SlideShare a Scribd company logo

dwr_lmhlyl_fy_stkhls_dna (1).ppsx.. Isolation of DNA from microorganisms

•Download as PPSX, PDF•
•
S
ssuser4d911a

Genatic

Science
1 of 28
‫القولون‬ ‫بكتيريا‬ ‫مثل‬ Escherichia coli Amal AlGhamdi- MIC251-2011 1
‫ا‬‫ل‬‫أو‬ : ‫الستخالص‬ Extraction DNA : 1 - ‫تحليل‬ ‫الخاليا‬ Cell Lysis ‫وتحرير‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ : ‫تحويل‬ ‫الخلية‬ ‫إلى‬ ‫صورة‬ spheroplast ‫عن‬ ‫طريق‬ ‫هضم‬ ‫الجدار‬ ‫الخلوي‬ . ‫تتم‬ ‫هذه‬ ‫الخطوة‬ ‫باستخدام‬ ‫انزيمات‬ ‫هاضمة‬ ‫مثل‬ Lysozyme ‫أو‬ ‫المواد‬ ‫شديدة‬ ‫القلوية‬ Alkaline analysis ‫ويستخدم‬ ‫السكروز‬ ‫للحفاظ‬ ‫على‬ ‫الضغط‬ ‫السموزي‬ ‫المالئم‬ ‫لعدم‬ ‫انفجار‬ ‫الـ‬ spheroplast ‫من‬ ‫النفجار‬ . 2 - ‫التخلص‬ ‫من‬ ‫المكونات‬ ‫األخرى‬ ‫في‬ ‫الـ‬ spheroplast ‫مثل‬ ‫الجزيئات‬ ‫الكبرى‬ ‫وانسياب‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫ومحتويات‬ ‫الخاليا‬ . ‫ا‬‫ا‬‫ثاني‬ : ‫التنقية‬ DNA purification : ‫فصل‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ DNA ‫الكروموسومي‬ ‫عن‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫الريبوزي‬ RNA ‫والبالزميد‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 2
‫أوال‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫وتحرير‬ ‫الخلية‬ ‫تحليل‬ DNA : ‫زجاجي‬ ‫حبيبات‬ ‫أو‬ ‫المحللة‬ ‫اإلنزيمات‬ ‫باستخدام‬ ‫الخلية‬ ‫تحلل‬ ‫او‬ ‫ة‬ ‫المركزي‬ ‫الطرد‬ ‫أثناء‬ ‫في‬ ‫بلورية‬ . ‫اإلنزيم‬ ‫دور‬ Lysozymre : ‫لم‬ ‫الجليكوسيدية‬ ‫للرابطة‬ ‫المائي‬ ‫التحليل‬ ‫بتحفيز‬ ‫يقوم‬ ‫الجدار‬ ‫كونات‬ ‫الكربوهيدراتية‬ ( peptidoglycan ) ‫الغالف‬ ‫تحطيم‬ ‫وبالتالي‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫ويحرر‬ ‫الخارجي‬ DNA ‫مكونات‬ ‫من‬ ‫وغيره‬ ‫الخليه‬ . ‫المنظم‬ ‫المحلول‬ ‫دور‬ Buffer solution : ‫الـ‬ ‫على‬ ‫المحتوي‬ ‫محلول‬ ‫به‬ ‫المتواجد‬ ‫الوسط‬ ‫يكون‬ ‫أن‬ ‫بد‬ ‫ال‬ DNA ‫على‬ ‫يحتوي‬ ‫ملحي‬ ‫محلول‬ ،‫منظم‬ ‫محلول‬ ‫صورة‬ ‫في‬ EDTA . ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫تأين‬ ‫بسبب‬ DNA ‫أكثر‬ ‫فإنه‬ ‫سالبه‬ ‫لشحنه‬ ‫وحمله‬ ‫المقطر‬ ‫الماء‬ ‫في‬ ‫عنه‬ ‫الملحيه‬ ‫المحاليل‬ ‫في‬ ‫وذوبانا‬ ً‫ا‬‫ثبات‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 3
‫الـ‬ ‫أهمية‬ EDTA : 1 - ‫مثل‬ ‫الشحنه‬ ‫ثنائية‬ ‫الموجبة‬ ‫األيونات‬ ‫مع‬ ‫ترتبط‬ ( Cd+2, Mg+2, Mn+2 ) ‫ف‬ ‫األيونية‬ ‫الفوسفات‬ ‫مجموعات‬ ‫مع‬ ‫أمالح‬ ‫تكون‬ ‫قد‬ ‫التي‬ ‫ي‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ DNA . 2 - ‫النووي‬ ‫للحمض‬ ‫المحلل‬ ‫اإلنزيم‬ ‫تثبيط‬ deoxyribonuclease ‫المغنيسيوم‬ ‫أيونات‬ ‫إلى‬ ‫يحتاج‬ ‫ألنه‬ Mg+2 ‫المنجنيز‬ ‫أو‬ Mn+2 ‫لكي‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫تحليل‬ ‫في‬ ‫بوظيفته‬ ‫يقوم‬ DNA . • ‫القلوي‬ ‫الوسط‬ ( pH=8 ) ‫بين‬ ‫اإللكتروليتيه‬ ‫التفاعالت‬ ‫يقلل‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ DNA ‫عديدة‬ ‫واألمينات‬ ‫القلوية‬ ‫والهيستونات‬ ‫التكافؤ‬ . • ‫العالية‬ ‫القلوية‬ ( ‫درجة‬ pH ‫العالية‬ ) ‫انزيم‬ ‫نشاط‬ ‫من‬ ‫تقلل‬ nuclease ‫البروتين‬ ‫طبيعة‬ ‫وتغير‬ denature . • ‫ال‬ ‫بالحمض‬ ‫المرتبطة‬ ‫البروتينات‬ ‫فصل‬ ‫على‬ ‫تساعد‬ ‫كما‬ ‫نووي‬ DNA ‫الهيس‬ ‫للبروتينات‬ ‫الموجبة‬ ‫والشحنة‬ ‫القلوية‬ ‫بزيدة‬ ‫تونيه‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 4
