4. Rakutsükkel
Rakutsükkel on järjestikuste sündmuste jada mille käigus rakk duplitseerib kõik oma
koostisosad ja jaguneb kaheks tütarrakuks.
Raku rakutsüklisse sisenemist reguleerivad raku väliskeskkonna signaalid.
Mittejagunev rakk on vaikeolekus ( ) ehk G0 faasis.
·
·
·
/
5. Rakku jagunema/mittejagunema mõjutavad
signaalid
Rakk on tundlik väliskeskonna signalisatsioonile varases ja keskmises G1 faasis.
türosiin kinaas retseptorid (mitogeenid).
G-valk retseptorid (GPCR).
TGF- retseptorid, TGF- on üks prominentsemaid anti-mitogeene.
toitainestaatus.
· ↑
· ↑
· ↓ β β
· ↓
/
6. Tsükliinid ja CDK inhibiitorid
Kasvufaktorid stimuleerivad kiire tsükliin D taseme tõusu rakus ja CDK4/6 aktivatsiooni.
Anti-mitogeenne TGF- signalisatsioon aktiveerib p15INK4B tsükliini kinaasi inhibiitori.
·
· β
/
7. RB kontrollib restriktsioonipunkti
Peale R punkti on rakutsükli regulatsioon automaatne ja ei allu enam mitogeensele-anti-
mitogeensele kontrollile.
R punkti läbimist reguleerib
·
·
RB hüpofosforüleerimine tsükliin D-CDK4/6 poolt ja
hüpofosfo-RB hüperfosforüleerimine tsükliin E-CDK2 poolt.
-
-
/
8. Kasvajates on rakutsükkel dereguleeritud
Kuni 90% vähke sisaldab muutusi rakutsükli regulatsioonis.
/
10. p53 avastamine
1979. aastal esitasid kuus sõltumatut uurimisrühma andmed, et nad on avastanud 53 kDa
valgu inimese ja hiirte rakkudest (DeLeo et al. 1979, Kress et al. 1979, Lane & Crawford 1979,
Linzer & Levine 1979, Melero et al. 1979, Smith et al. 1979).
Viiel juhul avastati see valk sellepärast, et see immuunosadestus koos SV40 viirusvalguga
suur T-antigeen ( ).
Sama valk avastati ka pooljuhuslikult kui keemiliselt transformeeritud sarkoomirakkude
vastu genereeritud antiseerum tundis ära 53 kDa valgu transformeerunud rakkudest, kuid
mitte normaalsetes rakkudes.
·
·
·
/
11. Onkoviiruste märklauaks on pRb, p53 ja apoptoos
VIIRUS VIIRUSVALK MILLE
MÄRKLAUAKS ON RB
VIIRUSVALK MILLE
MÄRKLAUAKS ON P53
VIIRUSVALK MILLE
MÄRKLAUAKS ON APOPTOOS
SV40 suur T (large T antigen) suur T
adenoviirus E1A E1B55K E1B19K
HPV E7 E6
polüoomiviirus suur T suur T? keskmine T (middle T)
herpesviirus
saimiri
V tsükliin (D tsükliini homoloog) vBcl2
HHV8
(KSHV)
K tsükliin (D tsükliini homoloog) LANA2 vBcl2, vFLIP
HCMV IE72 IE86 vICA, pUL37
HTLVI Tax
EpsteinBarr EBNA1 LMP1
/
12. p53 peeti algselt onkogeeniks
1980.ndate alguses oli tuumorsupressorgeenide kontseptsioon veel väga teoreetiline ja
viirustest isoleeritud rakulisi onkogeene peeti võtmeks vähi olemuse mõistmisel.
p53 seostus SV40 viiruse peamise onkogeeni - suur T-antigeeniga, viidates et ta kuulub
miskitmoodi suur Tag "signaaliraja"" koosseisu.
p53 oli paljudes kasvajates üle-ekspresseeritud.
"Normaalse" p53 viimine normaalsetesse rakkudesse oli võimeline põhjustama rakkude
transformeerumise.
·
·
·
·
p53 immuunovärvimine metastaatilises rinnavähis (paremal) võrreldes normaalse koega (vasakul). Pilt: doi:10.1038/srep02246
/
13. p53 on klassikaline "two-hit" tuumorsupressor
p53 ilmus jäädavalt radarile kui käärsoolevähist otsiti oletatavat tuumorsupressorgeeni
kromosoomi 17p lookusest (Baker et al. 1989).
