Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

DNR replikacija

7,090 views

Published on

DNR replikacija

Published in: Education
  • Follow the link, new dating source: ♥♥♥ http://bit.ly/2F7hN3u ♥♥♥
       Reply 
    Are you sure you want to  Yes  No
    Your message goes here
  • Sex in your area is here: ♥♥♥ http://bit.ly/2F7hN3u ♥♥♥
       Reply 
    Are you sure you want to  Yes  No
    Your message goes here

DNR replikacija

  1. 1. DNR REPLIKACIJADNR REPLIKACIJA
  2. 2. ĮVADAS  DNR replikacija yra procesas, kurio metu kopijuojama genetinė medžiaga  Originalios DNR grandinės yra naudojamos kaip matricos naujoms grandinėms sintetinti  Replikacija vyksta labai greitai, labai tiksliai ir tik tam tikru ląstelės gyvenimo metu 4-2
  3. 3.  DNR replikacija remiasi DNR grandinių komplementarumu  AT/GC arba Chargaffo taisyklė  Procesas gali būti apibendrintas taip:  Dvi DNR grandinės išsiskiria  Kiekviena tarnauja kaip šablonas naujos grandinės sintezei  Dvi naujai susintetintos grandinės = dukterinės grandinės  Dvi pradinės grandinės = tėvinės grandinės 4.1 DNR REPLIKACIJOS APŽVALGA 4-3
  4. 4. 4-4 Identiškos bazių sekos DNR replikacijos mechanizmas Replikacijos produktas
  5. 5. 4-5
  6. 6. 4-6
  7. 7. 4-7
  8. 8.  DNR sintezės prasideda vietoje, vadinamoje replikacijos pradžia (origin of replication)  Kiekviena bakterinė chromosoma turi tik vieną replikacijos pradžią  DNR sintezė yra dvikryptė, t.y. vyksta į priešingas nuo replikacijos pradžios chromosomos puses  Replikacijos šakutė pasiekia bakterinės chromosomos priešingą pusę  Tuo replikacija baigiasi 4.2 BAKTERINĖS DNR REPLIKACIJA 4-8
  9. 9. 4-9 Bakterinės chromosomos replikacija
  10. 10.  E. coli replikacijos pradžia yra vadinama oriC  origin of Chromosomal replication  Trijų tipų sekos yra svarbios oriC funkcionavimui  AT poromis turtingas regionas  DnaA dėžutės (boxes)  GATC metilinimo vietos Replikacijos iniciacija 4-10
  11. 11. 4-11
  12. 12. 4-12  DNR replikaciją inicijuoja DnaA baltymo prisijungimas prie DnaA dėžutės sekų  Šis prisijungimas stimuliuoja papildomų 20- 40 DnaA baltymo molekulių prisijungimą, susiformuojant dideliam kompleksui  Taip pat prisijungia ir kiti baltymai, tokie kaip HU ir IHF.  Tai priverčia regioną apsivynioti apie DnaA baltymą ir išsiskirti komplementarias grandines DnaB baltymas (helikazė) jungiasi prie oriC (DnaC baltymas padeda šiam procesui, tačiau vėliau yra pašalinamas)
  13. 13. 4-13 Sudaryta iš šešių subvienetų Juda pagal DNR 5’ → 3’ kryptimi Naudoja ATP energiją Dvikryptė replikacija
  14. 14.  DNR helikazė atskiria dvi DNR grandines, suardydama vandenilines jungtis  Tai sukuria teigiamą superspiralizaciją prieš kiekvieną replikacijos šakutę  DNR girazė keliauja prieš helikazę ir atpalaiduoja šias superspirales  SSB (single-strand binding) baltymas jungiasi prie atskirtų DNR grandinių ir laiko jas išsiskyrusias  Tada DNR praimazė sintetina trumpus (10 - 12 nukleotidų) RNR pradmenis  Šios trumpos RNR grandinės pradeda DNR sintezę  Vėliau jos yra pašalinamos ir pakeičiamos DNR 4-14
