Lappeenrannan teknillisen yliopiston Heli Sirenin esitys Radikaalit innovaatiot seminaarissa 15.5.2013

1. Puuperäisistä raaka-aineista uusia
antibakteerisia yhdisteitä
Heli Siren
Lappeenrannan teknillinen yliopisto

2. Esityksen sisältö
1. Mitä antibakteeriset yhdisteet ovat?
Tarve
Hyödynnettävyys
2. Miten antibakteeriset yhdisteet on löydetty?
Puuaineksen käsittelymenetelmät
Suodinliuoksen käsittely
Identifiointi
3. Yhteenveto
http://www.oulu.fi/northnature/finnish/
Suomi/sukkessio.html
Puuperäisistä raaka-aineista uusia antibakteerisia yhdisteitä

3. Antibakteerisuus: desinfiointi tai pilaantumisen esto
Rasvat ja voiteet, aerosolisuihkeet, vaatteiden
pintakäsittely, elintarviketeollisuuden tuotteet
Lopputuotteita voidaan käyttää lääketieteessä,
elintarviketeollisuudessa lisäaineina tai rakennelisänä.
http://2012.igem.org/Team:Penn/ProjectOverview

4. BIOTULI – biojalostamon uudet tuotteet ja liiketoimintamallit
Tavoitteena on löytää puuperäisistä raaka-ainesta uusia antibakteerisia
yhdisteitä. Vaatii uudenlaisten prosessimenetelmien kehittämistä.
Hankkeessa:
 Selvitetään uusien, antibakteeristen tuotteiden markkinoita ja
liiketoimintamalleja pk-mittakaavassa.
 Tarkastellaan innovaatioprosesseja ja innovaatioaktiivisuutta
biojalostukseen liittyvien teknologiatrendien avulla.
 Selvitetään syntyvien sivutuotteiden hyödyntämistä torrefiointi-
prosessilla.

5. BIOTULI
6/2012
 Kohdealue: Kaakkois-Suomi
 Toteutus: syyskuu 2010-elokuu 2013
 Toimijat: LUT, KyAMK, Saimaan AMK, Kinno, Cursor, Kehy, Wirma ,
StoraEnso, UPM-Kymmene, Andritz
 Budjetti: 1,4 milj. (EAKR, Etelä-Karjalan liitto)
 L
www.biotuli-hanke.fi

6. Uuteaineet
Helposti
haihtuvat
öljyt
Hartsit
Vesiliukoiset
yhdisteet
Hapot Neutraaliyhdisteet Pienimolekyyliset
yhdisteet
Suurimolekyyliset
yhdisteetHartsihapot Rasvahapot
Saponifioitavat
yhdisteet
Ei-saponifioitavat
yhdisteet
•Vesiliukoiset yhdisteet
voidaan uutta kylmällä tai
kuumalla vedellä
•Korkeassa lämpötilassa
kiehuvat yhdisteet
voidaan erottaa
vesitislauksella
•Hartsit voidaan uutta
orgaanisilla liuottimilla
Puuperäisistä raaka-aineista uusia antibakteerisia yhdisteitä

7. PUUN UUTEAINEET:
Paikannus ja pääyhdisteet
Terpenidit
Fenoliyhdisteet
Rasvat ja vahat
Hartsikanavat Terpenoidit
Monoterpeenit
Diterpeenit
(hartsihapot)
Muut terpenoidit
Lehtipuu ja kuori Fenoliset yhdisteet
Stilbeenit
Lignaanit
Hydrolysoituvat tanniinit
Kondensoituvat tanniinit
Kasviin kerääntynyt vesi, mahla Epäorgaaniset
yhdisteet
Parenchyma solut
Rasvat
Rasvahapot
Steryyliesterit
Sterolit
Cambium ja kasvualueet
Glykosidit
Hiilihydraatit
Hartsi
Proteiinit

8. PUU Tuhka (~1 %)
Holoselluloosa
(55 %- 80 %)
Ligniini
(20 % - 30 %)
Uuteaineet
(1-4 %)
Selluloosa
(40-50 %)
Hemiselluloosat
(20-30 %)
Ferulahappo
Koniferyylialkoholi
p-kumariinialkoholi
jne
Sellobioosi
Glukoosi
Oligosakkaridit
Glukuroniksylaani
Arabinoglukuroniksylan
Glukomannaani
Galaktoglukomannaani
Arabinogalaktaani
Terpeenit
Sterolit
Hartsihapot
Uronihapot
Vesiliukoiset hiilihydraatit
Proteiinit
Tanniinit
Ksyloosi
Arabinoosi
Galaktoosi
Mannoosi
Glukuronihappo
Galakturonihappo
Ramnoosi
Fukoosi
α-pineeni
Abietiinihappo
Palmitiinihappo
Betuliini
Katekiini
Gallihappo
Klorofylli

