iPSCs

Optimized ApproachesOptimized Approaches
for Generation of Integration-free iPSCsfor Generation of Integration-free iPSCs
from Humanfrom Human Urine-Derived CellsUrine-Derived Cells
with Small Moleculeswith Small Molecules (SM)(SM)
and Autologous Feederand Autologous Feeder
Di Li, Linli Wang, Jundi Hou, Qun Shen, Qianyu
Chen, Xiaoshan Wang, Juan Du, Xiujuan Cai,
Yongli Shan, Tian Zhang, Tiancheng Zhou, Xi Shi,
Yuhua Li, Hua Zhang, and Guangjin Pan

Παραγωγή iPSCs από hUCsΠαραγωγή iPSCs από hUCs
Στη μελέτη αυτή:
 βελτιστοποιούμε μεθόδους επαναπρογραμματισμού για hUCs
με πολύ χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού, χρησιμοποιώντας
ένα σύνθετο «κοκτέιλ» παραγόντων (SM).
 αντικαθιστούμε το matrigel με αυτόλογα τροφικά hUCs.
 δημιουργούμε «τράπεζες» ειδικών iPSCs για τον ασθενή, με
βολικό και μη επεμβατικό τρόπο, για εξατομικευμένη ιατρική,
ανακάλυψη φαρμάκων και μοντελοποίηση ασθενειών.
ΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝΣΤΕΦΟΥ ΣΤΑΘΟΥΛΑ – ΜΠΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

 καλλιέργειες hUCs από διαφορετικούς δότες
 σημαντικός αριθμός των hUCs με πολύ χαμηλό ρυθμό
πολλαπλασιασμού
 προβληματικά για περαιτέρω παραγωγή iPSC.

http://www.cell.com/stem-cell-reports/abstract/S2213-6711(16)30007-8

Τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές hUCs (HM1-1, HM1-2, και HM1-3)
από το ίδιο άτομο, επαναπρογραμματίζονται χωρίς SM. (Α)
Καμπύλες ανάπτυξης των hUCs με P 2-5. (Β)
Άρα ο κυτταρικό πολλαπλασιασμό είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για
μια επιτυχημένη γενιά iPSC.
Κοκτέιλ με αναστολέαΚοκτέιλ με αναστολέα pp53 (CPFT-α) και άλλα μικρά μόρια (53 (CPFT-α) και άλλα μικρά μόρια (SM)SM) βελτιώνει τηνβελτιώνει την
απόδοση επαναπρογραμματισμού των UCs από υγιείς ενήλικεςαπόδοση επαναπρογραμματισμού των UCs από υγιείς ενήλικες

Τα ποσοστά απόπτωσης, λόγω ηλεκτροδιάτρησης, δεν αυξήθηκαν
σημαντικά σε hUCs με υψηλότερο Ρ.
Άρα η απόπτωση των hUCs ίσως δεν είναι ο περιοριστικός
παράγοντας που καθορίζει το ποσοστό του
επαναπρογραμματισμού.

 Η p53 αυξήθηκε από το Ρ6 στο Ρ12, των hUCs (D).
 Με προσθήκη CPFT-α, μειορρυθμίζεται η p53 (Ε), ενώ βελτιώνεται
σημαντικά, η απόδοση του επαναπρογραμματισμού (F, G).
Άρα η p53 θα μπορούσε να είναι ένας αρνητικός παράγοντας για
επαναπρογραμματισμού των hUCs.

Plan B: Προσθέσαμε τους 5 παράγοντες (SM) στο αρχικό στάδιο
(πρώτες 7 ημέρες) και μία ακόμη ένωση, PD, σε μεταγενέστερο στάδιο,
για επέκταση του επαναπρογραμματισμού των iPSCs (H).
Απόδοση επαναπρογραμματισμού με plan B, με P 2-5 (I).

Χαρακτηρισμός δημιουργημένων iPSCs, με plan Bplan B, από υγιή
αρσενικά(ΗΜ1-iPS) και υγιή θηλυκά (IF1-iPS).
Φυσιολογική μορφολογία ανθρώπινων εμβρυικών βλαστικών (A,B), φυσιολογικός καρυότυπος (C,D), ΑΡ
θετικότητα σε πολλά passages (E,F), ανίχνευση γονιδίων πολυδυναμίας με FACS (Η), απομεθυλιωμένοι
υποκινητές Oct4 και Nanog (Ι), τερατώματα (J) σε ποντίκια μετά από έκχυση.

Η απόδοση του επαναπρογραμματισμού με το
plan Bplan B,, μειώθηκε κατά το ήμισυ περίπου, όταν
και οι έξι SMs αποσύρθηκαν σε μετέπειτα
στάδιο (RM + 5Μ [ACTPN σε RM] -mTeSR1).
Μειώθηκε ακόμα πιο δραματικά με την
απόσυρση στο αρχικό στάδιο επαγωγή (RM-
mTeSR1 + 6M [ACTPN + PD σε mTeSR1]).
Άρα η χρήση των SMs σε πρώιμο στάδιο είναι
πολύ πιο απαραίτητη για τον
επαναπρογραμματισμό.