Enamuses käärsoolevähkides olid p53 geenis aminohappe asendusi põhjustavad missens
mutatsioonid (C T).
Kõigil juhtudel oli p53 geeni mõlemad koopiad muteerunud: üks koopia sisaldas
mutatsioone ja teine koopia oli täielikult kaduma läinud (LOH).
p53 oli muteerunud väga erinevates vähkides (Nigro et al. 1989)
·
·
→
·
·
/
14. p53 mutatsioonisagedused kasvajates
IARC TP53 Database R17, November 2013. Petitjean A, Mathe E, Kato S, Ishioka C, Tavtigian SV, Hainaut P, Olivier M. Impact of mutant p53 functional properties
on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database.Hum Mutat. 2007 Jun;28(6):622-9.
/
15. TSG mutatsioonid
TSG sisaldavad laias laastus kahte tüüpi
mutatsioone,
p53 kuulub selliste TSG hulka milles on
kõige sagedasemad aminohappe
asendusteni viivad mutatsioonid.
Võib oletada, et selline
mutatsioone sisaldav tuumorsupressor
valk annab vähirakkudele mingi
selektsioonilise eelise.
·
ühed viivad valgu osalise või täieliku
trunkeerumiseni nt. APC, CDKN2A,
teised põhjustavad aminohappe
asendusi ( mutatsioonid).
-
-
·
·
Andmed: TOP 5% enim mutatsioone sisaldavad TSG (kokku 637 TSG-st). TSG-d Vanderbilt University andmebaasist ja mutatsioonid COSMIC andmebaasist,
cancer.sanger.ac.uk.
/
17. p53 mutandid on dominant negatiivsed
p53 toimib homotetrameerina.
Kui rakus on näiteks üks p53 alleel muteerunud, siis see mutantne p53 moodustab
komplekse p53 ja inaktiveerib need.
Tetrameeride puhul on kombinatoorikast lähtudes ainult 1/16 p53 kompleksist täielikult
ehk aktiivne.
Kui rakus oleks mutantse p53 alleeli ekspressioon täielikult inaktiveeritud, siis säiliks ikkagi
p53 funktsioon.
Kasvajates p53 muteerunud siiski (kuni 50%) ja läbinud LOH sündmuse.
·
·
·
·
·
"3KMD p53 DNABindingDomian" by Richard Wheeler (Zephyris) - Own work. Licensed under CC BY-SA 3.0 via Commons
/
18. p53 reguleeritakse valgu stabiilsuse läbi
Normaalsetes, mitte stressis olevates rakkudes on p53 väga ebastabiilne poolestusajaga 5-
30 min.
Selline kiire tsükkel võimaldab rakul kiiresti vastata füsioloogilistele signaalidele.
Ksenotoksilised agendid indutseerivad p53 minutite jooksul.
Selline induktsioon ei ole tingitud p53 mRNA taseme tõusust.
p53 valgu tase tõuseb rakkudes täielikult tingituna post-translatsioonilistest
modifikatsioonidest mis tõstavad selle normaalselt labiilse valgu stabiilsust.
·
·
·
·
·
/
21. DNA kahjustused ja onkogeenid stabiliseerivad p53
Peamised p53 stabilisatsiooni rajad
dsDNA kahjustus, ioniseeriv kiirgus, telomeeride lühenemine aktiveerib ATM Chk2 raja.
ssDNA, UV kiirgus, replikatsioonistress, kemoterapeutikumid akiveerivad ATR (
) Chk1 raja.
p53 fosforüleeritakse amino terminusest Ser-15, Ser-37 jt.
Amino-terminaalne fosforüleerimine blokeerib MDM2 sidumise p53.
Myc või E2F1 aktivatsioon viib rakus p19ARF valgu taseme ülesse, mis blokeerib MDM2 ja
võib viia rakud apoptoosi.
· →
·
→
·
·
·
/
22. MDM2
MDM2 avastati kui
kromosoomid hiire sarkoomirakkudes
( ).
Mdm2 on E3 ubikvitiin ligaas mis tunneb
ära p53 amino-terminaalse trans-
aktivatsiooni domääni.