• ً‫ا‬‫ثاني‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫معقد‬ ‫فصل‬ DNA ‫والبروتين‬ : ‫التفاع‬ ‫لتعطيل‬ ‫المرحلة‬ ‫هذه‬ ‫في‬ ‫عادة‬ ‫المنظفات‬ ‫تستخدم‬ ‫الت‬ ‫السا‬ ‫الشحنة‬ ‫مع‬ ‫الشحنه‬ ‫موجبة‬ ‫الهستونات‬ ‫بين‬ ‫األيونية‬ ‫لبة‬ ‫النووي‬ ‫للحمض‬ DNA . ‫عادة‬ ‫يستخدم‬ sodium dodecyl sulphate ( SDS :) 1 - ‫صفة‬ ‫ويعطيها‬ ‫البروتينات‬ ‫مع‬ ‫يرتبط‬ ‫متأين‬ ‫منظف‬ ‫شديدة‬ ‫األيونية‬ . 2 - ‫للـ‬ ‫المحللة‬ ‫لإلنزيمات‬ ‫متلف‬ DNA ( deoxyribonucleases ) ‫البروتينات‬ ‫من‬ ‫وغيره‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 5
• ‫األمالح‬ ‫من‬ ‫العالية‬ ‫التراكيز‬ ( ‫مثل‬ NaCl ‫وغيره‬ ) ‫تضاف‬ ‫بالح‬ ‫المرتبطة‬ ‫للبروتينات‬ ‫التام‬ ‫الفصل‬ ‫من‬ ‫للتأكد‬ ‫النووي‬ ‫مض‬ DNA ‫الشحنة‬ ‫موجبة‬ ‫األمينات‬ ‫مع‬ ‫الرابطة‬ ‫وتزيل‬ ‫عنه‬ . • ‫الحمض‬ ‫بين‬ ‫األيوني‬ ‫االرتباط‬ ‫قوة‬ ‫األمالح‬ ‫تضعف‬ ‫حيث‬ ‫الشحنه‬ ‫موجبة‬ ‫والمركبات‬ ‫النووي‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 6
‫ثالثا‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫فصل‬ DNA ‫الخلية‬ ‫مكونات‬ ‫من‬ ‫غيره‬ ‫عن‬ ‫الذائبة‬ ‫البروتي‬ ‫من‬ ‫المحلول‬ ‫خلو‬ ‫من‬ ‫التأكد‬ ‫يجب‬ ،‫المرحلة‬ ‫هذه‬ ‫في‬ ‫نات‬ ‫الكحول‬ ‫مع‬ ‫الكلوروفورم‬ ‫خليط‬ ‫باستخدام‬ ‫وذلك‬ isoamyl alcohol ‫المركزي‬ ‫الطرد‬ ‫ثم‬ . ‫تظهر‬ ‫ذلك‬ ‫بعد‬ 3 ‫طبقات‬ : ‫طبقة‬ ‫وبينهما‬ ‫عضوية‬ ‫سفلى‬ ‫وطبقة‬ ،‫سائلة‬ ‫عليا‬ ‫طبقة‬ ‫وسطية‬ ‫الموه‬ ‫البروتين‬ ‫من‬ ‫منضغط‬ ‫شريط‬ ‫تمثل‬ . ‫للبروتين‬ ‫سطحي‬ ‫تشويه‬ ‫الكلوروفورم‬ ‫يسبب‬ ‫والكحول‬ isoamyl alcohol ‫ثبات‬ ‫على‬ ‫ويساعد‬ ‫الرغوه‬ ‫يقلل‬ ‫بي‬ ‫وتفصل‬ ‫البروتين‬ ‫على‬ ‫المحتوية‬ ‫الفاصلة‬ ‫الطبقة‬ ‫الطبقتين‬ ‫ن‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 7
• ‫فصل‬ ‫ويتم‬ ‫النووية‬ ‫األحماض‬ ‫على‬ ‫العليا‬ ‫الطبقة‬ ‫تحتوي‬ ‫ويتم‬ ‫ها‬ ‫اإليثانول‬ ‫كحول‬ ‫باستخدام‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫ترسيب‬ . • ‫النووي‬ ‫للحمض‬ ‫المتأينة‬ ‫الطبيعة‬ ‫بسبب‬ DNA ‫قابل‬ ‫غير‬ ‫يصبح‬ ‫القطبية‬ ‫منخفض‬ ‫عضوي‬ ‫وسط‬ ‫في‬ ‫تواجد‬ ‫إذا‬ ‫للذوبان‬ . • ‫بلف‬ ‫جمعه‬ ‫ويمكن‬ ‫الشكل‬ ‫خيطي‬ ‫راسب‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫يكون‬ ‫ه‬ ‫زجاجية‬ ‫عصا‬ ‫على‬ . • ‫والحمض‬ ‫بالبروتينات‬ ‫المعزول‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫يتلوث‬ ‫قد‬ ‫النووي‬ RNA . • ‫المتر‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫بإذابة‬ ‫البروتين‬ ‫من‬ ‫التخلص‬ ‫يمكن‬ ‫في‬ ‫سب‬ ‫والكحول‬ ‫الكلوروفورم‬ ‫خليط‬ ‫استخدام‬ ‫وإعادة‬ ‫ملحي‬ ‫وسط‬ isoamyl alcohol ‫الطبقة‬ ‫في‬ ‫بروتين‬ ‫اي‬ ‫يبقى‬ ‫ال‬ ‫حتى‬ ‫الوسطى‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 8
• ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫يترسب‬ ‫ال‬ RNA ‫الـ‬ ‫مع‬ DNA ‫قد‬ ‫ولكنه‬ ‫النووي‬ ‫للحمض‬ ‫ملوثة‬ ‫صورة‬ ‫في‬ ‫يتواجد‬ DNA . • ‫له‬ ‫المحلل‬ ‫اإلنزيم‬ ‫باستخدام‬ ‫منه‬ ‫التخلص‬ ‫يمكن‬ Ribonuclease ( RNase ) ‫البروتين‬ ‫من‬ ‫التخلص‬ ‫بعد‬ . • ‫الكحول‬ ‫يستخدم‬ ‫قد‬ isoprobanol ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫لترسيب‬ DNA ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ً‫ا‬‫تارك‬ RNA ‫المحلول‬ ‫في‬ . • ‫النووي‬ ‫والحمض‬ ‫البروتين‬ ‫فصل‬ ‫خطوات‬ ‫إعادة‬ ‫يمكن‬ RNA ‫نووي‬ ‫حمض‬ ‫على‬ ‫للحصول‬ ‫مرات‬ ‫عدة‬ DNA ‫النقاوة‬ ‫عالي‬ . • ‫فصل‬ ‫يتم‬ ‫أن‬ ‫يفترض‬ ‫الطريقة‬ ‫بهذه‬ 50 % ‫الكلي‬ ‫المحتوى‬ ‫من‬ ‫النووي‬ ‫للحمض‬ DNA ‫المحصول‬ ‫ممتوسط‬ ،‫الخلية‬ ‫في‬ ‫يساوي‬ 1 - 2 ‫للخاليا‬ ‫الرطب‬ ‫الوزن‬ ‫من‬ ‫جم‬ ‫لكل‬ ‫ملجم‬ ‫البكتيرية‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 9
