4. p53 kontrollib rakkude jagunemist ja apoptoosi
Vastusena DNA kahjustustele või onkogeensele stressile p53 stabiliseeritakse ja indutseerub
p53 märklaudgeenide ekspressioon, mille seas on rakutsükli inhibiitorid (p21cip1) ja
proapoptootilised valgud (BAX BH3 only).
Pilt: p21 and DNA damage signalling.
4/41
5. p53 on muteerunud kuni pooltes kasvajates
Andmed: IARC TP53 Database R17, November 2013. Petitjean A, Mathe E, Kato S, Ishioka C, Tavtigian SV, Hainaut P, Olivier M. Impact of mutant p53 functional
properties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database.Hum Mutat. 2007 Jun;28(6):622-9.
5/41
7. Rakkude jagunemispotensiaal koekultuuris on
piiratud
Pilt: Hayflick limit. Phase I is the primary culture; phase II represents subcultivated cells during the period of exponential replication. Phase III represents the
period when cell replication ceases but metabolism continues. Cells may remain in this state for at least one year before death occurs.
7/41
10. Oksütatiivse stressi tingimustes (20% )
kasvatatud rakud läbivad vähem pooldumisi.
Normaalsed epiteelirakud sõltuvad
stroomarakkude toetusest. Kui inimese
eesnaha keratinotsüüte kasvatada puhta
kultuurina ilma feederrakkudeta indutseerub
neis kiirelt rakutsükli blokk läbi p16ink4a
ekspressiooni.
Koekultuuri stress indutseerib senesentsi
O2
Pildid: Chen et al., 1995 , Fu et al., 2003 .
10/41
11. Onkogeenne Ras vajab transformeerimiseks
lisajõude
Onkogeenselt aktiveeritud Ras valgud on võimelised transformeerima immortaliseeritud
hiire rakke (Der et al., 1982; Parada et al., 1982).
Kuid hiire embrüonaalsete fibroblastide transfekteerimine inimese ras onkogeeniga ei
muuda neid tumorigeenseteks enne kui need rakud on koekultuuri adapteeritud ja
immortaliseerunud.
Selline immortaliseerumine saavutatakse ka siis kui viia rakku koos ras-iga sisse ka mõni
teine lisa onkogeen, näiteks v-myc või c-myc, või SV40 suur-T antigeen.
Normaalsetel inimese rakkudel on koekultuuris piiratud eluiga (näiteks HUVEC rakke
kasutatakse kuni 8 passeerimiseni) ja neil ei teki spontaanset immortaliseerumist (erinevalt
hiire-roti rakkudest).
·
·
·
·
11/41
12. p53 blokeerib Ras transformatsiooni
Normaalsete inimese või hiire ja roti
fibroblastide transformeerimisel H-
RasV12-ga blokeerub nende rakkude
jagunemine palju varem kui nad
saavutavad konfluentsuse.
See jagunemise blokk on pöördumatu
(senesents) ja sellega kaasneb p53 ja
p21Cip1 ning p16INK4a valkude
akumulatsioon.
Rakkude minemist senesentsi on võimalik
vältida kui p53 neutraliseerida, näiteks
adenoviiruse E1A valgu transfekteerimisel.
·
·
·
Pilt: Serrano, 1997
12/41
13. Onkogeen indutseeritud senesents
OI senesents on tuumorsuppressor mehhanism mis toimib healoomulised kasvajates
(onkogeensete radade aktivatsioon normaalsetes rakkudes põhjustas kiire jagunemise
bloki).
Pahaloomulistes kasvajates on OI mehhanismid juba tasalülitatud (mutatsioonid p53-s ja RB-
s, telomeraas).
Mutatsioonid K-ras, B-raf, PTEN ja NF1 geenis käivitavad rakkudel senesentsi ka in vivo.
In vivo andmed toetavad hüpoteesi, et senesents toimib tuumor-suppressor mehhanismina.