Mdm2 on p53 märklaudgeen.
MDM2 ekspressiooni indutseerib ka
mitogeenne signalisatsioon läbi MAPK raja
(AP-1 TF).
Samuti stabiliseerib MDM2 Akt/PKB, mille
poolt fosfoforüleerimine blokeerib MDM2
auto-ubikvitineerimise.
·
·
·
·
·
Double-minute kromosoomid on ekstrakoromosomaalne DNA kasvajates mis on tekkinud geeniamplifikatsiooni tagajärjel.
/
23. ARF
Pilt:HHMI
p19ARF (hiir) või p14ARF (inimene) valku kodeerib kompaktne geneetiline lookus kus asub
kokku kolm tuumorsupressorgeeni: p16INK4A, p15INK4B ja p19/p14ARF .
ARF geeni promootor asub 13 kB ülevalpool p16INK4A promootorist. ARF -
.
ARF seob MDM2 ja inhibeerib selle korjates ta tuumakesse.
ARF ekspressiooni aktiveerivad c-MYC, RAS ja ka adenoviiruse E1A.
·
·
·
·
/
24. Rb funktsiooni kadumine käivitab ka apoptoosi
programmi
RB-sõltuv apoptoosi rada: pRb E2F ARF MDM2 p53 apoptoos
E2F liigse aktiivsuse puhuks on evolutsiooniliselt kujunenud mehhanism, mis elimineerib
normaalse pRb kontrolli kaotanud rakud.
Kõrge E2F1 aktiveerib mitmete apoptootiliste geenide transkriptsiooni: kaspaasid (3,7,8,9),
pro-apoptootilised Bcl2 valgud (Bim, Noxa, PUMA), Apaf-1 ja p73 (p53 homoloog).
E2F1/2 reguleerib ka p53-sõltuvat apoptoosi indutseerides p14ARF .
·
·
·
⊣ → ⊣ ⊣ →
/
25. Valik p53 märklaud geene. Kokku on ~120 geeni leitud.
GEENI FUNKTSIONAALNE KLASS GEEN FUNKTSIOON
p53 antagonist MDM2 p53 ubikvitiinligaas
rakutsükli inhibiitorid p21CIP1 CDK inhibiitor
Siah1 ubikvitiinligaas, kateniini lagundamine
1433 tsükliin BCDK1 inhibiitor
Reprimo G2 arrest
DNA reparatsioon p53R2 DNA biosüntees
XPE/DDB2, XPG, XPC NER (nucleotide excision repair)
GADD45 NER (nucleotide excision repair)
DNA pol. DNA polümeraas
apoptoos BAX mt poorivalk
PUMA, NOXA BH3 mt poorivalk
APAF1 kaspaas9 aktivaator
NF B TF
Fas/APO1 surmaretseptor
antiangiogenees TSP1 (trombospondiin) ECM valk
β
σ
κ
κ
/
26. Onkogeenne stress käivitab apoptoosi
The p53 transcription factor activates target genes that promote cell-cycle arrest or apoptosis in response to oncogene activation.
/
27. p53 anti-neoplastiline toime on peamiselt tingitud
apoptoosi induktsioonist
p53 aktiveerib näiteks CD95 (Fas/APO1) ja mitmete Bcl-2 perekonna pro-apoptootiliste
geenide transkriptsiooni.
p53-indutseeritud apoptoos kulgeb siiski peamiselt läbi mitokondriaalse tsütokroom c
vahendatud kaspaaside aktivatsiooni.
·
·
/
28. p53 või/ja ARF knockout pärsib apoptoosi.
Pildid:Genes Dev. Oct 15, 1999; 13(20): 2670–
2677
INK4a/ARF mutations accelerate lymphomagenesis
and promote chemoresistance by disabling p53
E –myc hiired ekspresseerivad c-Myc B-
rakkudes ja neil areneb välja B-raku
lümfoom ja leukeemia
Ainult c-myci ekspressioon
tasakaalustatakse suuresti apoptoosi
indutseerimise läbi
p53 või/ja - ARF knockout selles mudelis
kiirendab oluliselt lümfoomi teket
(joonisel: c,d,e).