‫إ‬ ‫حتياطات‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫عملية‬ ‫أثناء‬ ‫هامة‬ DNA 1 - ‫تلوث‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫بإنزيمات‬ ‫تحلل‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ DNase ‫هو‬ ‫الملوث‬ ‫األساسي‬ ‫لتحضيرات‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫النقي‬ . ‫لذلك‬ ‫ي‬ ‫جب‬ ‫استخدام‬ ‫خاليا‬ ‫طازجه‬ ‫في‬ ‫الطور‬ ‫اللوغاريتمي‬ ‫للتقليل‬ ‫من‬ ‫تحل‬ ‫ل‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫وتكسره‬ ‫ا‬‫ا‬‫انزيمي‬ . 2 - ‫تجنب‬ Shearing of DNA : ‫يجب‬ ‫تجنب‬ ‫تحلل‬ ‫وتكسر‬ ‫أشرطة‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫الكروموسومي‬ ‫الطويلة‬ ‫ذات‬ ‫األوزان‬ ‫الجزيئية‬ ‫الثقيلة‬ ‫بسبب‬ ‫القوة‬ ‫الميكانيكية‬ . 3 - ‫تجنب‬ ‫التلوث‬ ‫بالمحاليل‬ ‫الكيميائية‬ ‫المستخدمه‬ ‫في‬ ‫تنق‬ ‫ية‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ : ‫مثل‬ ‫التلوث‬ ‫بالفينول‬ ،‫والكلوروفورم‬ ‫مما‬ ‫يؤثر‬ ‫على‬ ‫ف‬ ‫صل‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫النقي‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 10
4 - ‫يجب‬ ‫تجنب‬ ‫زيادة‬ ‫تركيز‬ ‫الخاليا‬ ‫للعينة‬ ‫التي‬ ‫يستخلص‬ ‫منها‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫لتجنب‬ ‫زيادة‬ ‫تركيز‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫أو‬ ‫تكسر‬ ‫األشرطة‬ ‫ذات‬ ‫األوزان‬ ‫الجزي‬ ‫ئية‬ ‫العالية‬ . 5 - ‫يجب‬ ‫التأكد‬ ‫من‬ ‫فصل‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫عن‬ ‫البروتينات‬ ‫والمواد‬ ‫الكيميا‬ ‫ئية‬ ‫الملوثة‬ . 6 - ‫يجب‬ ‫ترسيب‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ DNA ‫باستخدام‬ ‫اإليثانول‬ ، ‫األيزوبروبانول‬ ، ‫البولي‬ ‫إيثلين‬ ‫جليكول‬ PEG . 7 - ‫غسيل‬ ‫وإذابة‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫باستخدام‬ ‫المحاليل‬ ‫المنظمة‬ ‫المناسبة‬ . ‫إ‬ ‫حتياطات‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫عملية‬ ‫أثناء‬ ‫هامة‬ DNA Amal AlGhamdi- MIC251-2011 11
• ‫الخ‬ ‫الجينات‬ ‫جميع‬ ‫على‬ ‫المحتوية‬ ‫الوراثية‬ ‫الخريطة‬ ‫تحديد‬ ‫اصة‬ ‫الدقيق‬ ‫الحي‬ ‫بالكائن‬ . • ‫القوا‬ ‫وتتابع‬ ‫الجزيئي‬ ‫تركيبه‬ ‫في‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫يحمل‬ ‫عد‬ ‫جينا‬ ‫صورة‬ ‫في‬ ‫الوراثية‬ ‫المعلومات‬ ‫جميع‬ ‫النيتروجينيه‬ ‫ت‬ . • ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫فصل‬ ‫عند‬ DNA ‫نسبة‬ ‫معرفة‬ ‫يمكن‬ ‫للكائنات‬ ‫السيتوسين‬ ‫إلى‬ ‫الجوانين‬ G:C % ‫الحي‬ ‫الكائن‬ ‫تعريف‬ ‫وبالتالي‬ ‫يتبعها‬ ‫التي‬ ‫المملكة‬ ‫ومعرفة‬ . • ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخدام‬ DNA ‫الحيوية‬ ‫التقنيه‬ ‫تجارب‬ ‫في‬ Biotechnology : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫مع‬ ‫معينة‬ ‫جينات‬ ‫ربط‬ ‫مثل‬ DNA ‫البروتي‬ ‫المواد‬ ‫بعض‬ ‫انتاج‬ ‫عمليات‬ ‫في‬ ‫للبكتيريا‬ ‫أو‬ ‫نيه‬ ‫مجال‬ ‫وفي‬ ‫الدوائية‬ ‫المجالت‬ ‫في‬ Gene therapy . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 12
• ‫التجربة‬ ‫من‬ ‫الغرض‬ : ‫الحمض‬ ‫على‬ ‫الحصول‬ ‫للبكتيريا‬ ‫الكرموسومي‬ ‫النووي‬ ‫بصور‬ ‫نقيه‬ ‫ة‬ . • ‫األدوات‬ : 1 - ‫بيئة‬ Luria Bertani ( LB ) ‫سائلة‬ . 2 - ‫بكتيريا‬ ‫من‬ ‫نقية‬ ‫عزلة‬ E. Coli . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 13
3 - ‫منظم‬ ‫محلول‬ Buffer ( Tris/EDTA/glucose ) ‫له‬ ‫ويرمز‬ ALS-I . 4 - 2 ‫الصوديوم‬ ‫هيدروكسيد‬ ‫عياري‬ 2 N NaOH . 5 - 4 % ‫محلول‬ ‫من‬ SDS ( Sodium dodecyl sulphate .) 6 - 3 ‫الصوديوم‬ ‫أسيتات‬ ‫مولر‬ 3 M Sodium Acetate pH=6.0 . 7 - ‫خليط‬ ‫محلول‬ ( phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol ) 25:24:1 8 - ‫كحول‬ Isoprpanol . 9 - ‫كحول‬ 70% Ethanol . 10 - ‫األيونات‬ ‫منزوع‬ ‫مقطر‬ ‫ماء‬ Distilled deionized water ( DDW ) . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 14
