1. Įvadas į ontomorfogenetiką
D. Žvingila

2. Rekomenduojama literatūra
 Gilbert S. E. Developmental Biology. Sinauer Associates, Inc.
VIII ed. 2006; IX ed. 2010.
 Wolpert L., Tickle Ch., Lawrence P. et al. Principles of
Development. 4-th ed. Oxford University Press, 2011.
 Principles of developmental genetics. Ed. S.A. Moody. Elsevier,
2007.
 Ruso V.E.A., Cove D. J., Edgan L. G., Jeanish R. , Salamini F.
Development: genetics, epigenetics and environmental
regulation. Springer Verlag. 1999.
 Rančelis V. Augalų genetika. Technologija, Kaunas. 2008.
 Howell S.H. Molecular genetics of plant development.
Cambridge university press. 2000.
2 

3. Genetinė vystymosi teorija
3

4. Pirmieji bandymai suprasti raidos procesą.
ALKMEON’as iš Krotono
(VI–V a. pr. Kr.)
DEMOKRITAS (≈ V a. pr. Kr.)
HIPOKRATAS (≈ V a. pr. Kr.)
“Apie sėklą ir vaiko prigimtį” - knyga parašyta IV a. pr. Kr.
Atrastas objektas, kuriame galima stebėti organizmo
embriogenezę”
4

5. Aristotelis (348-322 pr. Kr.)
Kūno dalių susidarymo
klausimas;
Turėjo didelę įtaką
vėlesnių laikų Europos
mokslininkų pažiūroms
5

6. Preformizmas ir epigenezė
 XVII - XVIII a. vyko šių dviejų teorijų šalininkų
diskusija.
 Preformistai - lytinėse ląstelėse organų
užuomazgos.
 Epigenezės šalininkai - visi organizmo
požymiai užprogramuoti lytinėse ląstelėse,
tačiau vystosi iš naujo.
6

7. Išsigimėlių atsiradimo priežastys
 Problema ypač susidomėta XVIII a.;
 L. Lémery (1677-1743) ir J. Winslow (1669-1760)
20-t metų trukęs ginčas;
 Išsigimimai atsitiktinis reiškinys, dėl mechaninio
poveikio individualios raidos metu (LL);
 Dalis išsigimimų įgimti (JV);
 Šešiapirštės galūnės kaip neabejotinas įgimto
išsigimimo atvejis (Ž. Merana)
7

8.  Lytinių ląstelių tyrimai. Folikulo atradimas
R. De Graff
8 (1641-1673)

9. Vištos embriono ridos tyrimai
Marcello Malpighi
9 (1628-1694)

10. Dirbtinio apvaisinimo problema
W. Hunter – akušerijos mokslo pradininkas.
18 a. pabaigoje anglų chirurgas John
Hunter atliko pirmąjį dirbtinį apvaisinimą
(1790). Laiku gimė sveikas kūdikis.
1953 – pirmas sėkmingas apvaisinimas
užšaldyta sperma.
Dabar per metus pasaulyje gimsta apie
30 000 vaikų dirbtinio apvaisinimo būdu.
Karl’as Ber’as (K. Ernst von Baer) tyrė
apvaisinimo procesą. 1827 m. jis atrado
žinduolių kiaušialąstę. Įrodė, kad
nevaisingumas nėra tik moters problema.
Nuo tada pradėta konsultuoti nevaisingumo
10 klausimu abu sutuoktinius.

11. Ląstelinė vystymosi teorija.
 August Weismann (1843-1914)
Ląstelių determinacija ir
specializacija.
Problema:
kaip iš vienos ląstelės gali
susidaryti daugialąstis
organizmas?
11

12. Weismanno (1880) hipotezė apie
ląstelės branduolio determinantus
12

13. Weismanno hipotezės tikrinimas.
W. Roux bandymai su varlės embrionu
13

14. H. Driescho jūrų ežio embriono
tyrimai
14

15. Pastebėti raidos dėsningumai
 Biogenetinis dėsnis (ontogenezės metu praeinamos
stadijos būdingos protėvių embrionams);
 Diferenciacijos negrįžtamumo ir totipotentiškumo
problema;
 Indukcijos reiškinys embriogenezėje;
15

16. Haeckel’io 1874 pateikta stuburinių raidos panašumo versija.
16

17. Genetinės vystymosi teorijos
sukūrimas
Thomas Hunt Morgan (1866-1945) - vienas
iš genetinės vystymosi teorijos kūrėjų.
1935 m. Nobelio premija.
“Kiekviena ląstelė turi tuos pačius genus.
Kodėl tada vienos tampa raumenų
ląstelėmis, kai kurios nervų ląstelėmis, o
kitos pasilieka reprodukuojančiomis?”
17