  15. 15. 4-15 Suardo vandenilines jungtis tarp grandinių Atpalaiduoja superspirales Laiko tėvines grandines išsiskyrusias Sintetina RNR pradmenis
  16. 16.  DNR polimerazės yra fermentai, kurie katalizuoja naujos DNR susidarymą prisijungiant nukleotidams  E. coli turi penkis fermentus, pasižyminčius polimeraziniu aktyvumu  DNR pol I, II, III, IV ir V  DNR pol I ir III  Normali replikacija  DNR pol II, IV ir V  DNR reparacija ir pažeistos DNR replikacija DNR polimerazės 4-16
  17. 17.  DNA pol I  Sudaryta iš vieno polipetido  Pašalina RNR pradmenis ir pakeičia juos DNR  DNA pol III  Sudaryta iš 10 skirtingų subvienetų  α subvienetas sintetina DNR  Kiti 9 atlieka kitas funkcijas  Visų 10 subvienetų kompleksas yra vadinamas DNR pol III holoenzimu 4-17 DNR polimerazės
  18. 18. E.coli holoenzimo polIII subvienetų sudėtis Subvienetas Funkcija α Sintetina DNR ε Taiso klaidas 3’-5’ kryptimi θ Papildomas baltymas, stimuliuojantis klaidų taisymą τ Skatina dviejų polIII baltymų polimerazicaiją replikacijos šakutėje; stimuliuoja DNR helikazę β Pritvirtinantis baltymas, kuris užtikrina, kad polIII nenuslystų nuo DNR γ Pritvirtinančio baltymo pakrovėjas; padeda pritvirtinančiam baltymui prisijungti prie DNR σ Pagalbinis baltymas, kuris jungiasi prie β σ’ Pagalbinis baltymas, stimuliuojantis γ ψ Pagalbinis baltymas, stimuliuojantis γ χ Pagalbinis baltymas, prisijungiantis prie SSB baltymų 4-18
  19. 19.  Bakterinės DNR polimerazės gali skirtis pagal savo subvienetų sudėtį  Tačiau jų katalitinis subvienetas visada yra tokio pat tipo 4-19 Struktūra primena dešiniąją žmogaus ranką DNR šabloninė grandinė skverbiasi per delną Nykštys ir pirštai yra apglėbę DNR DNR polimerazės schematinis vaizdas
  20. 20. 4-20 Problema sprendžiama praimazei sintetinant RNR pradmenis DNR polimerazė negali pradėti DNR sintezės DNR polimerazė gali prijungti nukleotidus tik kryptimi nuo 5’ į 3’ Problema sprendžiama 3’ → 5’ grandinę sintetinant trumpais fragmentais Neįprastos DNR polimerazės funkcijų ypatybės
  21. 21.  Dvi naujos dukterinės grandinės yra sintetinamos skirtingais būdais  Pirmaujančioji grandinė  Pradžioje prijungiamas vienas RNR pradmuo  DNR pol III prijungia nukleotidus 5’-3’ kryptimi, judėdama link replikacijos šakutės pradžios  Vėluojančioji grandinė  Sintezė taip pat vyksta 5’-3’ kryptimi  Tačiau ji nukreipta nuo replikacijos šakutės  Reikia daug RNR pradmenų  DNR pol III naudoja RNR pradmenis smulkiems (1000 - 2000 nukleotidų) DNR fragmentams sintetinti  Šie fragmentai yra vadinami Okazaki(ų) fragmentais pagal atradėjų pavardę 4-21
  22. 22.  DNR pol I pašalina RNR pradmenis ir užpildo susidariusią skylę DNR  Ji naudoja 5’-3’ egzonukleazinį aktyvumą skaidyti RNR ir 5’-3’ polimerazinį aktyvumą jos pakeitimui DNR  Kai skylė užpildoma, vis dar trūksta kovalentinių jungčių sandūrose  DNR ligazė katalizuoja fosfodiesterinės jungties susidarymą  Tuo būdu yra sujungiami DNR fragmentai 4-22
  23. 23. 4-23 Sintetina dukterines DNR grandines III Kovalentiškai sujungia DNR fragmentus Palaiko grandines išsiskyrusiasSuardo vandenilines jungtis tarp DNR grandinių Atpalaiduoja superspiralę Sintetina RNR pradmenį
