by Kamila Gałęziowsa

1. NASZA PUSZKA
PANDORY
czyli o tym, jakie nasza Matka Ziemia
niesie zagrożenia mikrobiologiczne.
Autor: Kamila Gałęziowska
I SUM Biologia medyczna z elementami diagnostyki,
specjalność: mikrobiologia;
Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach

2. CZYM SIĘ
ZAJMUJĘ?
http://www.med.kagawa-u.ac.jp/~xraylab/research/image9.jpg

3. Podstawowym celem moich badań jest zbadanie
oporności na powszechnie stosowane antybiotyki
występującej wśród bakterii środowiskowych
wyizolowanych z różnych gleb woj. świętokrzyskiego.
Jakie to antybiotyki i dlaczego?
W badaniach stosuję 7 antybiotyków ß-laktamowych.
Są to antybiotyki, które nie pozwalają na tworzenie
się ściany komórek bakterii- co uniemożliwia
jednocześnie tworzenie się miliardów nowych
komórek. Preparaty te są bardzo często stosowane w
leczeniu zakażeń powodowanych przez bakterie.
Szczepy z jakich gleb badam?
Do badań wykorzystałam 12 prób różnych gleb
(kwaśnych, zasadowych, zanieczyszczonych
związkami toksycznymi np. metalami ciężkimi). Z
tego materiału wyhodowałam i wyizolowałam różne
bakterie.

4. Usytuowanie miejsc z których zostały pobrane próbki gleb, z których
następnie wyizolowano szczepy użyte w badaniach.
⓬
⓬
Numery odpowiadają poszczególnym próbkom
glebowym: 1 – 5 – gleby kwaśne z okolic
kopalni siarki (okolice Tarnobrzega); 6 – gleba
uprawna z terenów czystych ekologicznie
(okolice Klonowa); 7 i 8 – gleba skażona
metalami ciężkimi (Kielce); 9 i 11 – gleba
zasadowa (okolice Nowin pod Kielcami);
10 – gleba z terenów zurbanizowanych (Kielce,
centrum); 12 – gleba skażona uranem (Rudki).

5. DLACZEGO AKURAT GLEBA I DLACZEGO
SZUKAM W NIEJ BAKTERII OPORNYCH ?
Gleba jest najbardziej sprzyjającym środowiskiem
do życia bakterii. Jest w niej dużo składników
odżywczych i wilgoci dzięki czemu
mikroorganizmy dobrze się w niej rozwijają. Gleba
chroni również bytujące w niej bakterie przed
szkodliwym promieniowaniem
UV. Dlatego ilość bakterii, jaka
w niej żyje jest olbrzymia. Część
z nich (ok. 1 do 4%) potrafimy
wyhodować w laboratorium.
http://www.freedrinkingwater.com/Images-Test/E-Coli01.jpg

6. W glebie występują różne drobnoustroje produkujące
antybiotyki, np. grzyby, z których pozyskano penicylinę
– pierwszy antybiotyk ß-laktamowy. Często trafiają tam
również inne związki przeciwbakteryjne. Jednym z ich
podstawowych źródeł są nawozy naturalne pochodzące
z gospodarstw lub pozostałości z oczyszczalni ścieków.
Powszechnie stosowaną praktyką w hodowli zwierząt
jest dodawanie do pasz
antybiotyków
chroniących zwierzęta
przed epidemiami. Zaś
w ściekach trafiających
do oczyszczalni
znajdują się związki i
antybiotyki, które nie
zostały wykorzystane
przez organizm. http://www.pseudomonas.com/images/paeruginosa.jpg

7. Obecnie w Polsce nie
funkcjonuje polityka terapii
antybiotykami, która
określa jakie antybiotyki
można używać i umożliwia
monitorowanie narastania
oporności na antybiotyki http://klebsiella-
pneumoniae.org/klebsiella_pneumoniae_treatment_2.jpg
wśród bakterii.
Z tych powodów gleba
może być rezerwuarem
bakterii opornych na
różne antybiotyki.
http://www.sciencephoto.com/image/12078/large/B2201522-
Klebsiella_pneumoniae_bacteria-SPL.jpg

8. W moich badaniach poszukiwałam bakterii wykazujących kilka
określonych typów oporności:
• ESBL – jest to oporność na
większość (ok. 84%)
antybiotyków ß-laktamowych.
Bakterie wykazujące taką
oporność można zabić tylko
ok.16% tych antybiotyków.
• MBL – zazwyczaj niemal
wszystkie (prawie 98%)
antybiotyki ß-laktamowe nie
są skuteczne wobec bakterii
wykazujących ten typ
oporności.
• KPC – bakterie wykazujące
ten typ oporności są zwykle
niewrażliwe na ok. 62% http://www.news-
medical.net/image.axd?picture=2010%2F1%2Fstaph.jpg
antybiotyków ß-laktamowych.

