1. 1. EMBL-EBIにて、遺伝子配列（ mRNA配列）を調べる。
2. mRNA配列をテキストエディタに張り付け、
改行を削除する。
3. Primer 3Plusにて、上記のmRNA配列を投げる(Step 1~4)。
How to design qPCR primer
130715
http://www.ebi.ac.uk
『 遺伝子名』 + 『種名』
をクエリーとする
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/
張付け
qPCRに変更
投げる
Satoshi Kume, Ph.D.
Pick primers
1
2
3
4
『目的の遺伝子配列

2. 4. Primer-BLAST in NCBI
（※）右のような結果が得られる。
ココ！
Primer配列の張付け！
種の選択（例: rat）
実行！
Primer配列
5. 増幅断片数の確認
増幅候補は１つであることが必須！
qPCRのProduct lengthは、150 ~ 300がBetter。
長さOK！
候補OK！
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
NCBI → BLAST → Specialized BLAST → Primer-BLAST
1
2
3
4

3. → 違う候補を探す。
● Primerの3’末端から5 bpのうち、G/Cが4 bp以上だと、良くない！
● 3’末端最後の塩基は、GかCにする。
E1 E2 E3
Gene
mRNA E1 E2 E3
Forward
Reverse
Transcription
理想型Primer
● 理想的には、下図のようにエキソンとエキソンの間でPrimerを設計する。
5. qPCR primerの最終チェック
→ 違う場合は、Primerを伸ばすか削るかして対処する。
● Tm（60 ℃くらい）は、Primer間でできる限り える。
EMBL-EBIにて調べられる。
エキソンが１個だけなら、
考えなくてよい。