9. Chipping
Solvent extraction/
delignification
Solid-liquid separation +
washing
Membrane
separation
Enzyme or acid
hydrolysis
Solid-liquid separation +
washing stage 2
Treatment of liquid
or energy
Laboratory scale examination of
components: analyses,
characterization, quantification
Test of suitability for
development (option 4: black
liquor application)
Raw material 3:
wood pitch/resin
Raw material 1:
fresh wood stems
Raw material 2: bark
peeling washing waters
Fiber furnish
Additional separation and recycling of
components not suitable to processing
Torrefaction

10. Raakamateriaali
• Lastut
pituus x leveys x paksuus =15 x 20 x 3 mm
– Koivu HW (50,8% kuiva)
– Kuusi SW (59,17% kuiva)
• Sahanpuru, partikkelikoko
30 – 600 mikrometriä
– Mänty SW (49% kuiva)
Puuperäisistä raaka-aineista uusia antibakteerisia yhdisteitä

11. Puuraaka-aine käsitellään kemikaaleilla tai entsymaattisella hajotuksella, jotta saadaan
puumateriaalin komponentteja sisältävä neste (=LIUOTUS). Materiaalista kiinteäksi jäävä osuus
voidaan käyttää uudelleen tai se voidaan suoraan torrefioida, pyrolysoida, tislata, tms.
BIOTULI –projekti

12. Raakamateriaali
Varastoitu puu
tehtaalla
Uuttolaitteisto
Soxhlet, ACE, SFE
Uuttoprosessi
Esikäsittelyt, liuottimet,
lämpötila, aika, jne
Kemiallinen analyysi
GC, HPLC, CE, MS,
yhdistelmätekniikat, ICP-AES,
FTIR, jne
Puun uuteaineet
(mänty, kuusi, ym.)
Puun käsittely
Lähtökohta puunäytteen käsittelyssä
Puusilppua

13. 1.Puun
haketus
2. Nesteen ja
mikrobin/ent-
syymin lisäys
3. Uutto
Kuusi
Mänty
Koivu
Kanto
Oksat
Puuydin
Nila
Kuori
Entsyymit ovat biologisia katalyytteja, eli ne nopeuttavat kemiallisia reaktioita.
Lopullinen puunäytteen käsittely

14. 4.Kiinteä-
neste -
suodatus
5.Membraa-
nisuodatus
Lopullinen puunäytteen käsittely

15. Hydrolysaattinäytteet puuraka-aineen
fermentaation tuloksena
Sahajauho,
mänty 2h ilman
happokatalyytti;
130-150 oC
Lastut, koivu 2h;
130-150 oC
Lastut, koivu
30 min; 100 oC
Lastut, koivu 2h ilman
happokatalyyttiä; 130-
150 oC
Permeaatit analysoitiin,
fraktioitiin ja karakterisoitiin
Menetelminä:
Kapillaarielektroforeesi
GC-EI-MS/MS
HPLC-ESI-MS
CE-UV

16. 6. Analyysit
ja yhdistei-
den identi-
fiointi
Hiilihydraatit ja sokerihapot (esim. polysakkaridit, oligosakkaridit, dekstrinit, glukosidit)
Minutes
52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80
AU
0.0025
0.0030
0.0035
0.0040
0.0045
0.0050
0.0055
0.0060
0.0065
AU
0.0025
0.0030
0.0035
0.0040
0.0045
0.0050
0.0055
0.0060
0.0065PDA - 270nm
50 ppm kaikki
50 ppm kaikki-Rep1
Flavonoideja ja lignaaneja (Secoisolariciresinol)
Hydrolyysi tuottaa seuraavia yhdisteitä:
Aldehydit (C1-9)
Alifaattiset karboksyylihapot
Etanoli
Mono-, di- ja polysakkaridit
Sokerialkoholit
Muut yhdisteet

17. Hydrolyysi ja
fermentaatio
Keittolaitteisto:
Hydrolyysi vedellisissä
liuoksissa
Biorefinery
Prof s Heli Sirén, Mika Mänttäri, Tuomo Sainio, Kaj Backfolk, Marjatta Louhi-Kultanen, Antti Häkkinen

18. Kiinteiden partikkelien suodatus nesteistä
Vacuum filtration (Büchner filter, drum filter)
Pressure filtration (Nutsche, Larox PF)
Centrifugal filtration, decanter centrifuge
Büchner Nutsche
Lignin filter cakes
Larox PF 0.1
Decanter centrifuge Centrifugal filter
Professori Antti Häkkinen

19. NTR-7250 ja NF270 membraanit
Tavoite parantaa happojen ja fenolisten yhdisteiden erotusta
pH-säädöllä
0
5
10
15
20
25
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Permeability,[kg/m²hbar]
Time, [h]
Water flux before
Filtration
Water flux after
Membraanierotus
Puuperäisistä raaka-aineista uusia antibakteerisia yhdisteitä

20. HPLC & IC -erotus
4 laitetta automaattisella näyttöönsyötöllä
Detectors: UV/VIS, RI, CCD, ESI-MS
Kaasukromatografiaerotus(GC)
4 laitetta automaattisella näytteensyötöllä
Detektorit: FID, ECD, TCD, MS, MS/MS
Analyyttisen erotukseen ja yhdisteiden indentifiointiin käytettyjä laitteistoja
Puuperäisistä raaka-aineista uusia antibakteerisia yhdisteitä