18. Genetinė vystymosi teorija
 Pagrindinis individualaus vystymosi (ontogenezės)
variklis – diferencijuotas genų aktyvumas.
 Fenotipas – genų sąveikos ontogenezėje rezultatas.
 Genetikos šaka, tirianti, kaip genetinė informacija
realizuojasi individualaus vystymosi eigoje ir kaip
genai kontroliuoja organizmo audinių ir organų raidą,
vadinamas ontomorfogenetika.
18

19. Priežastys lemiančios spartų ontomorfogenetikos
vystymąsi: poreikis ir naujos technologijos
 1. Genų klonavimo ir jų sekos nustatymo
galimybė;
 2. Galimybė tirti geno raišką;
 3. Bioinformatikos panaudojimas. Duomenų
bazės;
 4. Transgeninių organizmų panaudojimas;
19

20. 1. Genų klonavimo galimybė
 Pirmiausia klonuoti genai, kurių produkto
susidarydavo daug (insulino, augimo
hormono,alfa-interferono);
 Insercinė mutagenezė. Homologinės
rekombinacijos ir transpozonų panaudojimas.
Genų nokautavimas”; apie 1989 m. pirmoji
“nokautuota” pelė;
 Žmogaus ligų modeliavimas
eksperimentiniuose gyvūnuose;
 Diferencijuoto genų aktyvumo panaudojimas.
20

21. Geno suardymas homologinės rekombinacijos būdu.
21

22. 22

23. M.R. Capecchi, M.J. Evans ir O. Smithies 2007 m. įvertinti Nobelio premija
23

24. 24

25. BMP7 geno vaidmuo pelės ontogenezėje
25

26. 2. Galimybė tirti geno raišką;
 DNR zondų panaudojimas; northern
hibridizacija;
 Hibridizacija in situ;
 Reporteriniai genai;
 Genų veiklos keitimas;
 RNR interferencija;
26

27. Northern hibridizacija
27

28. Geno raiškos tyrimas laike ir erdvėje.
ABI3 (Abscisic acid insensitive 3) vaidmuo ramybės stadijoje.
 Genas veikia susidarant sėkloms ir vegetatyviniuose
audiniuose prasidedant ramybės būsenai
28

29. Hibridizacijos in situ schema
29

30. Viščiuko embriono in situ hibridizacija, rodanti
FoxD3 raiškos vietas. FoxD3 – transkripcijos
veiksnys, susidarantis nervinės skiauterėlės
ląstelėse.
30

31. Kai kurie reporteriniai genai
Santrumpa Pilnas pavadinimas Nustatymo būdas
lacZ β-galaktozidazė histochemiškai
uidA β-gliukuronidazė histochemiškai
lux luciferazė bioliuminescencija
GFP žalias florescuojantis florescencija
baltymas
31

32. GFP (angl. green fluorescent protein) klonuotas
pelėje, triušyje ir musėje
GFP + H.s. rodopsono genas
GFP genas prijungtas prie
32 engrailed promotoriaus

33. PtABI3 geno raiška trumpų dienų poveikyje. GUS
genas prijungtas prie PtABI3 promotoriaus
Pumpuras ramybės
Aktyvi meristema
būsenoje
Raiška vyksta tik naujai
susidarančiuose meristemos
33 ląstelėse

34. Genų nutildymas panaudojant
RNR interferenciją
 dgRNR ląstelėje suskaldoma iki siRNR (apie 21
bp); tai atlieka DICER geno produktas;
 siRNR patenka į RISC (angl. RNAi silencing
complex) kompleksą, turintį nukleazę.Šis
kompleksas skaldo mRNR, komplementarią
vgsiRNR.
34

35. RNR interferencijos mechanizmai
I I I I I I I I I I I I I I I I I dgRNR atpažįsta DICER
- kompleksas turintis RNRazę
daug gabaliukų 1. Dicer suskaldo dgRNR į smulkius gabalus
1. II I I I I I II I I I I I ⇒ siRNA (21-28 bp) jie komplementarūs
genui, kurį norima nutildyti
2. RISC
2. RNA-Induced Silencing Complex (RISC)
I I I I I I I I I I I I I I
išvynioja ir degraduoja prasminę grandinę
3.
RISC 3. siRNR nukreipia RISC į taikinį -
I I I I I I I I I I I II I I I I I
homologišką vg mRNR
4. RISC
I I I I I I I 4. mRNR skaldoma & degraduojama ⇒
I I I I I I I PTGS
skaldo mRNR
35

36. RNR interferencijos panaudojimas tiriant
Caenorhabditis elegans genų funkciijas
 1998 m. C.elegans genomo pradinis variantas. Viso
19 099 spėjamų genų. Daugumos funkcijos
nežinomos.
36

