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模組化課程生醫微製程期末報告
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HsuChi Chen
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1.
Discussion A wearable microfluidic
device for rapid detection of HIV-1 DNA Using recombinase polymerase amplification
2.
如何檢測HIV-1 DNA病毒? 抽血獲取DNA 放大後的DNA 序列(PCR/RPA) 檢測該DNA
3.
PCR 1.變性(Denaturation): 高溫(90°C)斷DNA氫鍵 2.退火(Annealing): 50°C引子結合在DNA 3.延伸(Extension): 72°C DNA聚合酶合成
4.
檢測方法-螢光定量 Taqman Probe兩端為 螢光指示劑與催滅劑互相抵消 DNA聚合酶切割探針 破壞催滅機制,螢光訊號觸發 計算機繪圖 並計算CT值
5.
PCR改良發想 PCR Thermocyclers Resource-limited
6.
RPA • 1.能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶 • 2.單鏈DNA結合蛋白(SSB) •
3.鏈置換DNA聚合酶
7.
最終裝置 RPA需持續供電 用腋下側流檢測 用穿戴式裝置
8.
總結 • PCR • 螢光定量檢測方法 •
RPA • 裝置實現
9.
Reference • 3.圖:https://www.facebook.com/everythingaboutBiotech/photos/a.2035926766637950/2826438994253386 • 3.解說:https://www.youtube.com/watch?v=Sv05DQc12w8 •
4.圖:https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4 • 4.解說:https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4 • 論文:A wearable microfluidic device for rapid detection of HIV-1 DNA Using recombinase polymerase amplification
Editor's Notes
1.簡介 大家好,接下來我要講論文中關於discussion的部分。
2.裝置功能 首先先回顧一下是如何檢測HIV病毒的。HIV病毒主要感染人類免疫系統細胞,會存在免疫細胞、血漿、淋巴液或組織液的某些體液中。而我們獲得病毒最方便的方法就是抽血。 所以在戴上這個穿戴式微流體裝置之前,要先抽取血液樣本,獲得HIV-1 DNA這個病毒。接下來戴上裝置,他就會開始進行DNA的放大。 什麼是放大呢?放大就是不斷去複製DNA,使他數量級加倍,以方便我們可以後續的檢測,而在這邊論文一直提到PCR與RPA之間的比較,這個裝置是採取RPA的放大方法,接下來我會分別跟大家說明這兩種的放大機制。 而我們都知道每種化學或生物的反應都有限定他反應的溫度,以這個裝置用的RPA為例最佳的反應溫度就是攝氏37度,我認為蠻重要的是"溫度"控制,這決定了裝置實現的難易度。 之後再藉由一些檢測DNA放大的方式去測量結果。