Onkogeenide põhjustatud senesents on aktiivne protsess ning pole põhjustatud replikatiivse
potentsiaali kadumisest (telomeerid on neis rakkudes ok!).
·
·
·
·
·
13/41
14. Premalignant lung adenomas induced by oncogenic K-ras are positive for
markers of senescence, whereas malignant adenocarcinomas are negative.
Pilt: Collado et al., 2004 .
14/41
15. HP1-beta ja PML valkude
akumuleerumine kromatiinile
initseerib DNA kahjustuste
parandamise mehhanismid
OIS on põhjustatud DNA kahjustustest
Onkogeenide poolt indutseeritud stress on
põhjustatud ka DNA kahjustuste poolt mis
on tekkinud kas
Senesentsi pöördumatuse tingivad
ulatuslikud kromatiinimodifikatsioonid
(metülatsioon) mis väljenduvad
heterokromatiinsete fookuste (senescence-
associated heterochromatic foci) näol.
·
hapnikuradikaalidest (ROS) (Lee et al.,
1999)või
ülemäärasest replikatsioonist
(Bartkova et al., 2006).
-
-
·
Pilt: the-scientist.com
15/41
16. In vivo ja in vitro senesentsi markerid
MARKER TEST
SA- -Gal histokeemia
p16INK4a WB, IHC
p15INK4b WB, IHC
p53 WB, IHC
ARF WB, IHC
p21 WB, IHC
SAHFs IF
DEC1 WB, IHC
DCR2 WB, IHC
WB, western blot. IHC, immunohistochemistry. IF, immunofluorescence. SAHFs, senescence-associated heterochromatic foci. DEC1,
differentiated embryo-chondrocyte expressed. DCR2, decoy death receptor 2.
β
16/41
17. BRAF mutatsioonid lükkavad sünnimärgi
melanotsüüdid senesentsi
Sünnimärgid (naevi) sisaldavad sageli
onkogeenseid BRAF V600E mutatsioone.
Sellised sünnimärgid jäävad siiski
kümneteks aastateks vaikeolekusse ja
ainult harva arenevad melanoomiks.
Pidev BRAFV600E ekspressioon inimese
melanotsüütides indutseerib rakutsükli
bloki, mida iseloomustab p16INK4a ja
happelise -galaktosidaasi ekspressioon
(SA- -Gal).
·
·
·
β
β
Pilt: BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.
17/41
18. Geenid mis indutseerivad senesentsi
GEEN MUUTUS VÄHIS KONTEKST RAKUTÜÜP VÄHK/KUDE VIITED
Onkogeenid
Ras GOF mutatsioon mutantse alleeli
ekspressioon
HDF ja MEF* kopsu adenoomid; aterosklerootilised
kahjustused; rinnanäärme hüperplaasia
Serrano et al., 1997, Collado et al., 2005,
Minamino et al., 2003, Sarkisian et al., 2007
Raf GOF mutatsioon mutantse alleeli
ekspressioon
HDF, MEF*,
melanotsüüdid
kopsu adenoomid Dankort et al., 2007, Michaloglou et al., 2005
Akt GOF mutatsioon müristüleeritud
alleeli
üleekspressioon
endoteelirakud
ja MEF
Chen et al., 2005, Miyauchi et al., 2004
E2F1/3 amplifikatsioon üleekspressioon HDF ajuripatsi hüperplaasia Dimri et al., 2000, Lazzerini Denchi et al., 2005
Cyclin E amplifikatsioon üleekspressioon U20S Bartkova et al., 2006
mos translokatsioon/
üleekspressioon
üleekspressioon HDF Bartkova et al., 2006
cdc6 üleekspressioon üleekspressioon HDF Bartkova et al., 2006
Tumor
suppressors
PTEN LOF mutatsioon inaktivatsioon MEF and
IMR90
HG-PIN Chen et al., 2005, Courtois-Cox et al., 2006
NF1 LOF mutatsioon inaktivatsioon HDF dermaalne healoomuline fibroom Courtois-Cox et al., 2006
Lühendid: GOF, gain of function; HDF, human diploid fibroblast (IMR90 ja BJ); LOF, loss of function; MEF, murine embryonic fibroblast; HG-PIN, high-grade
prostatic intrapithelial neoplasia. MEF*: senesetsi indutseerimiseks on vajalik üleekspressioon. Tabel: Courtois-Cox, 2008
18/41
19. Telomeerid
Telomeerid on DNA-valk kompleksid, mis stabiliseerivad lineaarsed kromosoomide otsad.