Ο ρόλος των SM ξεχωριστά, σε hUCs με χαμηλό πολ/σμό (Κ).
Μπορούν να αφαιρεθούν οι Α και Τ, χωρίς σημαντική μείωση
Ο ρόλος των SM ξεχωριστά, σε hUCs με κανονικό πολ/σμό (L).
Mπορεί να αφαιρεθεί ο N, χωρίς σημαντική μείωση

Ανοσοφθορισμός των αποικιών του Oct4 + με εισαγωγή PD (SM)
σε προχωρημένο στάδιο (Ρ5) (plan C)plan C).

Πτώση επιπέδων έκφρασης, 14 γνωστών αναστολέων του
επαναπρογραμματισμού σε hUCs με RM+5SM

Το ποσοστό επιβίωσης των hUCs μετά την ηλεκτροδιάτρηση για τη
διαμόλυνση των παραγόντων επαναπρογραμματισμού ήταν μικρότερο
από 10% (Α).
Επιτυχής δημιουργία αποικιών iPSC εάν ο αριθμός των επιζώντων
κυττάρων είναι πάνω από 2,5x104
. Όχι, όμως, εάν είναι λιγότερα από 1,5
x104
(cells/well) (Β).
ΑυτόλογαΑυτόλογα UCsUCs τροφικά διευκολύνουν τον επαναπρογραμματισμό των UCs μετροφικά διευκολύνουν τον επαναπρογραμματισμό των UCs με
χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμούχαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού

hUCs από ασθενή με διαβήτη τύπου 1 (T1D3-P4),
δεν μπορούν να δημιουργήσουν iPSCs χρησιμοποιώντας planplan ΒΒ,
λόγω των χαμηλών ποσοστό επιβίωσης μετά την ηλεκτροδιάτρηση
(πάνω).
Χρησιμοποιώντας το planplan CC εμφανίστηκαν κλώνοι iPSC, (κάτω).

Πυκνότητα των τροφικών UCs και βέλτιστος επαναπρογραμματισμός
σε:
• UCs με χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού και μεγάλο P (D)
• UCs με κανονικό ρυθμό πολλαπλασιασμού και μικρό P (E). Η
χρήση αυτόλογων τροφικών hUCs δεν ήταν ωφέλιμη, ίσως και
ανασταλτική (Ε).

Κύτταρα από ανθρώπινη ακροποσθία (HFF1-P8) και κύτταρα
αμνιακού υγρού (AF1-P6), ως τροφικά (F και G), έχουν μικρή
επίδραση στον επαναπρογραμματισμό.
Aντικατάσταση του Matrigel με συγκεκριμένο αριθμό αυτόλογα hUCs
(gelatin+feeder) και παραγωγή iPSCs (Η).

Ανθρώπινων iPSCs με διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο
PlanPlan ΑΑ για hUCs με υψηλό πολλαπλασιασμό.
PlanPlan ΒΒ για hUCs με μέτριο πολλαπλασιασμό.
Plan CPlan C αν το ποσοστό επιβίωσης των hUCs μετά την
ηλεκτροδιάτρηση είναι πολύ χαμηλό.
Σύγκριση τωνΣύγκριση των planplan ΑΑ,, planplan ΒΒ, και, και plan Cplan C για επαναπρογραμματισμός των UCs,για επαναπρογραμματισμός των UCs,
σε κύτταρα αμνιακού υγρού και μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από αίμασε κύτταρα αμνιακού υγρού και μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από αίμα
ομφάλιου λώρουομφάλιου λώρου

Χρώση αλκαλικής φωσφατάσης, των επαγώμενων iPSCs από
HM1-3-P3 (Β).
hUCs με μέτριο πολλαπλασιασμό για iPSCs με plan A, B, Cplan A, B, C.
Το planplan CC ήταν το καλύτερο, μετά το Β,Β, και μετά το ΑΑ (Β και C).

Δημιουργία τράπεζας iPSCs από τις περισσότερα είδη κυττάρων (D-F)
με planplan Α, Β,Α, Β, και CC.

Επαναπρογραμματισμός κυττάρων αμνιακού υγρού (AF1) (G) από
ομφάλιο λώρο (MSCs) με planplan Α, Β,Α, Β, και CC.
Πολύ μικρότερος επαναπρογραμματισμός μεσεγχυματικών βλαστικών
κυττάρων από ομφάλιο λώρο (MSCs) με planplan Α, Β,Α, Β, και CC.