37. RNR interferencijos panaudojimas
Caenorhabditis elegans raidos genų
tyrimuose
37

38. C. elegans genų funkcijų tyrimas
 I-osios chromosomos genų tyrimas RNR
interferencijos būdu.
 Teoriškai turėtų būti 2769 genai. Pagaminti
2416 vektoriai su šių genų kopijom.
 Tik 339 atvejais nustatyti fenotipo pokyčiai.
Tai sudarė apie 14 % tirtų genų.
38

39. C.elegans fenotipo pokyčiai
 Dažniausias fenotipas - embriono letalės (226 atvejai);
 Sterilumas ir palikuonių sterilumas - 96 atvejai;
 Sulėtėjęs vystymasis - 145 atvejai;
 Sutrikusi koordinacija - 70 atvejų;
 Kūno morfologijos defektai - 27 ir kt.
39

40. Genų nutildymas panaudojant RNR
interferenciją augaluose
TRANSKETOLAZĖS IR FITENO DESATURAZĖS
GENŲ NUTILDYMAS
40

41. DNR mikrogardelės
metodas tirti vienu metu daug genų
Tūkstančiai genų fragmentų gali
būti pritvirtinti prie stiklo
plokštelių paviršiaus
Genų raiška
Didesnė genotipe 1 nei 2
Vienoda abiejuose
Mažesnė genotipe 1 nei 2
41
CIAT - BRU

42. DNR mikrogardelės
Robot
cDNR/EST/oligai
mRNR iš
įvairių
augalo
audinių
Microscope slide Expression
of all genes
Lašintuvas ant
stiklo paviršiaus
užneša DNR
42 David J Duggan et al. Nat Gen 21, 10 – 14 (1999)

43. DNR mikrogardelių metodas
43

44. 3. Duomenų bazių panaudojimas
44

45. 45

46. Duomenų bazės
 Pagrindinės nukleorūgščių duomenų bazės;
– EMBL
– GenBank
– DDBJ
 Svarbiausios baltymų duomenų bazės;
– Swiss Prot
– also TREMBL, GenPept
 Dažniausiai integruotos su kitomis duomenų
bazėmis;
46

47. EMBL
 Įkurta 1980 Europos molekulinės biologijos
laboratorijoje (European Molecular Biology
Laboratory) Heidelberg’e.
 Nuo 1994 palaikoma EBI- Cambridge.
 adresas:
– http://www.ebi.ac.uk/embl
47

48. GenBank
 Įkurta 1979 LANL (Los Alamos).
 Nuo 1992 perkelta į NCBI (Bethesda).
 adresas:
– http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
48

49. Organizmų TOP 10
49

50. ASR (angl. ORF) paieška
 Paprasčiausias būdas nustatyti genus – ASR
paieška DNR sekoje.
 ASR prasideda STARTo kodonu (AUG)
(ATG) ir baigiasi vienu iš trijų STOP (TAA,
TAG ar TGA) kodonų.
 Galimi šeši skaitymo rėmeliai.
50

51. DNR seka potencialiai gali koduoti 6 baltymus
Three top strand reading frames
Trys ASR nuo viršutinės grandinės
5’ GATTCCAGAACAAGCCTC 3’
3’ CTAAGGTCTTGTTCGGAG 5’
Trys ASR nuo apatinės grandinės
51

52. Paieška homologiškų DNR ar baltymo sekų duomenų bazėse
naudojant BLAST programą
blastn tblastn
blastx blastp
52

53. ASR savybės
 ASR ilgis turėtų būti didesnis nei 50 kodonų; Trumpesni
atmetami.
 Vidutinis ASR ilgis Escherichia coli 317 kodonų,
Saccharomyces cerevisiae - 483 kodonai, Homo
sapiens - 450;
 Eukariotuose problema intronai ir egzonai;
atsižvelgiama į kodonų naudojimo ypatumus. Pvz.,
leuciną - 6 kodonai; pas žmogų dažniausia CTG ir l.
retai TTA ir CTA;
 Intronų egzonų ribos: GT introno pradžia, AG -pabaiga.
53  Aukščiau genų esančios sekos; pvz., CpG salelės.

54. Sąvokos
Homologija
Tai savybė, kurią lemia
bendra kilmė.
laikas
protėvis
žiurkė žmogus
Homologija yra kokybė (du baltymai homologiški arba
ne), panašumas - kiekybė (pvz., du baltymai identiški
82% ir panašūs 93%).