Imetajate telomeerid koosnevad 5-15 kb pikkustest TTAGGG kordusjärjestustest, mis
lõppevad 3' üheahelalise overhang-iga.
Telomeeride pikkuse säilitamise eest vastutab telomeeraas või alternative telomere length
(ALT) korrastus-mehhanism, mis põhineb rekombinatsioonil (>10% vähirakkudel).
·
·
·
19/41
20. Kromosoomid millel puuduvad õiged otsad on
ebastabiilsed
1930.ndatel täheldasid Hermann Müller ja
Barbara McClintock erinevust katkenud
kromosoomide käitumise ja telomeeride
vahel.
Hermann Müller leidis, et kromosoomid
millel puuduvad 'õiged' otsad on
ebastabiilsed.
McClintock leidis, et katkenud otsad
fuseeruvad kuid mitte kromosoomid.
·
·
·
Pilt: Smithsonian Institution
20/41
21. Telomeeride tähtsus - fusion-bridge-breakage
Telomeerid võimaldavad rakkudel eristada kromosoomi otsad katkenud DNAst.
DNA kahjustuse korral võib parandamine toimuda kahel viisil:
Telomeerid hoiavad ära NHEJ põhjustatud kromosoomide fusiooni.
NHEJ põhjustatud Fusion-bridge-breakage tsüklid viivad genoomse ebastabiilsuse tekkeni.
Telomeerid annavad rakule autonoomse mehhanismi jagunemistsüklite lugemiseks.
·
·
homoloogne rekombinatsioon (HR).
mittehomoloogne otste ühendamine (non-homologous end-joining, NHEJ).
-
-
·
·
·
21/41
24. Telomeeride lühenemine lõppeb kriisiga ja võib põhjustada
immortalisatsiooni
SV40 large-T transformeeritud inimese neeru fibroblastid (HEK) jagunevad kuni telomeeride
lühenemiseni ~1.5 kb pikkusteks.
Lühenenud telomeerid põhjustavad rakkudes nö. kriisi, millest vähesed ellujäävad kloonid
väljuvad immortaliseerununa.
Immortaliseerunud rakud ekspresseerivad telomeraasi.
·
·
·
Pildid: Counter et al., 1992.
24/41
25. Telomeeride lühenemine ehk "end replication
problem"
Telomeerid lühenevad iga raku jagunemisega S-faasis
DNA otste replikatsiooni probleem "end replication problem":
DNA polümeraasid vajavad replikatsiooni alustamiseks praimerit.
DNA replikatsiooniga jääb kromosoomi otstest 50-200 bp DNA lõik 3' otsast replitseerumata
(3' overhang).
Rakud mille telomeerid on 10-12 kb pikad jagunevad 50-60 korda.
Rakud lähevad senesentsi kui telomeerid "kuluvad" 4-6 kb pikkusteks.
·
DNA replikatsioon on bidirektsionaalne.
DNA polümeraasid toimivad ühesuunaliselt.
-
-
·
·
·
·
25/41
26. Telomeeride erosioon toimib tuumor-suppressor
mehhanismina
Inimese rakkude immortaliseerumisel toimub alati ka telomeeride korrashoiu mehhanismi
käivitamine kas telomeraasi üle-ekspressiooni või ALT mehhanismi käivitamise teel.