3.PCR 首先來介紹PCR,這在最近新冠肺炎篩檢蠻夯的,不過這些基本原理其實高中生物都有教,我在這裡做個小複習。 這個原理就是我們先了解自然界是怎麼複製的再去做模仿,先透過解旋酶讓DNA雙股打開、透過RNA引子接上,然後利用DNA聚合酶把引子不斷延長,5端往3端去做複製。 然後我們把這原理去做改造,第一步我們不用DNA解旋酶了,我們直接加熱到90度讓DNA的雙股打開,因為高溫會破壞氫鍵,一旦打開後我們試管會加入DNA引子,這個DNA引子在高溫下連不上,因為氫鍵沒辦法形成,所以要降溫到50度,這時候引子就會連上,形成短暫的雙股 這時候試劑上就有比較不怕熱的DNA聚合酶,這個DNA聚合酶就會沿著引子的3'端往後不斷延長,這個反應就模擬自然界DNA複製,這時候燒到72度,因為這個溫度對聚合酶來說催化效率會比較好。 所以仔細看一下反應過程,溫度變化與控制是很重要的,高溫是讓雙股DNA打開;溫度降低是讓DNA引子連上,72度是因為現在DNA聚合酶最適合作用的溫度是在72度,這時候他的反應速度比較快,所以我們需要不停改變環境的溫度重複這個動作,90度、50度、72度這樣複製一輪,每一回DNA的數量就會double,所以這個技術叫DNA ampify放大技術,這裡指的是數量上的放大。 然後在做PCR的時候不是整條都被複製,我們在這DNA引子之間夾出的淺藍色區域才會被放大 而現在新冠肺炎的技術就是RT-PCR反轉錄聚合酶連鎖反應,就是把檢測的對象把DNA改成RNA,利用反轉錄酶還有DNA引子,以RNA為模板做出一股DNA,最後透過DNA聚合酶就做出雙股的DNA了,接下來過程就跟PCR一樣了。'
4.檢測方法 但這時候問題就來了,我要如何檢測病毒?這時候就需要一個探針,這個探針是經過精心設計的,它包含與代測病毒的某一段基因互補的基因序列,探針5'那一端附有一個螢光訊號源,當使用特定頻率照射時就會發出對應的螢光訊號,但是在另一端同時也設計了對應的訊號催滅劑,這使得當探針的結構是完整時,他所發出的訊號正好被其自身所吸收 不過當到剛才講到PCR的第3個階段時DNA聚合酶複製到達探針時,這個設計好的結構被破壞,他就會發出螢光訊號。如此這樣DNA每複製一次,大量探針的結構就會被破壞並發出螢光訊號,如此儀器所檢測的訊號就會指數性成長。 而由機器分析我們就可以把圖畫出來。當螢光強度到達某一設定程度,此時他做PCR的次數就是他的CT值(Treshold Cycle)。
HIV病毒流行大多在資源匱乏的第三世界,但是使用傳統的PCR採檢,從樣本開始需要幾個小時又需要使用專門的熱循環機器。因此才改用新的技術 - 等溫核酸檢測,當中的2006年由英國公司開發的RPA技術(重組酶與聚合酶技術),不像先前講的傳統的PCR需要DNA放大時需要一次次的熱循環,RPA只要讓環境維持在37度即可。
6.RPA RPA反應利用稱為重組酶的酶,該酶與寡核苷酸引子形成複合物,並將引子與雙鏈 DNA 中的同源序列配對。單鏈 DNA 結合 (SSB) 蛋白與置換的 DNA 鏈結合併穩定生成的 D 環,這是要避免他再次發生反應。然後從引子開始通過聚合酶進行 DNA 擴增,就這樣跟PCR一樣引發連鎖反應。
7.最終裝置介紹 雖然RPA改良了PCR需要反覆熱循環機制,只需要維持等溫在37度就好了。但是像是在2015年伊波拉爆發時,仍然需要不斷供應電力,因此才有人用人體熱量去加熱的構思,在這篇論文之前也有其他團隊是研發類似的,是用人體腋下的熱量去加熱有RPA試劑的管子,之後再用lateral flow(就是教授昨天講的那個驗孕棒的機制)去檢測的模型。 而這篇論文的作者認為用腋下去測,受試者可能身體不適,不方便也不衛生。因此設計了這個微流體裝置,用上了現在很夯的穿戴式裝置和智慧手機。智慧手機是做剛剛講的第4頁螢光圖形的運算分析;而裝置是用3D列印機,利用PDMS和DSA的鍵結使裝置洩漏的機會很低,能有效密封,這樣就不需要主動加熱或是涉及到PCR的熱循環了。 但同時也點出一個重要的缺點就是RPA試劑比PCR還來的貴。 大致總結一下測試流程: 1.一開始抽血獲取受試者血液 2.滴入微流體裝置並戴在手上 3.24分鐘左右將裝置上的芯片拿下來,並且放入小小的熒光檢測系統中 4.最後產生的熒光使用現在很普及的智慧手機,下載ImageJ這套軟體分析圖像,就可以看檢測結果。
8.總結 總結一下:一開始介紹了PCR這個核酸放大的技術與判斷檢測結果是否陰陽性的螢光定量。接下來由於PCR技術溫度控制起伏大,所以改用RPA技術,最後實現微流體穿戴式裝置。
以下為參考資料。
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