9. A dlaczego akurat taka oporność jest ważna?
Zarówno oporność typu ESBL, MBL jak i KPC występuje na elementach
genetycznych, które nie są ściśle związane z określoną bakterią. Mogą się one
stosunkowo łatwo rozprzestrzeniać a bakterie mogą przekazywać je sobie
nawzajem. W rezultacie gwałtownie wzrasta ilość bakterii opornych.
A B
Narastanie ilości wykrywanych opornych bakterii Pseudomonas aeruginosa w latach 2000 (A)
i 2006 (B).

10. CO JUŻ UZYSKAŁAM W PROWADZONYCH
PRZEZE MNIE BADANIACH?
http://cdn.physorg.com/newman/gfx/news/2008/streptococcu.jpg

11. I ETAP BADAŃ
Określenie występowania oporności na ampicylinę – jeden
z najczęściej i najdłużej stosowanych antybiotyków
ß-laktamowych.
bakteria wrażliwa
Ten etap badań polegał na
hodowli wyizolowanych bakteria oporna
szczepów bakterii na podłożu
mikrobiologicznym z
dodatkiem ampicyliny. Na
takiej pożywce wyrastały
jedynie szczepy oporne.
Jednocześnie był to wstępny
skrining, ponieważ bakterie
wykazujące interesujące mnie
typy oporności (czyli
ESBL, MBL i KPC) są również
oporne na ampicylinę.
Zobrazowanie Etapu 1 –bakterie wyizolowane z różnych próbek gleb
hodowane na podłożu z ampicyliną .

12. W I etapie badań sprawdziłam ile bakterii wyizolowanych z różnych próbek gleb jest
opornych na ampicylinę. Łącznie zbadałam niemal 300 szczepów bakterii, a spośród
nich aż 175 za nic sobie miało obecność antybiotyku i śmiało rosło na tym podłożu.
Te szczepy badałam w kolejnym etapie.
35
30 29
30
25 24
22 22 22
Liczba szczepów
20 17
16 15 15
15 14
12
9 10
10 8
6 6
5 4
1 1 21
0
G1 G2 G3 G4 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12
AmpC + (oporne) AmpC - (wrażliwe)
Zestawienie ilościowe wyizolowanych z poszczególnych gleb, szczepów bakterii
opornych lub wrażliwych na ampicylinę

13. II ETAP BADAŃ
Określenie występowania oporności typu ESBL.
Do tego realizacji tego etapu badań stosowałam test z wykorzystaniem krążków
nasączonych odpowiednimi antybiotykami. Krążki te układałam w ściśle określony
sposób na płytce z pożywką, na której uprzednio rozprowadziłam zawiesinę bakterii.
Bakteria była klasyfikowana jako ESBL jeśli widziałam charakterystyczne
niesymetryczne strefy wokół określonych krążków z antybiotykami.
Bakteria wykazująca reakcję negatywną na
test ESβL. Brak wydłużenia strefy Bakteria wykazująca reakcję pozytywną na test ESβL.
zahamowania wzrostu bakterii Strzałki wskazują charakterystyczne wydłużenie strefy
zahamowania wzrostu bakterii

14. III ETAP BADAŃ
Określenie występowania oporności typu MBL.
Wykonywałam test z wykorzystaniem krążka nasączonego odpowiednim
antybiotykiem oraz krążka z antybiotykiem i substancją hamującą oporność MBL.
Układałam je w określony sposób na płytce z uprzednio rozprowadzoną zawiesinę
bakterii.
Bakteria była klasyfikowana jako MBL jeśli różnica pomiędzy strefami zahamowania
wzrostu bakterii była równa lub większa niż 5 mm.
27mm
24mm
23,5mm
21mm
Bakteria wykazująca reakcję negatywną na Bakteria wykazująca reakcję pozytywną na test
test MBL. Brak wydłużenia strefy MBL. Strzałki wskazują średnicę strefy
zahamowania wzrostu bakterii zahamowania wzrostu bakterii