  24. 24.  DNR polimerazė katalizuoja fosfodiesterinės jungties susidarymą tarp  prijungiamo dezoksinukleozidtrifosfato vidinio fosfato  IR  anksteniojo dezoksinukleotido pentozės 3’-OH grupės  Vykstant šiam procesui, du paskutinieji prijungiamo nukleotido fosfatai yra atpalaiduojami  pirofosfato (PPi) forma 4-24 DNR polimerazės reakcija
  25. 25. 4-25 Vidinis fosfatas
  26. 26.  DNR polimerazė III lieka prisitvirtinusi prie šabloninės DNR grandinės visą laiką, kol yra sintetinama dukterinė grandinė  Ši procesinė ypatybė atsiranda dėl keletos skirtingų DNR pol III holoenzimo struktūrinių subvienetų veiklos  β subvienetas yra žiedo formos  Jis yra vadinamas pritvirtinančiu baltymu  γ subvieneto reikia β subvienetui prisikabinti prie DNR  Jis vadinamas pritvirtinančio baltymo pakrovėju  δ, δ’ ir ψ subvienetų reikia optimaliai α ir β subvienetų funkcijai palaikyti 4-26 DNR polimerazė III yra procesinis baltymas
  27. 27.  Šis procesinis efektas yra gana ryškus  Jei trūksta β subvieneto  DNR pol III nukrenta nuo DNR šabloninės grandinės po to, kai polimerizuojama keliasdešimt nukleotidų  Polimerizacijos greitis ~ 20 nukleotidų per sekundę  Jei β subvienetas yra  DN pol III išsilaiko ant DNR šabloninės grandinės tol, kol yra polimerizuojama iki 50,000 nukleotidų  Reakcijos greitis yra ~ 750 nukleotidų per sekundę 4-27 DNR polimerazė III yra procesinis baltymas
  28. 28.  Priešingos pagal savo funkciją oriC sekai yra pora terminacijos sekų, vadinamų ter sekomis  Jos žymimos T1 ir T2  Baltymas tus (termination utilization substance) jungiasi prie šių sekų  Jis gali sustabdyti replikacijos šakučių judėjimą Replikacijos pabaiga (terminacija) 4-28
  29. 29. 4-29 Netrukdo prieš laikrodžio rodyklę judančiai replikacijos šakutei Blokuoja pagal laikrodžio rodyklę judančią šakutę Netrukdo pagal laikrodžio rodyklę judančiai replikacijos šakutei Blokuoja prieš laikrodžio rodyklę judančią šakutę
  30. 30.  DNR replikacija baigiasi, kai susitinka priešingomis kryptimis judėjusios replikacijos šakutės (dažniausiai prie T1 ar T2)  DNR ligazė kovalentiškai sujungia visas keturias DNR grandines  DNR replikacijai pasibaigus dažnai susidaro dvi susipynusios molekulės  Susipynusios žiedinės molekulės vadinamos katenanais  Jie yra atskiriami veikiant topoizomerazėms Replikacijos pabaiga (terminacija) 4-30
  31. 31. 4-31 Katenanai Katalizuojama DNR topoizomerazės
  32. 32. E.coli baltymai, dalyvaujantys replikacijoje Pavadinimas Funkcija DnaA Prisijungia prie DnaA dėžučių, esančių replikacijos pradžios sekoje, ir inicijuoja replikaciją DNR helikazė (DnaB) Išskiria DNR grandines DnaC Padeda DnaA pritraukti helikazę į replikacijos pradžią Topoizomerazė Pašalina superspirales, susidarančios prieš replikacijos šakutę DNR praimazė Sintetina trumpus RNR pradmenis DNR polimerazė III Sintetina DNR pirmaujančioje ir vėluojančioje grandinėse DNR polimerazė I Pašalina RNR pradmenis, užpildo susidariusius tarpus DNR ligazė Kovalentiškai suriša gretimus Okazakių fragmentus Tus Jungiasi prie ter sekos ir blokuoja replikacinės šakutės judėjimą 4-32