‫تابع‬ / ‫األدوات‬ : 11 - ‫غطاء‬ ‫ذات‬ ‫معقمة‬ ‫بالستيكية‬ ‫أنابيب‬ Eppendorf tubes ( 1.5-2 ml .) 13 - ‫الكترونيه‬ ‫دقيقة‬ ‫ماصات‬ Electromicropipett ‫األحجام‬ ‫مختلفة‬ ( (2-20µl, 10-100µl, 100-1000µl . 14 - ‫األلكترونية‬ ‫الماصات‬ ‫نهايات‬ . • Tips with different size 15 - ‫حوامل‬ ‫للألنابيب‬ . • (Racks for tube) 16 - ‫الماصات‬ ‫لنهايات‬ ‫حوامل‬ Quarts cuvettes . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 15
‫تابع‬ / ‫األدوات‬ : 14 - ‫الرج‬ ‫جهاز‬ (Vortex ) . 15 - ‫جهاز‬ ‫الضوئي‬ ‫الطيف‬ ‫تحليل‬ (Spectrophotometer) . 16 - ‫دقيق‬ ‫مركزي‬ ‫طرد‬ ‫جهاز‬ Microcentrifuge . 16 - ‫المستهلكات‬ ‫من‬ ‫للتخلص‬ ‫علبة‬ Biohazard Container 17 - ‫المستهلكات‬ ‫من‬ ‫للتخلص‬ ‫أكياس‬ Biohazard Bags Amal AlGhamdi- MIC251-2011 16
‫ا‬‫ل‬‫أو‬ : ‫الستخالص‬ ‫في‬ ‫المستخدمه‬ ‫المحاليل‬ ‫تحضير‬ : 1 - ‫تحضير‬ ‫المنظمة‬ ‫المحاليل‬ Buffers 1 - ‫محلول‬ ALS-I : : ‫من‬ ‫يتكون‬ 2.5 ml of Tris HCl (stock: 1M, pH 8) 2.5 ml of EDTA (stock: 0.5M, pH 8) Glucose 0.9 gm of ‫إلى‬ ‫يضاف‬ 100 ‫مقطر‬ ‫ماء‬ ‫مل‬ DDW ‫درجة‬ ‫عند‬ ‫ويحفظ‬ ، ‫حرارة‬ 4̊ ‫م‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 19
‫ا‬‫ا‬‫ثالث‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫خطوات‬ DNA ‫البكتيري‬ : • ‫يلقح‬ 5 ‫بيئة‬ ‫من‬ ‫مل‬ LB ‫بكتيريا‬ ‫من‬ ‫نقي‬ ‫بلقاح‬ E. coli ‫وتحضن‬ ‫لمدة‬ 12 - 24 ‫عند‬ ‫ساعه‬ 37 ˚ ‫م‬ . • ‫بيئة‬ ‫بأنبوبة‬ ‫ونحتقظ‬ LB ً‫ا‬‫أيض‬ ‫وتحضن‬ ‫تلقيح‬ ‫بدون‬ . • ‫ينقل‬ 1.5 ‫دقيقة‬ ‫مركزي‬ ‫طرد‬ ‫أنبوبة‬ ‫إلى‬ ‫المزرعة‬ ‫من‬ ‫مل‬ microcentrifuge ‫الر‬ ‫من‬ ‫نتخلص‬ ‫ثم‬ ‫دقيقتين‬ ‫لمدة‬ ‫ويطرد‬ ‫ائق‬ . • ‫في‬ ‫الراسب‬ ‫يعلق‬ 120uL ‫منظم‬ ‫محلول‬ ‫من‬ Buffer ( Tris/EDTA/glucose ) ‫جهاز‬ ‫في‬ ‫األنبوبة‬ ‫وترج‬ Vortex ً‫ا‬‫جيد‬ ( ‫ا‬ ‫تكتل‬ ‫عدم‬ ‫من‬ ‫للتأكد‬ ً‫ا‬‫جيد‬ ‫الراسب‬ ‫تعليق‬ ‫يجب‬ ‫لخاليا‬ ‫البكتيريه‬ .) Amal AlGhamdi- MIC251-2011 22
• ‫الراسب‬ ‫إلى‬ ‫يضاف‬ 8uL ‫محلول‬ ‫من‬ 2N ‫هيدروكسيد‬ ‫من‬ ‫الصوديوم‬ NaOH ‫و‬ 8uL ‫محلول‬ ‫من‬ 4% SDS ‫يرج‬ ‫ثم‬ ‫الرج‬ ‫جهاز‬ ‫استخدام‬ ‫بدون‬ ً‫ا‬‫جيد‬ ‫المزيج‬ vortex . • ‫مباشرة‬ ‫يضاف‬ 22uL ‫من‬ 3M ‫أسيتات‬ ‫محلول‬ ‫من‬ ‫الصوديوم‬ NaAc ‫درجة‬ ‫في‬ pH=6.0 . ً‫ا‬‫جيد‬ ‫المزيج‬ ‫ويرج‬ ‫الد‬ ‫المركزي‬ ‫بالطرد‬ ‫المزيج‬ ‫يرسب‬ ‫ثم‬ ‫الرج‬ ‫جهاز‬ ‫بدون‬ ‫قيق‬ ‫لمدة‬ 10 ‫دقائق‬ . ‫ا‬‫ا‬‫ثالث‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫خطوات‬ DNA ‫البكتيري‬ : Amal AlGhamdi- MIC251-2011 23
• ‫والتخلص‬ ‫الراسب‬ ‫سحب‬ ‫يتم‬ ‫الدقيقة‬ ‫الماصة‬ ‫باستخدام‬ ‫منه‬ . ‫يتم‬ ‫ينق‬ ‫ثم‬ ‫دقيقتين‬ ‫لمدة‬ ‫المركزي‬ ‫بالطرد‬ ‫الرائق‬ ‫ترسيب‬ ‫الرائق‬ ‫ل‬ ‫معقمة‬ ‫مركزي‬ ‫طرد‬ ‫أنبوبة‬ ‫إلى‬ . • ‫األنبوبة‬ ‫إلى‬ ‫يضاف‬ 2uL ‫من‬ 10ug/mL ‫النزيم‬ RNase ‫درجة‬ ‫في‬ ‫وتحضن‬ ‫بالحرارة‬ ‫المثبط‬ 37 ‫لمدة‬ ‫م‬ 10 ‫دقائق‬ . • ‫باستخدام‬ ‫مرتين‬ ‫الرائق‬ ‫يستخلص‬ 100uL ‫من‬ ‫الخليط‬ ‫من‬ ( ‫الفينول‬ : ‫الكلوروفورم‬ : ‫أيزوأميل‬ ‫كحول‬ .) • ‫يضاف‬ 1vol ‫إلى‬ ‫األيزوبروبانول‬ ‫من‬ ‫الشف‬ ‫العلوية‬ ‫الطبقة‬ ،‫افة‬ ‫لمدة‬ ‫ويترك‬ ‫الخليط‬ ‫يمزج‬ 5 ‫دقائق‬ . ‫ا‬‫ا‬‫ثالث‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫خطوات‬ DNA ‫البكتيري‬ : Amal AlGhamdi- MIC251-2011 24
• ‫لمدة‬ ‫المزيج‬ ‫يرسب‬ 5 ‫الفائق‬ ‫السرعة‬ ‫على‬ ‫دقائق‬ ‫ة‬ ‫الرائق‬ ‫من‬ ‫نتخلص‬ ‫ثم‬ ‫المركزي‬ ‫للطرد‬ . • ‫باستخدام‬ ‫مرتين‬ ‫الراسب‬ ‫يغسل‬ 200uL ‫من‬ ‫كحول‬ 70% Ethanol ‫وبعدها‬ ‫مره‬ ‫كل‬ ‫يطرد‬ ‫ثم‬ ‫ليجف‬ ‫الراسب‬ ‫يترك‬ . ‫ا‬‫ا‬‫ثالث‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫خطوات‬ DNA ‫البكتيري‬ : Amal AlGhamdi- MIC251-2011 25