15. IV ETAP BADAŃ
Określenie występowania oporności typu KPC.
Tutaj robiłam test z krążkami nasączonymi antybiotykami oraz krążka z substancją
hamującą oporność KPC.
Bakteria była klasyfikowana jako KPC jeśli widziałam charakterystyczne
niesymetryczne strefy wokół określonych krążków
Bakteria wykazująca reakcję negatywną na Bakteria wykazująca reakcję pozytywną na test
test KPC. Brak wydłużenia strefy KPC. Strzałki wskazują charakterystyczne
zahamowania wzrostu bakterii wydłużenie strefy zahamowania wzrostu bakterii

16. 7
6
6
5
Liczba szczepów
4
3 3
3
2 2
2
1 1
1
0
G1 G4 G6 G7 G8 G10 G12
Zestawienie ilościowe szczepów, które wykazały reakcje pozytywną na testy
ESβL, Mβl lub KPC.

17. CO
CHCIAŁABYM
JESZCZE
ZROBIĆ ALE
BRAK MI NA TO
FUNDUSZY?
http://www.sciencephoto.com/image/13208/large/B2440035-Uranium_waste_bacteria,_SEM-
SPL.jpg

18.  Identyfikacja bakterii, czyli określenie ich gatunku, które
wykazują oporność typu ESBL, MBL lub KPC.
Jest to o tyle ważne, bo taka oporność jest badana tylko dla kilku ściśle
określonych gatunków bakterii, zwykle związanych z człowiekiem. Jest
bardzo prawdopodobne, że oporność którą wykryłam występuje u innych
gatunków niż już opisywane. Niestety bakterii środowiskowych nie można
zidentyfikować powszechnie dostępnymi testami komercyjnymi. Trzeba
wykorzystywać metody genetyczne, które są znacznie bardziej
skomplikowane i kosztowne.
 Określenie, czy oporność którą wykrywałam jest
warunkowana przez znane i opisane już geny.
W naukowych publikacjach jest opisanych kilka genetycznych metod
weryfikacji typów oporności bakterii. Jeśli żadna z nich nie będzie
skuteczna wobec moich bakterii, to oznaczać to będzie, że znalazłam
nowe, nieznane wcześniej geny warunkujące antybiotykoodporność.

19.  Określenie nowych genów warunkujących oporność, w
szczególności MBL lub KPC.
Jeśli okaże się, że któryś z moich szczepów bakterii wykazuje oporność wcześniej
nie opisywaną to będę mogła określić jak wygląda gen, który ją warunkuje. Niestety
wymaga to stosowania metod inżynierii genetycznej, które też do najtańszych nie
należą.
Instytucja, w której prowadzę moje
badania posiada aparaturę, która
umożliwi mi realizację tych
planów. Mam do nich wszystkich
dostęp, jak również wsparcie
innych pracowników. Niestety
jednostka ta nie jest w stanie
sfinansować kosztownych
odczynników, które są mi
niezbędne do osiągnięcia
przedstawionych powyżej celów.
I na to właśnie chciałabym przeznaczyć http://www.isciencemag.co.uk/wp-
pieniądze z tego stypendium, gdyby content/uploads/2011/04/bacillus-subtilis.jpg
udało mi się je zdobyć.

20. KIM W OGÓLE JESTEM?
http://epinews.com/Newswire/wp-
content/uploads/2010/07/Acinetobacter_baumanni_grn1.jpg

21. Jestem studentką pierwszego roku studiów
magisterskich kierunku Biologia o specjalności
mikrobiologicznej na Uniwersytecie Jana
Kochanowskiego w Kielcach.
Poza uczelnią natomiast,
zajmuję się sportem jeździeckim
z wszelkimi jego aspektami,
również amatorsko fotografuję
oraz interesuję się sportami walki
i lotnictwem.
Dodatkowe studia podyplomowe
na kierunku Kryminalistyka w
Wyższej Szkole Ekonomii i Prawa
stanowią poszerzenie
zainteresowań z dziedziny
badań nad pismem.

22. DZIĘKUJĘ
ZA
UWAGĘ.
http://www.topillustrations.com/_upload/portfolio/129908390413920051.png