60-80% inimese vähkidest on telomeraas positiivsed, viidates et telomeeride erosiooni
vältimine on vähis sama tavaline kui Rb ja p53 inaktivatsioon.
Tüvirakkudes on telomeraasi aktiivsus madalam kui vähirakkudes ja paljudes normaalsetes
jagunevates rakkudes puudub telomeraasi ekspressioon täielikult.
Siit võib järeldada, et telomeeride regeneratsioon on vähis hädavajalik vähirakkude
jagunemispotentsiaali säilitamiseks.
·
·
·
·
26/41
27. Effects of DN-hTERT on cell proliferation.
Clonal isolates analyzed are from cell lines
LoVo a, HA-1 b, SW613 c, 36M d and GM847
cells e; in order of initial telomere length from
shortest (LoVo) to longest (GM847). For each
cell line, two clones are shown expressing the
control retrovirus ( , ), WT-hTERT ( , ) or
DN-hTERT ( , ).
Inhibition of telomerase limits the growth of human
cancer cells
□ ■ ∘ ∙
△ ▲
Ref.: Hahn et al., 1999.
27/41
28. Telomeraas ja ALT
Telomeraasi holoensüüm koosneb kahest konserveerunud komponendist:
Telomeraas (TERT), mis sisaldab telomeraasi pöördtranskriptaasi domääni ja
RNA TR (TERC), mis moodustab TERT-iga kompleksi ja toimib praimerina telomeersete
korduste sünteesil.
Lisaks on kompleksis ka dyskerin, mis stabiliseerib telomeraasi holoensüümi.
Mutatsioonid TERT, TR või DKC1 geenides põhjustavad inimesel telomeerseid sündroome.
·
·
·
·
Pilt: Armanios & Blackburn, 2012.
28/41
29. Telomeeride regeneerimise ALT mehhanism
Homoloogne rekombinantsioon kus uus
telomeerne DNA sünteesitakse
rekombinatsiooni ajal kõrval oleva
kromosoomi pealt.
Õdekromatiidide telomeeride ebavõrdne
vahetus (unequal telomere sister chromatid
exchanges (T-SCEs)). Tingituna
telemoeersetest kordusjärjestustest saab
üks õdekromatiid rekombinatsioonis
teiselt kromatiidilt rohkem materjali kui
'vastu annab'. Tekkinud tütarrakkudest
ühes on telomeerid pikenenud, teises
lühenenud.
·
·
Pilt: Cesare & Reddel, 2010.
29/41
30. Telomeraas positiivsed kasvajad (%, keskmine
ja 95% usalduspiirid.)
STATE MEAN LOWER UPPER
benign 22.7 6.9 44.9
malignant 69.8 61.0 78.5
normal 17.8 7.3 30.8
Telomeraasi üle-ekpressioon vähis
Andmed: Shay, J. W. & Bacchetti, S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur. J. Cancer 33, 787–791 (1997).
30/41
31. Telomeeride otsas on sõlm
Telomeersele DNA-le seostub
valgukompleks nimega shelterin.
Inimese shelterin kompleks koosneb
kuuest valgust: telomere repeat binding
factor 1 (TRF1), TRF2, repressor/activator
protein 1 (RAP1), TRF1-interacting nuclear
protein 2 (TIN2), TIN2-interacting protein 1
(TPP1) ja protection of telomeres 1 (POT1).
Telomeerne DNA moodustab suure lingu t
loop-i, mille 3' overhang ots paardub
telomeeri kordusjärjestuste
paarisahelalise osaga.
TRF2 indutseerib t loop struktuuri
moodustamise in vitro ja ka tema in vivo
funktsioon vastab t loop-ide .
·
·
·
·
Pilt: Karlseder, 1999
31/41
33. TRF valgud
TRF1 reguleerib telomeeride pikkust.