‫الحم‬ ‫الستخدام‬ ‫المعقم‬ ‫المقطر‬ ‫الماء‬ ‫في‬ ‫الراسب‬ ‫يعلق‬ ‫ض‬ ‫وال‬ ‫كالتركيز‬ ‫التالية‬ ‫الخطوات‬ ‫في‬ ‫المعزول‬ ‫النووي‬ ‫تنقية‬ . ‫مالحظة‬ : ‫خ‬ ‫كل‬ ‫بعد‬ ‫المحلول‬ ‫في‬ ‫التغير‬ ‫تسجيل‬ ‫يجب‬ ‫طوة‬ . ‫ا‬‫ا‬‫ثالث‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫خطوات‬ DNA ‫لبكتيري‬ : Amal AlGhamdi- MIC251-2011 26
‫العمل‬ ‫اثناء‬ ‫هامة‬ ‫مالحظات‬ • ‫الرغوه‬ ‫ظهور‬ ‫لتجنب‬ ‫عنيفة‬ ‫بصورة‬ ‫الرج‬ ‫عدم‬ ‫على‬ ‫الحرص‬ . • ‫القلوية‬ ‫المادة‬ SDS ‫العالية‬ ‫الحرارة‬ ‫مع‬ 55-60 ˚ ‫الدهون‬ ‫إذابة‬ ‫إلى‬ ‫تؤدي‬ ‫م‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫وتحرر‬ ‫الخلوي‬ ‫الجدار‬ ‫في‬ . • ‫انزيم‬ ‫استخدام‬ ‫يمكن‬ proteinsae K ‫لتخلص‬ ً‫ا‬‫أيض‬ ‫العالية‬ ‫الحرارة‬ ‫مع‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫مع‬ ‫ترتبط‬ ‫قد‬ ‫بروتينات‬ ‫أي‬ ‫من‬ . • ‫الى‬ ‫الماصة‬ ‫ادخال‬ ‫طريق‬ ‫عن‬ ‫اضافته‬ ‫ويمكن‬ ‫الثلجي‬ ‫الكحول‬ ‫يضاف‬ ‫نهاية‬ ‫انب‬ ‫في‬ ‫الكحول‬ ‫إضافة‬ ‫أو‬ ،‫االنبوبة‬ ‫في‬ ‫تحميله‬ ‫ثم‬ ‫ومن‬ ‫االنبوبه‬ ‫معقمة‬ ‫وبة‬ ‫باس‬ ‫بماصة‬ ‫بالسكب‬ ‫ببطء‬ ‫إضافته‬ ‫أو‬ ، ‫اليها‬ ‫المحلول‬ ‫يضاف‬ ‫ثم‬ ‫تير‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 27
• ‫جميع‬ ‫بعكس‬ ‫الكحول‬ ‫في‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫يذوب‬ ‫ال‬ ‫مكونات‬ ‫البروتوبالزم‬ ‫الح‬ ‫تاركة‬ ‫الكحول‬ ‫في‬ ‫تذوب‬ ‫التي‬ ‫الخلوي‬ ‫مض‬ ‫راسب‬ ‫شكل‬ ‫في‬ ‫النووي‬ • ‫لمدة‬ ‫ليستقر‬ ‫المحلول‬ ‫ترك‬ ‫يجب‬ 2 - 3 ‫رج‬ ‫عدم‬ ‫ويجب‬ ‫دقائق‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫تركيب‬ ‫لرقة‬ ‫المرحلة‬ ‫هذه‬ ‫في‬ ‫األنبوبة‬ . • ‫ع‬ ‫الكحول‬ ‫طبقة‬ ‫في‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫ترسب‬ ‫مالحظة‬ ‫ويمكن‬ ‫لى‬ ‫لزجه‬ ‫بيضاء‬ ‫مادة‬ ‫هيئة‬ . • ‫من‬ ‫أعلى‬ ‫العالية‬ ‫الحرارة‬ ‫درجة‬ ‫عامل‬ ‫نستخدم‬ 60 ˚ ‫ال‬ ‫أن‬ ‫ليجب‬ ‫م‬ ‫عن‬ ‫المائي‬ ‫الحمام‬ ‫حرارة‬ ‫درجة‬ ‫تزيد‬ 70 ˚ ‫وتتغير‬ ‫يتكسر‬ ‫النه‬ ‫م‬ ‫عن‬ ‫الحرارة‬ ‫زادت‬ ‫اذا‬ ‫طبيعته‬ 80 ˚ ‫م‬ . ‫العمل‬ ‫اثناء‬ ‫هامة‬ ‫مالحظات‬ Amal AlGhamdi- MIC251-2011 28
1 - ‫الموجيه‬ ‫األطوال‬ ‫من‬ ‫كل‬ ‫عند‬ ‫االمتصاص‬ ‫درجة‬ ‫يحسب‬ ( ‫نانومتر‬ nm ) 230-240-250-260-270-280-290-300-310 2 - ‫المحلول‬ ‫عن‬ ‫والصادره‬ ‫الممتصة‬ ‫األشعة‬ ‫نسبة‬ ‫نسجل‬ . 3 - ‫الموجي‬ ‫األطول‬ ‫يمثل‬ ‫السيني‬ ‫محورين‬ ‫بين‬ ‫العالقة‬ ‫من‬ ‫منحنى‬ ‫عمل‬ ‫يتم‬ ‫ه‬ ‫الممتصة‬ ‫األشعة‬ ‫مقدار‬ ‫والصادي‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 29
3 - conversion factor: ‫التحويل‬ ‫معامل‬ = 1* OD 260 = 50 mg of DNA/mL 4 - ‫المعادلة‬ ‫في‬ ‫بالتعويض‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫تركيز‬ ‫درجة‬ ‫نحسب‬ : Conc. Of DNA (ug/ml) = 𝑂.𝐷.260×50×𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 1000 With dilution factor of 25 (i.e. 2ml in 48ml), this formula reduced to: mg DNA/mL = OD 260 x 1.25 Results: OD 260/OD 280 = 1.7-1.8 • ‫صالحه‬ ‫العينة‬ ‫تكون‬ ‫ال‬ ‫المدى‬ ‫هذا‬ ‫خارج‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫تركيز‬ ‫كان‬ ‫إذا‬ . • ‫البروتينات‬ ‫مثل‬ ‫شوائب‬ ‫أوجود‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫ذوبان‬ ‫عدم‬ ‫يعني‬ ‫وهذا‬ . • ‫الكحولي‬ ‫المخلوط‬ ‫باستخدام‬ ‫الترسيب‬ ‫إعادة‬ ‫يتم‬ ‫لذلك‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 30
Amal AlGhamdi- MIC251-2011 31
‫شكرا‬ Amal AlGhamdi- MIC251-2011 32

