BSc. thesis presentation.

1. Università degli studi di Napoli Federico II
Corso di laurea in Scienza e Ingegneria dei Materiali
Tesi di laurea triennale
VALUTAZIONE DI UN DISPOSITIVO
NANOFLUIDICO PER LA SEPARAZIONE SU
BASE ENTROPICA DI MACROMOLECOLE
CONFINATE
Relatore:
Ch.mo Prof. Paolo A. Netti
Correlatore:
Dott.ssa Ing. Ilaria De Santo
Candidato:
Emanuele Zappia
Matr. 539/212
ANNO ACCADEMICO 2011/2012

2. La nanofluidica si occupa del
comportamento, della manipolazione e
del controllo dei fluidi confinati in
strutture nanometriche
Ingegnerizzando l’architettura di materiali nanostrutturati e studiando le
dinamiche delle molecole all’interno di tali strutture, si può virtualmente
ottenere qualsiasi interazione desiderata
L’utilizzo di dispositivi nanofluidici, aventi dimensioni paragonabili a quelle
delle biomolecole, è vantaggioso per molte applicazioni biomedicali
NANOFLUIDICA

3. SEPARAZIONE MOLECOLARE IN
DISPOSITIVI NANOSTRUTTURATI
• Nella moderna biologia e nell'ingegneria biomedica la capacità di separare ed identificare biomolecole da
campioni biologici complessi, in maniera accurata ed efficiente, è rilevante per lo sviluppo di molte applicazioni
• In questo campo la capacità di influenzare il trasporto delle molecole è di primaria importanza
Dispositivo di
separazione
Forza di
trasporto
Meccanismo di
separazione
Campione
molecolare
Proprietà
fisiche
Array di trappole
entropiche
Campo elettrico Intrappolamento
entropico
DNA Dimensione,
carica
Array di
nanocolonne
Campo elettrico
pulsante
Stretching
elettroforetico
DNA Dimensione,
carica
Strutture
anisotrope ANA
(Anisotropic
nanofilter array)
Campo elettrico Separazione di
Ogston –
intrappolamento
entropico
DNA,
proteine
Dimensione,
carica
Ostacoli
asimmetrici
Campo elettrico Movimenti
Browniani
rettilficati
DNA Dimensione,
carica
SISTEMI NANOSTRUTTURATI DALLA LETTERATURA
Allo stato attuale i dispositivi nanostrutturati di separazione molecolare:
• Necessitano della presenza di un campo elettrico o di un flusso imposto
• Funzionano esclusivamente con molecole cariche

4. MECCANISMI DI SEPARAZIONE
• Le proprietà di biomolecole attraverso un struttura
filtrante sono determinate da complesse interazioni tra
le dinamiche molecolari e la fisica dei sistemi
nanofluidici
• Questi sistemi mimano i meccanismi di trasporto delle
matrici gel coniugando ad essi la possibilità di
progettare in maniera controllata la struttura filtrante
SEPARAZIONE MOLECOLARE IN
DISPOSITIVI NANOSTRUTTURATI
FENOMENI ALLA BASE DELLA SEPARAZIONE
• Diffusività in ambiente nanoconfinato
• Risposta a un campo elettrico imposto in
ambiente nanoconfinato
• I meccanismi di trasporto molecolare all’interno di strutture nanometriche sono molto rilevanti,
possiamo influenzare tali meccanismi modulando le dimensioni caratteristiche del sistema
• Abbiamo bisogno di un modello che tenga conto della flessibilità delle molecole

5. TRASPORTO IN MATERIALI
NANOSTRUTTURATI
Per rg/rp<<1 è valida la teoria idrodinamica delle sfere rigide
• I fenomeni diffusivi sono regolati dai coefficienti Keq KD
• Questo modello non riesce a descrivere i fenomeni di trasporto
molecolare in nanostrutture
Per rg/rp≈1 non più vale la teoria idrodinamica delle sfere rigide
• Bisogna considerare fenomeni di arrangiamento conformazionale dovuti alla flessibilità della molecola (Leggi di
scala di De Gennes)
• Diventano rilevanti le interazioni a corto raggio (interazioni di van der Waals, forze idrofobiche, elettrostatiche)
Parametri che influenzano il trasporto delle molecole
• Dimensioni delle molecole(rg, MW)
• Dimensione del canale (h)
• Rigidità e flessibilità della molecola
• Frizione (z)
• Interazione molecola/parete: repulsione e attrazione
• Proprietà della superficie (proprietà chimiche, ruvidità)
DeqKK
D
D
bulk
confined


6. SCOPO DEL LAVORO
• Sfruttare il confinamento di biomolecole in un sistema nanostrutturato al
fine di realizzare un dispositivo di separazione che non utilizzi campi
esterni imposti né di pressione idrodinamica, né elettrici
• Ipotizzare e verificare la validità del principio di separazione molecolare
su base entropica, regolato dalla temperatura, su cui basare tale
dispositivo
MISURAZIONI PER VALUTARE L’EFFETTO DELLA TEMPERATURA
• Effetto sulla dinamica diffusiva
• Effetto sulla cinetica delle particelle
Misurazioni di spettroscopia di correlazione di
fluorescenza FCS del PEG 20kDa e 40kDa
confinato in nanocanali di 10nm
a 23°C, 37°C e 45°C

7. SCOPO DEL LAVORO
MODELLO TERMODINAMICO PER POLIMERI CONFINATI PROPOSTO DA DE GENNES
• Contributo entropico legato a cambi di conformazione della molecola
• Contributo entalpico legato a fenomeni di adsorbimento alla parete
REGOLARE LE CONDIZIONI
TERMODINAMICHE DI CONFINAMENTO
SPONTANEO ATTRAVERSO CAMBI DI
TEMPERATURA