TRF2 vastutab selle eest, et telomeerid oleksid vinks-vonks korras.
TRF2 inhibitsioon põhjustab 3' overhang-i kadumise telomeeri otsast ja viib kromosoomi
otste fuseerumiseni.
·
TRF1 on seotud negatiivse tagasisidega, seostub otse telomeeridele ja supresseerib
telomeeride elongatsiooni.
pikaajaline TRF1 üle-ekpressioon telomeraas-positiivetes HT1080 vähirakkudes
põhjustas telomeeride lühenemise.
-
-
·
·
33/41
34. TRF2 kaitseb inimese telomeere otsipidi kokku
fuseerumast
Muteerunud DNA sidumise domääniga TRF2 (TRF2ΔBΔM) ekspressioon rakkudes viib otsipidi
fuseerunud kromosoomide tekkeni.
Anafaasi rakud, milles on TRF2ΔBΔM-indutseeritud anafaasi sillad ja lohisev kromosoom
(vasakpoolne rakk). DNA on värvitud DAPI-ga.
Pilt: van Steensel, 1998
34/41
35. Telomeeride avanemine ja lühenemine indutseerib
apoptoosi
TRF2 seostumine TTAGGG kordustele maskeerib kromosoomi otsad DNA kahjustuste
kontrolli mehhanismi eest.
TRF2 inhibitsioon põhjustab kiire ATM/p53–sõltuva DNA kahjustuse kontrollpunkti
aktivatsiooni, rakutsükli arresti ja suunab rakud apoptoosi.
Katmata kromosoomi otsad mis tekivad TRF2 funktsiooni inhibeerimisel seostuvad DNA
kahjustuste kontrolli valkudega 53BP1, -H2AX, Rad17, ATM ja Mre11.
·
·
·
γ
35/41
36. Increased Incidence of Skin Lesions, Alopecia,
and Hair Graying in Aging mTR−/− Mice
Hiirte telomeerid
Hiirtel on kolm korda pikemad telomeerid
kui inimestel, samas on nende eluiga
lühike.
TR knockout-hiired ei ole resistentsed
tumorigeneesile.
mTR null hiirel lühenevad telomeerid 4–5
kb generatsiooni kohta.
Võrreldes esimese generatsiooni
loomadega oli kolmanda (G3) ja kuuenda
(G6) generatsiooni hiirtel probleeme
haavade paranemisega, hematopoeesiga,
neil oli suurem kasvajate intsidents ja
lühem eluiga.
·
·
·
·
Pilt: Rudolph, 1999
36/41
37. Kaplan–Meier analysis of tumour incidence in
p53 mutant mice divided on the basis of
generation of telomerase deficiency.
Telomere attrition in ageing telomerase-
deficient p53 mutant mice promotes the
development of epithelial cancers by a
process of fusion-bridge breakage that leads
to the formation of complex non-reciprocal
translocations—a classical cytogenetic
feature of human carcinomas.
Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial
cancers in mice
Pilt: Artandi et al., 2000.
37/41
38. Higher frequency of anaphase bridges in UC progressors. a, Representative
images of anaphase bridges in the colon. b, Occurrence of anaphase
bridges in non-UC controls, UC non-progressors and UC progressors,
expressed as a percentage of the total cell number. Bars indicate group
means plusminus s.e.m.
Põletiku ja vähi seos: lühenenud telomeerid
Põletikuline soolehaigus (ulcerative colitis) on seotud kõrge kolorektaalvähi riskiga ja seda
tingituna genoomsest edastabiilsusest.
Telomeeride pikkus korreleerub kromosomaalse ebastabiilsusega selles vähieelses
seisundis.
Soolehaigete patsientide käärsoole epiteelis kellel on vähikolded juba välja arenenud
esinevad anafaasi sillad (BFB tunnus) ja muud kromosoomi aberratsioonid.
·
·
Ref: O'Sullivan et al., 2002.
38/41