Recommended

6- Introduction to antibiotics .ppt treatment
6- Introduction to antibiotics .ppt treatment6- Introduction to antibiotics .ppt treatment
6- Introduction to antibiotics .ppt treatment
ssuser4d911a
 
Healthy_Village_Facilitator_s_Guide-Malaria (4).pdf
Healthy_Village_Facilitator_s_Guide-Malaria (4).pdfHealthy_Village_Facilitator_s_Guide-Malaria (4).pdf
Healthy_Village_Facilitator_s_Guide-Malaria (4).pdf
ssuser4d911a
 
case3-malaria-170527190738 (1).pdf leishmania
case3-malaria-170527190738 (1).pdf leishmaniacase3-malaria-170527190738 (1).pdf leishmania
case3-malaria-170527190738 (1).pdf leishmania
ssuser4d911a
 
malaria-180315092718.pdf parasitology zoology
malaria-180315092718.pdf parasitology zoologymalaria-180315092718.pdf parasitology zoology
malaria-180315092718.pdf parasitology zoology
ssuser4d911a
 
plasmodiumspp-230727053539-5ffdb01.5.pdf
plasmodiumspp-230727053539-5ffdb01.5.pdfplasmodiumspp-230727053539-5ffdb01.5.pdf
plasmodiumspp-230727053539-5ffdb01.5.pdf
ssuser4d911a
 
leishmaniasisv2-170117152603.pdf parasitology
leishmaniasisv2-170117152603.pdf parasitologyleishmaniasisv2-170117152603.pdf parasitology
leishmaniasisv2-170117152603.pdf parasitology
ssuser4d911a
 
