Лекція навчального курсу "Молекулярна онкологія, патологія та генетика: від фундаментальних знань до патогістологічної діагностики" Організатори: Медична лабораторія CSD спільно з Center for research and education of translational biology and medicine (www.tbm.center ) Денис Сергійович Козаков – молекулярний біолог лабораторії молекулярної патології і генетики CSD

1. Основи молекулярних
методів
КОЗАКОВ ДЕНИС

2. ДНК
• A=T; G≡C
• Negative charge
• Double-stranded
• Зберігання інформації
• Deoxyribose – flexibility (double helix)

3. РНК
• A=U; G≡C
• Negative charge
• Single*-stranded
• Експресія генів
• Ribose – unstable/degrading
• Визначається послідовністю ДНК

4. Білок
• Визначається послідовністю РНК
• 20 амінокислот
• Просторово неоднорідні
• Первинна (2-,3-,4-) структура
• Безпосередня участь в клітинних просцесах

5. Універсальні молекулярні методи
• Гель-Електрофорез
• Спектрометрія (-photo – quantification; mass- – identification of compounds/composition)
• Спектроскопія (IR – structural analysis; Fluorometry – Quantification)
• Хроматографія (separation by physicochemical properties)
• Методи гібридизації (Western-, Southern-, Northern blot, other)

6. ДНК. Молекулярні методи
• ПЛР
• ПЛР в реальному часі
• Методи гібридизації:
• FISH
• Hybridisation capture methods
• Southern blot
• Секвенування:
• Sanger sequencing
• NGS
• Фрагментаційний аналіз (рестрикція/ампліфікація – електрофорез)

7. РНК. Молекулярні методи
• Зворотня транскрипція (комплементарна ДНК)
• RT-qPCR
• Molecular cloning
• Секвенування (Sanger, NGS)
• Методи гібридизації:
• Northern blot

8. Білки. Молекулярні методи
• Методи гібридизації:
• ELISA
• Western-blot
• Immunoprecipitation/Pull-down assays
• CHIP
• IHC

9. Гель-Електрофорез
• Розділення за масою, зарядом
• Виділення специфічних фрагментів
• Аналітичний етап багатьох методів

10. Спектрофотометрія
• Визначення концентрації нуклеїнових кислот/білків в суміші за поглинанням світла
• Низькоспецифічний аналіз DNA vs. RNA
• Наявність домішок сильно впливає на результат

11. Масс-спектрометрія
• Визначення молекулярного складу простих/складних молекул за розподілом фрагментів
• Базований на принципі вимірювання співвідношення маси до заряду

12. Спектроскопія
• Аналіз функціональних груп за відповіддю молекул на промені (infra-red) або наявність
сильного мангітного поля (NMR)
• Визначення структури/функціонального складу молекул

13. Хроматографія
• Методика адаптована для очистки та виділення біомолекул
• Розподіл молекул при проходженні через субстрат на колонці за фізикохімічними
властивостями:
• Заряд
• Маса (розмір)
• Специфічність до субстрату (афінність)

14. ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція
• Ампліфікація ДНК
• Денатурація
• Приєднання праймерів (анілінг)
• Елонгація (синтез)
• В реакції беруть участь:
• Оригінальна суміш ДНК
• Праймери (15-25b)
• ДНК Полімераза
• Середовище (+нуклеотиди)

15. ПЛР в режимі реального часу (qPCR)
• Визначення кількості копій/довжину/кількість ампліконів за флуорисцентними
маркерами
• Використовуються інтеркалюючі фарбники та флуорисцентні мітки

16. Зворотня транскрипція
• Ферментативне перетворення мРНК на комплементарну ДНК для подальших аплікацій:
• Аналіз експресії генів (qPCR)
• Аналіз наявності транскриптів певних генів
• Аналіз сплайсингу
• Секвенування

17. Дякую за увагу!