуктом обміну амінокислот метіоніну та цистеїну.
Вперше отримана: L. Butz та V. du Vigneaue у 1932 р.
Референтні значення (WHO):
Нормальний рівень: < 10 мкМ/л
Субнормальний рівень: 10‐15 мкМ/л
Гіпергомоцистеїнемія: легка: 15‐25 мкМ/л
помірна: 25 30 мкМ/л
25‐30
важка: > 30 мкМ/л
30
Rasmussen K. 2000, Пентюк О. О. 2003
31. Захвоювання, асоційовані з гіпергомоцистеїнемією
Захвоювання асоційовані з гіпергомоцистеїнемією
• Серцево‐судинні захворювання
– АТ ІХС І М атеросклероз атеротромбоз інсульти
АТ, ІХС, І.М., атеросклероз, атеротромбоз, інсульти
• Захворювання системи крові
• Неврологічні захворювання
– Хвороба Альцгеймера
• Захворювання нирок
• Захворювання щитоподібної залози
Захворювання щитоподібної залози
• Онкологічні захворювання
– Рак простати, легень, РМЗ, яєчників
• Патологія вагітності
• Вроджені аномалії
– Дефекти нервової трубки вовча паща (Cleft Palate)
Дефекти нервової трубки, вовча паща (Cleft Palate),
с‐м Дауна* (???)
*) D.S.Rosenblatt. Am J Clin Nutr, 1995
James et al.Am J Clin Nutr 1999;70:429‐30
A. Chango et al. British J of Nutr, 2005
Kenneth F. Trofatter , Pregnancy and Childbirth, 2007
31
32. Патофізіологічні ефекти гомоцистеїну
ф ф ц у
• П
Порушення біологічних процесів
бі і і
метилування
• Оксидативний стрес
• Гомоцистеїнування білків
• Потенціювання естроген‐індукованого
гормонального раку
32
33. Зміни метилування гена mdr1 та експресії P‐gp під впливом
Метилування mdr1
гомоцистеїну
ї
Експресія P‐gp
Статус метилування промотору гена
Ген
Г
MCF-7 MCF-7/Hom
mdr1 гіперметильований. гіпометильований .
GSTp гіперметильований. гіпометильований .
tp53 гіпометильований гіперметильований.
tp73 гіпометильований гіперметильований.
bcl-2 гіпометильований гіперметильований.
CDH1 гіпометильований гіперметильований.
3,5
Цисплатин Доксорубіцин
3,0 5,00 5,00
Середнє значення
5,00
±SD
DNMT1 / β-Actin
ті
4,50
4 50
Рівень резистентност
2,5
25
4,00 3,00
3,50 2,50
2,0 2,50 2,50
3,00
2,50 1,70
2,00 1,50
1,5 1,50
1,00
1,0 0,50
0,00
1,00
, 3,00
, 5,00
, 10,00
,
0,5
Введення гомоцистеїну
0,0
Mcf-7
Mcf-7 Hom
Експресія DNMT1 33
Микитенко Д. О., 2006 ‐ 2008
34. Інтенсивність процесів окисної модифікації білків
р ц д ф ц
3,6
F = 69,96, p = 0,00007
Рівень карбонільни груп; С , mM 6кл
3,4
M/10
3,2
, Середнє значення
±SE
3,0 ±SD
2,8
их
2,6
26
2,4
2,2
2,0
20
ь
1,8
1,6
MCF-7 S MCF-7 Hom2 MCF-7 Hom5
Рівень карбонільних груп в мМ на 1 млн клітин при
довжині хвилі 370 нм, + SD
Клітинна лінія P
2 пасажи з
вихідні 5 пасажів з HOM
HOM
F(2,6) = 69,96;
MCF-7 2,93+0,04 1,78+0,03 3,11 + 0,26
P < 0,001
34
Микитенко Д. О., 2008
38. Гіпергомоцистеїнемія та вагітність
• Клінічні прояви: ранній початок та/чи важкий перебіг гестозу,
фетоплацентарна недостатність, відшарування плаценти (OR=3.0),
внутрішньоутробна затримка розвитку або загибель плоду (Vollset S.E. et al.,
2009).
)
• Гіпергомоцистеїнемія може призводити до:
– а) порушення та активації ендотеліальних клітин мікротромбози (Ellison
et al., 2004);
– б) посилення агрегації тромбоцитів порушення процесів імплантації,
плацентації та фетоплацентарного кровообігу (OR=5,0; M.d.R.Rodríguez‐
Guillén et al., 2009).