55. 55 Source: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/Orthology.html

56. 4.Transgeninių organizmų
panaudojimas
 Aniridia (PAX6 H.s., Pax6 M.m.) ⇒ eyeless (ey
Drosophila melanogaster) ;
 BLM H. sapiens ⇒ SGS1 S. cerevisiae
 Dnmt3a Mus musculus ⇒ D. melanogaster
56

57. Ontogenezės genetinio valdymo
bendrumai
 Vystymosi programa susijusi su genų veiklos
pokyčiais laike ir erdvėje;
 Raidos genų funkcijų konservatyvumas ir jų
valdymo mechanizmų panašumas;
 Raidos kontrolinių grandinių pertekliškumas;
 Signalo perdavimo kelių panašumas (bent
jau gyvūnuose);
57

58. Genų raiška laike ir erdvėje D. melanogaster
embrione
58

59. HOX genų konservatyvumas
59

60. Raidos genų funkcijų konservatyvumas.
KIT (Kit) geno pavyzdys
60

61. Signalų dalyvaujančių pilvinės-nugarinės v. muselės ašies susidaryme tinklai
61
©2005 by National Academy of Sciences Levine M, Davidson E H PNAS 2005;102:4936-4942

62. Stuburinių gyvūnų Wnt genai (pateiktas
lentelės fragmentas)
genas Pelė Žmogus Xenopus Viščiukas Zebražuvė
Wnt-1     
Wnt-2    
Wnt-2B/13    
Wnt-3    
Wnt-3A   
Wnt-4     
Wnt-5A     
Wnt-5B 
Wnt-6  
Wnt-7A     
62 Wnt-7B    

63. Wnt grandinė žinduoliuose
63

64. Asimetrijos susidarymas
64

65. Asimetrijos susidarymas kepimo
mielių ląstelėse
65

66. Caenorhabditis elegans – patogus
asimetrijos susidarymo tyrimo modelis
66

67. 67

68. Ląstelių pradininkių
susidarymas nematodo
embrione
68

69. Pilvinės – nugarinės ir
kairės – dešinės kūno
pusių determinacija.
69

70. 70

71. 71

72. PAR genų vaidmuo C. elegans asimetrijos
susidaryme
72

73. Wnt signalas ir asimetrijos
susidarymas nematode
73

74. Išorinio jutiminio organo susidarymas
Drosophila melanogaster
74

75. 75

76. Pelės embriono raidos pradžia
76

77. Matricinės DNR pasiskirstymo į dukterines
77 ląsteles modelis

78. Formos determinacijos problema
 Heteroblastija (organo formos kitimas
78 ontogenezėje) baltažiedžiame vairenyje, 22°C

79. Arabidopsis thaliana lapo struktūra
79

80. Formos determinacijos problema
AINTEGUMENTA (ANT) geno mutacija (kairėje).
Sumažėja ląstelių skaičius, bet jos auga didesnės.
AN (ANGUSTIFOLIA) genas valdo
80 lapalakščio plotį; ROT3
(ROTUNDIFOLIA 3)- lapo ilgį;

81. ANGUSTIFOLIA (AN) geno vaidmuo A. thaliana lapo
formos ir jo ląstelių formos determinacijoje
 an-1 mutante lapai siauresni ir storesni. Pakitęs
81 mikrovamzdelių išsidėstymas

82. Transgeninių A. thaliana augalų lapų fenotipas esant
KNAT1 geno ektopinei raiškai
82  A - laukinis tipas; B ir C - du skirtingi lapų fenotipai;

83. 35S-kn1 ir 35S-LeT6 transgeninių pomidorų fenotipų palyginimas
83 Janssen B. et.al. Plant Physiol. 2010:117:771-786

84. Žiedo formos determinacija
Linažolė (Linaria vulgaris)
Linaria vulgaris
(linažolė)
Homozigotinis Lcyc Wild-type
lokusas,
aptiktas Linėjaus
Cubas P, Vincent, C, Coen E.
Radial. simetrija Dvipusė simetrija 1999.
Nature 401: 157–161
84

85. 85

86. 86

87. Žiedo formos
determinacija žioveinyje
(Antirrhinum majus)
87

88. Linažolė (Linaria vulgaris)
Hipermetilintas prieš Wild-type  DNR sekos nepakitę
> 250metų cyc (cycloidea) – pelorinis žiedas
Labai stipriai metilinta DNR
Epimutacijos – nesikeičia DNR
sekos
Cubas P, Vincent, C, Coen E.
Radial. simetrija Dvipusė simetrija 1999.
Nature 401: 157–161
88

89. Wnt signalo perdavimo kelias
89

90. Raidos genų konservatyvumas.
KIT (Kit) geno pavyzdys
90

91. Pirmieji bandymai suprasti raidos procesą.
ALKMEON’as iš Krotono
(VI–V a. pr. Kr.)
DEMOKRITAS (≈ V a. pr. Kr.)
“Apie sėklą ir vaiko prigimtį” -
knyga parašyta IV a. pr. Kr.
Atrastas objektas, kuriame galima
stebėti organizmo embriogenezę”
Claudius Galen'as
91 (129 – 216)

92. Wnt signalo perdavimo grandinė žinduoliuose.
92