23-HistopathologicalaspectsofCL.pdf leishmania
23-HistopathologicalaspectsofCL.pdf leishmania23-HistopathologicalaspectsofCL.pdf leishmania
23-HistopathologicalaspectsofCL.pdf leishmania
ssuser4d911a
 
wahidspaper1.pdf leishmania major in libya
wahidspaper1.pdf leishmania major in libyawahidspaper1.pdf leishmania major in libya
wahidspaper1.pdf leishmania major in libya
ssuser4d911a
 

Recommended

6- Introduction to antibiotics .ppt treatment
6- Introduction to antibiotics .ppt treatment6- Introduction to antibiotics .ppt treatment
6- Introduction to antibiotics .ppt treatment
ssuser4d911a
 
Healthy_Village_Facilitator_s_Guide-Malaria (4).pdf
Healthy_Village_Facilitator_s_Guide-Malaria (4).pdfHealthy_Village_Facilitator_s_Guide-Malaria (4).pdf
Healthy_Village_Facilitator_s_Guide-Malaria (4).pdf
ssuser4d911a
 
case3-malaria-170527190738 (1).pdf leishmania
case3-malaria-170527190738 (1).pdf leishmaniacase3-malaria-170527190738 (1).pdf leishmania
case3-malaria-170527190738 (1).pdf leishmania
ssuser4d911a
 
malaria-180315092718.pdf parasitology zoology
malaria-180315092718.pdf parasitology zoologymalaria-180315092718.pdf parasitology zoology
malaria-180315092718.pdf parasitology zoology
ssuser4d911a
 
plasmodiumspp-230727053539-5ffdb01.5.pdf
plasmodiumspp-230727053539-5ffdb01.5.pdfplasmodiumspp-230727053539-5ffdb01.5.pdf
plasmodiumspp-230727053539-5ffdb01.5.pdf
ssuser4d911a
 
leishmaniasisv2-170117152603.pdf parasitology
leishmaniasisv2-170117152603.pdf parasitologyleishmaniasisv2-170117152603.pdf parasitology
leishmaniasisv2-170117152603.pdf parasitology
ssuser4d911a
 
23-HistopathologicalaspectsofCL.pdf leishmania
23-HistopathologicalaspectsofCL.pdf leishmania23-HistopathologicalaspectsofCL.pdf leishmania
23-HistopathologicalaspectsofCL.pdf leishmania
ssuser4d911a
 
wahidspaper1.pdf leishmania major in libya
wahidspaper1.pdf leishmania major in libyawahidspaper1.pdf leishmania major in libya
wahidspaper1.pdf leishmania major in libya
ssuser4d911a
 
departmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptx
departmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptxdepartmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptx
departmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptx
ssuser4d911a
 
IntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitology
IntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitologyIntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitology
IntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitology
ssuser4d911a
 
10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria
10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria
10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria
ssuser4d911a
 
Blood parasites (1).ppt parasitology zoology
Blood parasites (1).ppt parasitology zoologyBlood parasites (1).ppt parasitology zoology
Blood parasites (1).ppt parasitology zoology
ssuser4d911a
 
10397072.ppt malaria parasitology zoology
10397072.ppt malaria parasitology zoology10397072.ppt malaria parasitology zoology
10397072.ppt malaria parasitology zoology
ssuser4d911a
 
speakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptx
speakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptxspeakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptx
speakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptx
ssuser4d911a
 
10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa
10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa
10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa
ssuser4d911a
 
malariaprevention-180605135302.pptx parasitology
malariaprevention-180605135302.pptx parasitologymalariaprevention-180605135302.pptx parasitology
malariaprevention-180605135302.pptx parasitology
ssuser4d911a
 
hemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptx
hemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptxhemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptx
hemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptx
ssuser4d911a
 
Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)
Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)
Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)
ssuser4d911a
 
6129093.ppt plasmodium parasite zoology.
6129093.ppt plasmodium parasite zoology.6129093.ppt plasmodium parasite zoology.
6129093.ppt plasmodium parasite zoology.
ssuser4d911a
 
10397072.ppt parasitology lucture zoology
10397072.ppt parasitology lucture zoology10397072.ppt parasitology lucture zoology
10397072.ppt parasitology lucture zoology
ssuser4d911a
 
10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture
10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture
10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture
ssuser4d911a
 
10040368.ppt parasitology lucture zoology
10040368.ppt parasitology lucture zoology10040368.ppt parasitology lucture zoology
10040368.ppt parasitology lucture zoology
ssuser4d911a
 
17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology
17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology
17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology
ssuser4d911a
 
طفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitology
طفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitologyطفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitology
طفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitology
ssuser4d911a
 
10- hemoflagellates (Trypsnosomiasis).ppt
10- hemoflagellates (Trypsnosomiasis).ppt10- hemoflagellates (Trypsnosomiasis).ppt
10- hemoflagellates (Trypsnosomiasis).ppt
ssuser4d911a
 
759735.ppt Trypanosoma presentation American
759735.ppt Trypanosoma presentation American759735.ppt Trypanosoma presentation American
759735.ppt Trypanosoma presentation American
ssuser4d911a
 
Malaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malarea
Malaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malareaMalaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malarea
Malaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malarea
ssuser4d911a
 
Cell_structure_function.ppt cytology bio
Cell_structure_function.ppt cytology bioCell_structure_function.ppt cytology bio
Cell_structure_function.ppt cytology bio
ssuser4d911a
 

More Related Content

More from ssuser4d911a

departmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptx
departmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptxdepartmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptx
departmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptx
ssuser4d911a
 
IntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitology
IntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitologyIntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitology
IntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitology
ssuser4d911a
 
10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria
10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria
10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria
ssuser4d911a
 