На пізніх термінах вагітності спостерігають:
– а) виникнення генералізованої мікроангіопатії пізній гестоз (OR від 2.0
до 20.9) з розвитком важких станів (Vollset et al., 2009);
– б) розвитку хронічної внутрішньоутробної гіпоксії плоду;
– в) народження дітей із низькою вагою та зниженим функціональним
) р д д фу ц
резервом усіх життєзабезпечуючих систем (Murphy et al., 2004).
• Гіпергомоцистеїнемія може супроводжуватися розвитком вторинних
аутоімунних реакцій (антифосфоліпідний синдром???)
38
39. Гомоцистеїн та вагітність
Мета‐аналіз зв’язку між прееклампсією та MTHFR 677C>T AND 1298A>C POLYMORPHISMS AND
деякими метаболічними порушеннями RISK OF SPONTANEOUS ABORTIONS
María del Rosario
Rodríguez‐Guillén et
al., 2009
L. Wilkins‐Haug, 2003
Dose‐response relation
between log plasma total
homocysteine (tHcy) and
the risk of placental
abruption, preeclampsia in
p g
pregnancies
<37 wk gestation, and
neural tube defects
39
Stein Emil Vollset et al. 2009
42. Гіпергомоцистеїнемія та вроджені вади розвитку плоду
р ц р д д р у ду
• Гомоцистеїн здатний вільно проникати крізь плаценту та
ц д р р ц у
може спричиняти прямий тератогенний і фетотоксичний
вплив (Микитенко Д. О., 2008).
– виникнення дефектів нервової трубки, зокрема, аненцефалії та
спинномозкової кили (Nathalie M.J. et al., 2001)
– розщеплення губи й/або піднебіння
– у важких випадках: помутніння та підвивих кришталика ока
(Njälsson R. et al., 2007); олігофренія різного ступеню.
• Порушення нормальної сегрегації хромосом в процесі
мейозу та підвищення ризику народження дитини з
трисомією 21 в 2,6 рази (K.Trofatter , 2007)
42
48. Механізм розпізнавання ділянок
імпринтінгу
1. Розпізнання молекулярних маркерів
імпринтінгових ділянок (Neuman B. et al. Characteristics of
р д
imprinted genes/Nat Genet. 1995. vol. 9)
2. Функціонування протизмістовних
транскриптів
(Wutz A. et al. Imprinted expression of the Igf2r gene …/ Nature. – 1997. Vol. 386, N. 6652)
49. Молекулярні маркери імпринтінгових ділянок
Myotonic Dystrophy
DMPK: Muscle Protein Kinase, chromosome 19
[CTG CTG CTG CTG CTG CTG]
Normal: 5-27 repeats
Affected individuals: 50-1000+ bp
DMPK DMAHD DMWD
Pizzuti A. et al. The myotonic dystrophy gene. Arch. Neurol. 50: 1173‐9, 1993.
50. Протизмістовні транскрипти
ON
OFF
IGF2 H19
Insulin‐like growth factor receptor 2 non‐coding RNA
OFF ON
IGF2 H19
Wutz A. et al. Imprinted expression of the Igf2r
gene …/ Nature. – 1997. Vol. 386, N. 6652
Grewal and Jia Nature Reviews Genetics 8, 35–46 (January
2007) | doi:10.1038/nrg2008
51. Збалансована регуляція
Порушення і
П імпринтінгу
і
K. Temple. Genomic imprinting. Univ of Southampton, 2009
52. Порушення імпринтінгу
• Патологічні стани при порушенні імпринтінгу
– Геномний рівень
р
• хорионепітеліома
– Хромосомний рівень
• Встановлено: 7, 10, 11, 14, 15
• Припускається: 1 2 5 6 16 19 20 22
Припускається: 1, 2, 5, 6, 16, 19, 20, 22
– Генний рівень
53. Деякі хвороби імпринтінгу
Upd(1)mat NOEY2
Upd(2)mat ВЗРП
Upd(4)mat Вн.утробная гибель плода
Upd(6)pat Диабет новорожденных
Upd(7)mat Синдром Сильвера-Рассела
Upd(7)pat/mat Муковисцидоз, лицевые дизморфии
Upd(11)pat Синдром Беквита-Видемана
Беквита Видемана
Upd(14)mat Преждевременное половое
созревание, Вн.утробная гибель
плода
д
Upd(14)pat Карликовость
Upd(15)mat Синдром Прадера-Вилли
Upd(15)pat Синдром Ангельмана
Upd(15)pat/mat Значимых отклонений в развитии
плода не опеределяется
Upd(16)mat ВЗРП
Upd(20)mat ВЗРП
Upd(21)mat Вн.утробная гибель плода
ICF-синдром
Синдром Р
С Ретта
Болезни тринуклеотидных повторов
54. Механізм утворення однобатьківських дисомій
Н. Kokkonen. Genetic changes of chromosome region 15q11‐q13 in Prader‐Willi and Angelman syndromes in Finland. Acta
Universitatis Ouluensis. Medica, 2003
58. Прионизация белков
• Прионы ‐ особый класс инфекционных агентов, чисто
П б й ф
белковых, не содержащих нуклеиновых кислот,
вызывающих тяжёлые заболевания центральной
нервной системы у человека и ряда высших животных
(т. н. «медленные инфекции»).