21. Kapillaarielektroforeesierotus
-detektoreina UV, PDA, ESI-MS, APCI-MS

22. Antibakteeristen yhdisteiden aktiivisuuden tutkimus
• Minimum Inhibition Concentration (MIC)
Määritys spesifisille mikrobeille
– Kuvaa matalinta konsentraatiota, jolla
yhdiste voi estää bakteerikasvun tai
tappaa enemmän kuin 99%
bakteerista
• Levy tai putket
– Agar: hyvä diffuusio
– Kuoppalevyt
– Kiekkodiffuusio
– Nestemikrodiluutio
– Membraanidiffuusio
http://www.chemistrymag.org/cji/2007/09c052pe.htm

23. AntibakteerIsten yhdisteiden eristys.
On-line-systeemin suunnittelu puuperäisten nesteliuosten
tuotteistamiseen.
BIOTULI –projekti
Kustannusten arviointi tuotteistamiseksi perustuu
kokeelliseen dataan ja matemaattiseen mallintamiseen
Secoisolariciresinol diglucoside (SDG) on
-antioksidantti
-antibakteerisia ominaisuuksia
-on lääketieteellistä näyttöä (diabetes, kolesteroli)
-uutettavissa lignaanin prekursorina (myös vesi/asetoni-seokseen)

24. Sähköavusteinen
erotus:
CE-UV
min5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
20
DAD1 A, Sig=270,20 Ref=off (D:LAURALK201111040703.D)
Sugar alcohols,
furan derivatives
mono- di- and
polysaccharides
uronic acids
flavonoids
organic polymers
2-furoic acid
acids and
inorganic
anions

25. Statin
GC-MS-
erotus
Free acids and
resin acids
Lignans Steryl esters
Triglycerides

26. FTIR spektri
Reference birchwood sample 2 hours treatment, without acid
Ei erotustekniikka
Menetelmällä kvalitatiivista tietoa
Saimaan AMK

27. Kuusi TMP-näyte
Hiilihydraattistandardi
Sähköavusteinen erotus: Hiilihydraatit
Puuperäisistä raaka-aineista uusia antibakteerisia yhdisteitä

28. Haluttuja antibakteerisia yhdisteitä ovat
a) “lovastatin” (statiini, 405 g/mol)
b) “malvidin galactoside” (flavonoidi glucosidi, antosyaniini, 529 g/mol)
c) “gallic acid” (170 g/mol)
Secoisolariciresinol
Tutkimuksessa löydettyjä antibakteerisia yhdisteitä

29. OH
OH
OMe
MeO
OH
OH
O
OH
OH
OMe
MeO
O
OH
O
OH
OH
O
MeO
OMe
O
OH
OH
OMe
MeO
OOH
OH
OH
OMe
MeO
OH
OH
O
OH
OH
OMe
MeO
OH
OH
O
MeO
OH
OH
OH
OMe
OH
O
O
OH
OH
OMe
MeO
SecoisolariciresinolHydroxymatairesinol
Conidendrin Nortrachelogenin
Isolariciresinol
Liovil Lignan A
Pinoresinol
Tutkimuksessa löydettyjä antibakteerisia yhdisteitä

30. 3
Uutto
4
Kiinteä – neste
suodatus
5
Konsentrointi
 Veden kulutus 17 L / 1 kg puuta
 Mikro-organismin kulutus 200 g / 1 kg puuta (ei vielä optimoitu
määrää)
Kuusen flavonoidit (polymeerit)
Arvio prosessisaannosta (seos)
1 kg
5 g
Kohdeyhdisteet
Antibakteeriset
aineet
Puuraaka-
aine
Selvittämättä veden ja mikro-organismin kierrätys.
Puuperäisistä raaka-aineista uusia antibakteerisia yhdisteitä

31. Yhteenveto
Projektissa tehty useita bioalan selvityksiä, opinnäytetöitä ja keksintöjä, patentti
ja artikkeleita
Projekti on tuottanut ja tuottaa kiinnostavaa spin-off tutkimusta
On kehitetty hyviä erotus- ja karakterisointimenetelmiä: edellytyksiä ovat
esimerkiksi nopeus, esikäsittelyn yksinkertaisuus, automaatio, toistettavuus,
useiden näytteiden ja analyyttisten parametrien samanaikainen analysointi,
edullisuus, helppous ja ympäristöystävällisyys.
Hyödynnetty poikkitieteellistä tieteellistä osaamista
Tutkittu prosessioperaatioiden online liitäntä pilotointiin
Tutkimuksen jatkoon tarvitaan tuntuvaa rahoitusta: panostus pilotkokeisiin ja
antibakteerisen yhdisteen suurivoluumiseen eristykseen
Puuperäisistä raaka-aineista uusia antibakteerisia yhdisteitä

32. Kiitos!