  33. 33.  DNR helikazė ir praimazė yra fiziškai prisitvirtinusios viena prie kitos ir sudaro kompleksą, vadinamą praimosoma  Šis kompleksas praskina kelią replikacijos šakutėje kitiems fermentams  Praimosoma yra fiziškai asocijuota su DNR polimerazės holoenzimu ir taip suformuoja replisomą DNR replikacijos kompleksai 4-33
  34. 34. 4-34
  35. 35.  Du DNR pol III baltymai veikia suderintai, replikuodami tiek pirmaujančiąją, tiek ir vėluojančiąją grandines  Du baltymai suformuoja dimerinę DNR polimerazę, kuri kaip vientisas vienetas juda replikacijos šakutės link  DNR polimerazės gali sintetinti DNR tik 5’-3’ kryptimi  Todėl pirmaujančiosios grandinės sintezė yra nenutrūkstama  Vėluojančiosios grandinės sintezė netolydi DNR replikacijos kompleksai 4-35
  36. 36.  Vėluojančiosios grandinės sintezė vyksta taip:  Vėluojančioji grandinė sudaro kilpą  Tai leidžia prisijungusiai DNR polimerazei sintetinti Okazakių fragmentą “normalia” 5’-3’ kryptimi  Pabaigęs sintetinti Okazakių fragmentą, fermentas paleidžia vėluojančiąją grandinę  Po to formuojama nauja kilpa  Šis procesas kartojamas daug kartų, kol visa vėluojančioji grandinė yra susintetinama DNR replikacijos kompleksai 4-36
  37. 37. 4-37
  38. 38.  DNR replikacijai būdingas didelis tikslumo laipsnis  Vykstant šiam procesui klaidos daromos ypač retai  DNR pol III daro tik vieną klaidą 108 nukleotidų  Yra keletas tokio didelio tikslumo priežasčių:  1. Neteisingai suporuotų (mismatched) nukleotidų nestabilumas  2. DNR polimerazės aktyvaus centro konfigūracija  3. DNR polimerazės “korektūros skaitymo” (proofreading) funkcija Korekcijos mechanizmai 4-38
  39. 39.  1. Neteisingai suporuotų nukleotidų nestabilumas  Komplementarių bazių poros yra žymiai stabilesnės nei nekomplementarių bazių poros  Tačiau ši savybė nulemia tik dalį replikacijos tikslumo  Jei tai būtų vienintelis tikslumo užtikrinimo mechanizmas, tada klaidų dažnis būtų 1/1 000 nukleotidų  2. DNR polimerazės aktyviojo centro konfigūracija  DNR polimerazė nekatalizuoja jungčių susidarymo tarp neteisingų porų  Tai sumažina klaidų dažnį iki 1/100 000 – 1 000 000 nukleotidų Korekcijos mechanizmai 4-39
  40. 40.  3. DNR polimerazės “korektūros skaitymo” funkcija  DNR polimerazė gali nustatyti neteisingai suporuotus nukleotidus ir pašalinti juos iš dukterinės grandinės  Fermentas naudoja 3’-5’ egzonukleazinį aktyvumą neteisingam nukleotidui pašalinti  Tada jis pakeičia veikimo kryptį ir pratęsia DNR sintezę 5’-3’ kryptimi Korekcijos mechanizmai 4-40
  41. 41. 4-41 “Korektūros skaitymo” schema Vieta, kurioje kerpamas DNR karkasas
  42. 42.  Bakterinės ląstelės gali dalintis ypač greitai  E. coli  kas 20-30 minučių  Todėl yra labai svarbu, kad DNR replikacija vyktų prieš pat ląstelės pasidalijimą  Bakterinė ląstelė reguliuoja DNR replikaciją kontroliuodama iniciaciją oriC sekos vietoje  E. coli tai daro dviem skirtingais būdais Bakterinės DNR replikacija ir ląstelės dalijimasis yra suderinti 4-42