• Прионный белок, обладающий аномальной
трёхмерной структурой, способен прямо
трёхмерной структурой способен прямо
катализировать структурное превращение
гомологичного ему нормального клеточного белка в
себе подобный (прионный), присоединяясь к белку‐
мишени и изменяя его конформацию.
мишени и изменяя его конформацию
Прионы — единственные инфекционные агенты, размножение которых происходит
без участия нуклеиновых кислот.
Прионы отличаются составом аминокислот характерных для данного вида
отличаются составом аминокислот, характерных для данного вида,
определяемых видовым геном прионового белка, а также так называемыми
посттрансляционными модификациями или степенью гликозилирования базовой
белковой цепочки.
белковой цепочки
58
59. РНК‐опосередковані модифікації
(RNase III
endonuclease)
:
DGCR8
Unwind
Drosha
(RNase III
endonuclease)
7MGpppG
AAAAA
Imperfect Perfect
Complementarity Complementarity
5’ 3’ UTR ORF
UTR AAAAA 7MGpppG
7MG G AAAAA
Pol II Target
7MGpppG OR
F mRNA
mRNA cleavage
TRANSLATIONAL
REPRESSION
60. Інактивація Х хромосоми
Х‐хромосоми
Ген Xist
K. Temple. Genomic imprinting. Univ of Southampton, 2009
2007 Nature Publishing Group, Ng, K., et al., Xist and the order of silencing, EMBO reports 8, 34–39.
61.
62. Epigenetics: Mediator of Environment, Development,
and Disease
Estrogen
E t Herbicides
H bi id
Nutrition Vitamins Drugs
Disruptors Pesticides
Epigenetics
Reproductive Pathology Cardiovascular
Disorders Disorders
Growth Neurological
Disorders Disorders
Pediatric Lupus
Disorders Cancer
Imprinting
Disorders
(с) Mellissa Mann, Susceptibility of Genomic Imprinting to ART, 2009
63. Епігенетика: методи досліджень
•Визначення тотального вмісту dmC
•Зворотньо‐фазова ВЕРХ
•ELISA
•Чутливий до метилування рестрикційний аналіз
•Бісульфітне секвенування
•Специфічна до метилування ПЛР (MSP)
С фі ПЛР (MSP)
•COBRA (комбінований бісульфіт‐рестрикційний аналіз)
• ms‐SNUPE (Methylation‐sensitive single‐nucleotide primer extension)
•Імунопреципітація ДНК (MeDIP та MeDIP seq)
ДНК (MeDIP та MeDIP‐seq)
•Імунопреципітація хроматину
63
66. Schematic outline for analysis of DNA methylation based on oligonucleotide microarray.
Gitan R S et al. Genome Res. 2002;12:158-164
Cold Spring Harbor Laboratory Press
72. ALTERATIONS OF HISTONE H3 MODIFICATIOINS IN THE
LIVER OF F344 RATS DURING METHYL DEFICIENCY
150
ol
*
Relative level of modification, % from contro
Control 9 weeks 18 weeks36 weeks Tumor 140
130
* * *
H3K9me3 120
110
H3K9me2 100 Control
90 9 weeks
H3K9me1 80 *
* 18 weeks
70
H3K9ac 60 36 weeks
50 * * * Tumor
f
H3S10ph 40 *
30
H3 20
10
0
H3K9me3 H3K9ac H3S10ph
M M
M P M A P P A MA A MM P M
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKP-…-C
2 4 9 10 11 14 17 18 23 26 27 28 36
Interplay between H3K9me3, H3K9Ac, and H3S10ph
i. Pogribny, 2007
74. Міфотворчість
“…The integration of standard
massage practices and the
knowledge of the biology of
adversity will change our minds,
our physiology, our epigenetics—
and hence our massage practice.”
March 2012
75. “Our goal is to preserve the past
using 21st century technology”
James Dewey Watson
Дякую за увагу
(044) 592 21 78
E‐MAIL: d.mykytenko@genetics.kiev.ua
E MAIL d k k @ i ki
Клініка репродуктивної медицини
«НАДІЯ»
www.ivf.com.ua 75