8. h = 10÷30
nm
w = 5÷30 mm
500 mm
FCS
Sampling volume
DISPOSITIVO
NANFLUIDICO
Abbiamo utilizzato un chip
provvisto di nanocanali, di 10
nm di spessore, collegati a
serbatoi micrometrici carichi di
una soluzione di PEG
funzionalizzato con rodamina
TECNICA DI MISURA
Per le misurazioni ci siamo
avvalsi della tecnica di
spettroscopia di correlazione
di fluorescenza FCS abbinata
alla microscopia confocale
MATERIALI E METODI

9. • La diffusione browniana fa fluttuare il
numero di molecole nel volume
confocale illuminato nel tempo
• Di conseguenza si registrano le
fluttuazioni del segnale di intensità di
fluorescenza
t=0 t=1 t=2
N=3 N=2 N=4
 
   
 
O 2
I t I t
G
I t
   
 
Dalle fluttuazioni di
intensità viene
calcolata la funzione
di autocorrelazione
MATERIALI E METODI La tecnica FCS

10. Modello anomalo
Modello di Wirth

G() 
1
N
1
1 
diff




















G() 
1
N
( funbound )
1
1

diff






(1 funbound )e


Des














MATERIALI E METODI Procedura di fitting
STUDIO DELLA DINAMICA DIFFUSIVA
Attraverso procedure di fitting ricaviamo il tempo di diffusione D a diverse
temperature
STUDIO DELLA CINETICA
Attraverso procedure di fitting ricaviamo il numero di particelle medio <N> a diverse
temperature

11. Diff
Stokes-Einstein
Diff
xy
iD

 2
4

wxy = 0.17 µm
s= wz/wxy = 5
2
1
11
)(
s
N
G
DD 












 D
kT
r
r
kT
D h
h 66

T [°C]
D [PEG 20]
[cm2
/s]
D [PEG 40]
[cm2
/s]
rh [PEG 20]
[nm]
rh [PEG 40]
[nm]
23 4,53± 0,01 E-07 3,46± 0,01 E-07 5,1 ± 0,1 6,7 ± 0,1
37 5,42 ± 0,01 E-07 4,38 ± 0,01 E-07 6,0 ± 0,1 7,5 ± 0,1
45 6,94 ± 0,03 E-07 4,97 ± 0,03 E-07 5,6 ± 0,5 7,9 ± 0,5
Misure del PEG 20 E 40kDa a differenti temperature
RISULTATI Misure in soluzione

12. All’aumentare della temperatura
diminuisce il tempo di diffusione
delle molecole τdiff
T
 
 


diff
N
G




1
11
Utilizzando la procedura di fitting
anomalo abbiamo osservato che  non
varia con la temperatura e, per il PEG
40kDa, vale ≈ 0,5 ± 0,1
RISULTATI Effetto della temperatura sul tempo di diffusione nei
nanocanali - PEG 40kDa

13. All’aumentare della temperatura
diminuisce il numero di particelle
medio rilevato <N> nel nanocanale
T
• E’ stata osservata una cinetica di
svuotamento dei nanocanali
all’aumentare della temperatura
• Per il PEG 40kDa si ha uno
svuotamento significativo nel
passaggio da 23°C a 37°C
RISULTATI Effetto della temperatura sul numero di particelle
medio nei nanocanali – PEG 40kDa

14. Anche per il PEG 20kDa
all’aumentare della temperatura
diminuisce il numero di particelle
medio rilevato <N> nel nanocanale
E’ stata osservata una cinetica di
svuotamento dei nanocanali
all’aumentare della temperatura
anche per il PEG 20kDa ma si ha
uno svuotamento significativo nel
passaggio da 45°C a 45°C-14h
RISULTATI Effetto della temperatura sul numero di particelle
medio nei nanocanali – PEG 20kDa
T

15. • Abbiamo osservato che le
partizioni normalizzate, per il
PEG 40kDa e PEG 20kDa,
variano in maniera diversa nel
tempo al variare della
temperatura
• Attraverso un meccanismo di
separazione per via entropica,
regolato termicamente, viene
favorita l’uscita di PEG a più alto
peso molecolare all’aumentare
della temperatura
• Il punto di massima efficienza
si raggiunge a 37°C
• E’ stata stimata un’efficienza di
svuotamento dei canali del 38%
RISULTATI Principio di separazione
PUNTO DI
MASSIMA
EFFICIENZA

16. • Le condizioni energetiche di confinamento
spontaneo possono essere valutate
analizzando l’andamento dei contributi
entropico ed entalpico in funzione
del coefficiente r/D
• All’aumentare della temperatura varia il
punto d’instabilità termodinamica ΔG = 0
In range di confinamento più spinto, molecole
a più alto peso molecolare impiegano meno
tempo per uscire dal canale a causa del
maggiore peso del contributo entropico nel
bilancio tra richiamo entropico e diffusività
Browniana
RISULTATI Discussione

17. CONCLUSIONI
• E’ stata verificata sperimentalmente la validità del principio alla
base di un dispositivo nanostrutturato di separazione molecolare su
base entropica, regolato dalla temperatura
• Il dispositivo, non prevedendo l'imposizione di campi elettrici e
flussi applicati, può essere utilizzato per separare molecole
elettricamente neutre
• Il dispositivo realizza una separazione massima a 37°C del 38%
• Al fine di ingegnerizzare il dispositivo di separazione molecolare
innovativo qui valutato, verranno effettuate ulteriori analisi su molecole
di interesse applicativo

18. GRAZIE PER
L’ATTENZIONE