  43. 43. 4-43 DnaA baltymo kiekis reguliuoja DNR replikaciją Kai kurie degradavę; kiti prisitvirtinę prie ląstelės membranos Dvigubai daugiau DnaA dėžučių Nepakankamas DnaA baltymo kiekis
  44. 44. 4-44 GATC sekų metilinimas oriC DNA adenine methyltransferase Atpažįsta 5’ – GATC – 3’ seką ir prijungia metilo grupę prie adenino
  45. 45. 4-45 GATC sekų metilinimas oriC Prieš replikaciją GATC seka yra metilinta abiejose grandinėse Šis pilnas metilinimas leidžia inicijuoti DNR replikaciją Po replikacijos GATC sekos nėra metilintos dukterinėje grandinėje Šis dalinis metilinimas neužtikrina replikacijos efektyvios iniciacijos Reikia keleto minučių kol Dam metilazė metilins GATC sekas dukterinėje grandinėje Vaizdas iš karto po DNR replikacijos
  46. 46.  Eukariotų DNR replikacija nėra taip gerai ištyrinėta, kaip bakterijų  Abudu procesai turi daug panašumų  Visi bakteriniai fermentai, išvardyti anksčiau, taip pat randami ir eukariotų ląstelėse  Tačiau eukariotų DNR replikacija yra sudėtingesnė dėl šių priežasčių:  Ilgos linijiškos chromosomos  Standus DNR susipakavimas chromatine  Sudėtingesnė ląstelės ciklo reguliacija 4.3 EUKARIOTŲ DNR REPLIKACIJA 4-46
  47. 47.  Eukariotams būdingos ilgos linijiškos chromosomos  Todėl joms reikia daug replikacijos pradžių  Tai užtikrina, kad DNR bus replikuota per pakankamai trumpą laiką Daugybinės replikacijos pradžios 4-47 DNR replikacija vyksta abiem kryptimis nuo daugelio replikacijos pradžių
  48. 48. 4-48 Dvikryptė DNR sintezė Replikacijos šakutės susijungia DNR replikacija, prasidedanti daugelyje replikacijos pradžių
  49. 49.  Replikacijos pradžios, randamos eukariotuose, turi panašumų su bakterinėmis replikacijos pradžiomis  Mielių Saccharomyces cerevisiae replikacijos pradžios yra vadinamos ARS elementais (Autonomously Replicating Sequence)  Jų ilgis 100-150 bp  Jie turi daug A ir T  Jie turi tris-keturias specifinių sekų kopijas  Šios sekos panašios į bakterines DnaA dėžutes Daugybinės replikacijos pradžios 4-49
  50. 50.  Pradžios atpažinimo kompleksas ORC (Origin recognition complex)  Šešių subvienetų kompleksas, veikiantis kaip eukariotinės DNR replikacijos iniciatorius  Jis būdingas visiems eukariotams  Jam reikia ATP, kad galėtų prisijungti prie ARS elementų  Viengrandininė DNR stimuliuoja ATP hidrolizę, vykdomą ORC Daugybinės replikacijos pradžios 4-50
  51. 51.  Žinduolių ląstelėse yra daugiau nei 10 skirtingų DNR polimerazių  Keturios jų - alfa (α), delta (δ), epsilon (ε) ir gama (γ) – pasižymi pirmine DNR replikacijos funkcija  α, δ ir ε  Replikuoja branduolinę DNR  γ  Replikuoja mitochondrinę DNR Eukariotams būdingos kelios skirtingos DNR polimerazės 4-51
  52. 52. Eukariotų (žinduolių) DNR polimerazės Polimerazės tipas Funkcija α, δ, ε Replikuoja nepažeistą DNR ląstelės branduolyje S fazės metu γ Replikuoja mitochondrijų DNR η, κ, ι, ζ Replikuoja pažeistą DNR α, β, δ, ε, σ, λ, µ, θ, ϕ DNR reparacija ir kitos funkcijos 4-52