· μ
·
·
/
30. Apoptoosi mehhanismid: sisemine ja ligand
vahendatud
Rakkude sisemine ( ) mehhanism käib üle tsütokroom c vabanemise mitokondrist ja
indutseeritud mehhanism käib läbi surmaretseptorite või TNF ja TRAIL-i raja.
Vastusena apoptootilistele stiimulitele aktiveeritakse kõigepealt initsiaator
kaspaasid(kaspaas-2,-8,-9,-10) mis aktiveerivad omakorda effektor kaspaasid (kaspaas-3 või
-7).
Kaspaaside kaskaadi aktiveerimine käivitab raku valkude proteolüütilise lagundamise ja
rakusurma.
·
·
·
/
32. B cell lymphoma 2 (BCL-2) perekonna valgud
Pro- ja anti-apoptootiliste BCL-2 perekonna valkude tasakaal määrab mitokondriaalse raja
aktiveerumise.
BCL-2 valke klassifitseeritakse valgus olevate BH domäänide ( ) järgi.
Pro-apoptootilised BCL-2 valkude hulka kuuluvad valgud BIM (
), BID ( ) ja BAD (
) ning multi BH domääne sisaldavad valgud BAX (
), BAK ( ) ja BOK.
Anti-apoptootilised ( ) BCL-2, BCL-XL ( ) ja MCL-1 (
), mis sisaldavad kõiki BH1-BH4 domääne.
Anti-apoptootilised valgud toimivad nii, et nad sekvesteerivad pro-apoptootilised valgud.
·
·
·
·
·
/
33. Allikas:Evading apoptosis in cancer
Apoptoosis osalevad valgud on vähis dereguleeritud
Vähis on apoptoosis osalevad geenid ja
geeniproduktid ülesse või alla reguleeritud
kas
·
transkriptsiooni tasemel (sinised
kolmnurgad),
translatsiooni tasemel (punased) või
posttranslatsiooniliselt (rohelised).
-
-
-
/
34. BH3
GEEN
KO HIIRE FENOTÜÜP INIMESE VÄHK BH3 GEENI MUUTUSED
BIM lümfoid ja müeloid hüperplaasia mantelraku lümfoom, Burkitti
lümfoom
homosügootne deletsioon, promootori
hüpermetülatsioon, promootori mutatsioon
PUMA kiirguse resistentsus peakaela lamerakuline kartsinoom,
mitteväikserakuline kopsuvähk
LOH
glioom, neuroblastoom, Braku
lümfoom
vaigistamise kadu
melanoom vähenenud ekspressioon
ninaõõne ja mao kartsinoom miR34a ekspressioon
NOXA normaalne ei ole muutunud
BMF progressiivne Blümfoidne
hüperplaasia
Burkitti lümfoom ekspressioon
Braku krooniline lümfotsüütne
leukeemia
ekspressioon
rinna, kopsu ja käärsoole kasvaja lookuse 14q14.15 deletsioon
BAD ~norm; vähesel määral esineb
difuusset suure Brakulist lümfoomi
käärsoole adenokartsinoom lossoffunction mutatsioon (BH3 domään)
γ
↑
↓
↑
/
38. Apaf-1 vaigistamine melanoomis annab sellele
kemoresistentsuse
Melanoomid kannavad sagedasti
p53 geeni.
Apoptoos on neis supresseeritud läbi
Apaf-1 valgu ekspressiooni kadumise.
Apaf-1 vaigistamine toimub läbi
epigeneetilise mehhanismi ja LOH-i.
DNA metülatsiooni või histooni
deatsetüleerimist supresseerivad agendid
on võimelised taastama Apaf-1
ekspressiooni ja melanoomirakkude
tundlikkuse kemoterapeutilistele
ühenditele.
·
·
·
·
Pilt: Apaf-1 loss in metastatic melanoma. doi:10.1038/35051606
/
39. Vähirakud kasutavad erinevaid mehhanisme, et vaigistada apoptoosi masinavärk ja
kontrollimatult paljuneda. Selleks kasutavad nad Akt/PKB raja aktivatsiooni, anti-apoptootiliste
Bcl2 valkude üle-ekspressiooni, p53 inaktivatsiooni, pro-apoptootiliste geenide promootorite
hüpermetüleerimist, tsütokroom c vabanemise pärssimist, kaspaaside inhibitsiooni.
/