• Παραγωγή των ανθρώπινων iPSCs μέσω μη ιικής ενσωμάτωσης
είναι συνήθως αργή και λιγότερο αποτελεσματική
• Ένας μεγάλος αριθμός απομονωμένων hUCs έδειξαν χαμηλό
πολλαπλασιασμό και ήταν δύσκολο να επαναπρογραμματιστούν
για την παραγωγή iPSCs χρησιμοποιώντας την μη-ιική
προσέγγιση.
• Δύσκολη η φύλαξη iPSCs από διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο
και διαφορετικούς ασθενείς.
Αλλά
• Κύτταρα που απομονώνονται από ανθρώπινα ούρα παρέχουν
ένα βολικό και μη επεμβατικό τρόπο για να ληφθούν κύτταρα του
ασθενούς για παραγωγή iPSCs.
ΣΥΖΗΤΗΣΗΣΥΖΗΤΗΣΗ

Ρόλος των SM τον επαναπρογραμματισμό hUCsΡόλος των SM τον επαναπρογραμματισμό hUCs
• Ο C (Chir, αναστολέα GSK3b) και ο Ρ (CPFT-α, αναστολέας
p53) έδειξαν σημαντική βελτίωση στον επαναπρογραμματισμό
hUCs, ενώ ο Ν (ΝαΒ, αναστολέας της HDAC) έδειξε μέτρια
βελτίωση.
• Ο Α (Α-83-01, αναστολέας TGF-β) και ο Τ (TZV, αναστολέας
ROCK) είχαν ελάχιστη επίδραση όταν χρησιμοποιήθηκαν μόνοι
τους.

Ρόλος των SM τον επαναπρογραμματισμό hUCsΡόλος των SM τον επαναπρογραμματισμό hUCs
• Ο PD (PD0325901, αναστολέας MEK/MAPK/ERK) φαίνεται να
καταστέλλει την ανάπτυξη των μη επαναπρογραμματισμένων
κυττάρων και να προωθεί τον επαναπρογραμματισμό όταν
προστεθεί σε μεταγενέστερο στάδιο.
• προσθέτοντας PD σε πρώιμο στάδιο αναστέλλεται ο
επαναπρογραμματισμός των hUCs αλλά σε μεταγενέστερο
στάδιο προωθείται.

p53p53
• Σημαντική ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη
• αυξορρυθμίζεται από παράγοντες OSKM, προκαλώντας
κυτταρική γήρανση, άρα και αναστολή του
επαναπρογραμματισμού,
• μειορρυθμίζεται από τον Ρ (CPFT-α) και από τον
παράγοντα επαναπρογραμματισμού, SV40LT,
• καταστέλλοντας την p53 (RNAi ή με knockout), επάγεται
επαναπρογραμματισμός και παραγωγή iPSCs,

p53p53
• όμως, χαμηλής δραστηριότητα της p53 εγείρει ανησυχίες
για γενωματική αστάθεια.
• θεωρώντας τον SV40LT, ως έναν αρνητικό παράγοντας
για την p53, που είχε ήδη χρησιμοποιηθεί στον
επαναπρογραμματισμό, ελαχιστοποιούμε την εφαρμογή
της Ρ (CPFT-α).
• υπάρχει, λοιπόν, μία συνεργιστική καταστολή της p53 με
SV40LT, αντί για CPFT-α.

Ν (ΝαΒ αναστολέας τηςΝ (ΝαΒ αναστολέας της HDAC)HDAC)
• δεν έδειξε σημαντική επίδραση στην προώθηση
επαναπρογραμματισμού των hUCs, με υψηλό ρυθμό
πολλαπλασιασμού
• ενεργοποεί την έκφραση των miR302/367, τα οποία
προωθούν περαιτέρω τον επαναπρογραμματισμό,
• διευκολύνει τον επαναπρογραμματισμό μόνο με την
παρουσία του εξωγενούς c-Myc. Έτσι, αντικαθιστώ το c-
Myc με miR302/367,
• είναι ευεργετικό για επαναπρογραμματισμό hUCs με
χαμηλό πολλαπλασιασμό (κοκτέιλ SM).

Αυτόλογα τροφικάΑυτόλογα τροφικά
• αν ο αριθμός των επιζώντων κυττάρων μετά από
ηλεκτροδιάτρηση, δεν είναι επαρκής, συνήθως δεν
δημιουργούνται iPSCs
• με επίστρωση των επιμολυσμένων hUCs πάνω στο
αυτόλογα μη επιμολυσμένα κύτταρα (τροφικά), ήμαστε σε
θέση να παράξουμε iPSCs από έναν πολύ μικρό αριθμό
επιβιώντων hUCs
• όμως, κατά τον επαναπρογραμματισμό, εάν ο συνολικός
αριθμός των τροφικών hUCs είναι πολύ υψηλός, η
αποδοτικότητα επαναπρογραμματισμού μειώνεται.

Αυτόλογα τροφικάΑυτόλογα τροφικά
• είναι δυνατή η αντικατάσταση του Matrigel ως εξωκυτταρική
μήτρα για επαναπρογραμματισμό, και η παραγωγή iPSCs
υπό συνθήκες χωρίς ζωικά συστατικά,
• γίνεται παραγωγή iPSCs, (μεμε plan A, Bplan A, B ήή C)C) και είναι δυνατή
η δημιουργία «τράπεζα» iPSCs από/για ασθενείς με
διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο.
• ίσως και για μοντελοποίηση ασθενειών, παραγωγή νέων
φαρμακευτικών ουσιών, αλλά και στην αναγεννητική
Ιατρική.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ!ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ!

iPSCs

Recommended

Recommended

More Related Content

Featured

Featured (20)

iPSCs