  53. 53.  DNR pol α yra vienintelė polimerazė, asocijavusi su praimaze  DNR pol α/praimazės kompleksas sintetina trumpą RNR-DNR hibridą  Paskui 10 RNR nukleotidų seka nuo 20 iki 30 DNR nukleotidų  Šis hibridą naudoja DNR pol δ arba ε procesinei pirmaujančiosios ir vėluojančiosios DNR grandinių elongacijai  Didesnė yra DNR pol δ reikšmė  DNR pol α pakeitimas pol δ arba ε yra vadinamas polimerazės perjungimu (switch)  Jis vyksta tik po to, kai yra susintetinamas RNR-DNR hibridas 4-53
  54. 54. δ replikuoja pirmaujančiąją grandinę α/praimazė sintetina RNR pradmenį ir trumpą DNR fragmentą α/praimazė pašalinama δ prisijungia ir sintetina vėluojančiąją grandinę 4-54
  55. 55.  DNR polimerazė taip pat svarbi DNR reparacijai  DNR pol β nedalyvauja DNR replikacijoje  Ji yra svarbi bazių ekscizijos reparacijai (BER)  Šis reparacijos tipas pašalina klaidingas bazes iš pažeistos DNR  Dabar nustatyta dar daugiau DNR polimerazių  Pažeistas vietas replikuojančios polimerazės  Dalyvauja pažeistos DNR replikacijoje  Gali susintetinti komplementarią grandinę esant nenormaliai DNR sričiai 4-55
  56. 56.  Replikacija padvigubina DNR kiekį  Todėl ląstelės turi sintetinti daugiau histonų, kad patenkintų išaugusius poreikius  Histonų sintezė vyksta S fazės metu  Histonai susirenka į oktamerines struktūras  Jie asocijuoja su DNR prie pat replikacijos šakutės  Todėl po DNR replikcijos kiekviena dukterinė grandinė turi ir senų, ir naujų histonų Nukleosomos ir DNR replikacija 4-56
  57. 57. 4-57
  58. 58.  Linijiškų eukariotų chromosomų abiejuose galuose yra telomeros Telomeros ir DNR replikacija 4-58 Terminas telomera atspindi telomerinės DNR sekos ir su ja susijusių baltymų komplekso sudėtingumą. Telomeros yra chromosomų struktūrinės dalys
  59. 59.  Telomerines sekas sudaro  Vidutiniškai pasikartojančios tandeminės sekos  3’ nuosvyra yra 12-16 nukleotidų ilgio 4-59  Tipišką telomerinę seką sudaro  Keletas guanino nukleotidų  Dažniausiai daug timino nukleotidų
  60. 60. Kai kurių organizmų telomerinės sekos Grupė Pavyzdys Telomerinė kartotinė seka Žinduoliai Žmonės TTAGGG Gleivūnai Physarum, Didymium, Dictyostelium TTAGGG AT(1-8) Grybai Neurospora TTAGGG Mielės Saccharomyces cerevisiae TG(1-3) Žiuželiniai Tetrahymena Paramecium Euplotes TTGGGG TTGGG(T/G) TTTTGGGG Aukštesnieji augalai Arabidopsis TTTAGGG 4-60
  61. 61.  DNR polimerazės pasižymi dviem svarbiomis ypatybėmis  1. Jos sintetina DNR tik 5’-3’ kryptimi  2. Jos negali inicijuoti DNR sintezės  Šios dvi ypatybės sukuria tam tikrų problemų linijiškos chromosomos 3’ gale 4-61
  62. 62.  Ši problema nėra sprendžiama replikacijos metu  Todėl linijiška chromosoma tampa vis trumpesnė po kiekvienos replikacijos  Tačiau ši problema ląstelėje sprendžiama pridedant DNR sekas prie telomerų galų  Šią reakciją katalizuoja fermentas telomerazė  Telomerazę sudaro baltymas ir RNR  RNR yra komplemetari telomerinei kartotinei DNR sekai  Dėl to telomerazė gali prisikabinti prie 3’ nuosvyros 4-62
  63. 63. 4-63 Žingsnis 3 = Translokacija Prisijungimo – polimerizacijos – translokacijos ciklas gali kartotis daug kartų Tai žymiai pailgina vieną grandinę Komplementarią grandinę sintetina praimazė, DNR polimerazė ir ligazė RNR pradmuo Žingsnis 2 = Polimerizacija Žingsnis 1 = Prisijungimas

×