Blood parasites (1).ppt parasitology zoology
Blood parasites (1).ppt parasitology zoologyBlood parasites (1).ppt parasitology zoology
Blood parasites (1).ppt parasitology zoology
ssuser4d911a
 
speakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptx
speakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptxspeakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptx
speakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptx
ssuser4d911a
 
10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa
10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa
10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa
ssuser4d911a
 
malariaprevention-180605135302.pptx parasitology
malariaprevention-180605135302.pptx parasitologymalariaprevention-180605135302.pptx parasitology
malariaprevention-180605135302.pptx parasitology
ssuser4d911a
 
hemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptx
hemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptxhemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptx
hemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptx
ssuser4d911a
 
Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)
Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)
Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)
ssuser4d911a
 
6129093.ppt plasmodium parasite zoology.
6129093.ppt plasmodium parasite zoology.6129093.ppt plasmodium parasite zoology.
6129093.ppt plasmodium parasite zoology.
ssuser4d911a
 
10397072.ppt parasitology lucture zoology
10397072.ppt parasitology lucture zoology10397072.ppt parasitology lucture zoology
10397072.ppt parasitology lucture zoology
ssuser4d911a
 
10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture
10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture
10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture
ssuser4d911a
 
10040368.ppt parasitology lucture zoology
10040368.ppt parasitology lucture zoology10040368.ppt parasitology lucture zoology
10040368.ppt parasitology lucture zoology
ssuser4d911a
 
17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology
17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology
17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology
ssuser4d911a
 
طفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitology
طفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitologyطفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitology
طفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitology
ssuser4d911a
 
759735.ppt Trypanosoma presentation American
759735.ppt Trypanosoma presentation American759735.ppt Trypanosoma presentation American
759735.ppt Trypanosoma presentation American
ssuser4d911a
 
Malaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malarea
Malaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malareaMalaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malarea
Malaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malarea
ssuser4d911a
 
Cell_structure_function.ppt cytology bio
Cell_structure_function.ppt cytology bioCell_structure_function.ppt cytology bio
Cell_structure_function.ppt cytology bio
ssuser4d911a
 

More from ssuser4d911a (20)

departmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptx
departmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptxdepartmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptx
departmentofbiology-microsoftpowerpointpptx.pptx
 
IntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitology
IntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitologyIntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitology
IntroZooNotes.ppt zoology ppt parasitology
 
10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria
10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria
10397072.ppt parasitology zoology ppt malaria
 
Blood parasites (1).ppt parasitology zoology
Blood parasites (1).ppt parasitology zoologyBlood parasites (1).ppt parasitology zoology
Blood parasites (1).ppt parasitology zoology
 
10397072.ppt malaria parasitology zoology
10397072.ppt malaria parasitology zoology10397072.ppt malaria parasitology zoology
10397072.ppt malaria parasitology zoology
 
speakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptx
speakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptxspeakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptx
speakupafricaaccesssmcsbccandadvocacyfeb2017 (3).pptx
 
10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa
10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa
10559480.ppt parasitology zoology ppt Aa
 
malariaprevention-180605135302.pptx parasitology
malariaprevention-180605135302.pptx parasitologymalariaprevention-180605135302.pptx parasitology
malariaprevention-180605135302.pptx parasitology
 
hemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptx
hemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptxhemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptx
hemoflagellates trypanosomaibrahim 2017.pptx
 
Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)
Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)
Bangladesh.ppt parasitology ( malaria parasite)
 
6129093.ppt plasmodium parasite zoology.
6129093.ppt plasmodium parasite zoology.6129093.ppt plasmodium parasite zoology.
6129093.ppt plasmodium parasite zoology.
 
10397072.ppt parasitology lucture zoology
10397072.ppt parasitology lucture zoology10397072.ppt parasitology lucture zoology
10397072.ppt parasitology lucture zoology
 
10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture
10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture
10397072.ppt parasitology lucture parasitology lucture
 
10040368.ppt parasitology lucture zoology
10040368.ppt parasitology lucture zoology10040368.ppt parasitology lucture zoology
10040368.ppt parasitology lucture zoology
 
17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology
17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology
17596010.ppt parasitology lucture 1. zoology
 
طفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitology
طفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitologyطفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitology
طفيليات نظري محاضرة 4.pptx lucture parasitology
 
10- hemoflagellates (Trypsnosomiasis).ppt
10- hemoflagellates (Trypsnosomiasis).ppt10- hemoflagellates (Trypsnosomiasis).ppt
10- hemoflagellates (Trypsnosomiasis).ppt
 
759735.ppt Trypanosoma presentation American
759735.ppt Trypanosoma presentation American759735.ppt Trypanosoma presentation American
759735.ppt Trypanosoma presentation American
 
Malaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malarea
Malaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malareaMalaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malarea
Malaria 2019.pptx plamodium ovsle, falciprum, vivax, malarea
 
Cell_structure_function.ppt cytology bio
Cell_structure_function.ppt cytology bioCell_structure_function.ppt cytology bio
Cell_structure_function.ppt cytology bio
 

dwr_lmhlyl_fy_stkhls_dna (1).ppsx.. Isolation of DNA from microorganisms

  • 2. ‫ا‬‫ل‬‫أو‬ : ‫الستخالص‬ Extraction DNA : 1 - ‫تحليل‬ ‫الخاليا‬ Cell Lysis ‫وتحرير‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ : ‫تحويل‬ ‫الخلية‬ ‫إلى‬ ‫صورة‬ spheroplast ‫عن‬ ‫طريق‬ ‫هضم‬ ‫الجدار‬ ‫الخلوي‬ . ‫تتم‬ ‫هذه‬ ‫الخطوة‬ ‫باستخدام‬ ‫انزيمات‬ ‫هاضمة‬ ‫مثل‬ Lysozyme ‫أو‬ ‫المواد‬ ‫شديدة‬ ‫القلوية‬ Alkaline analysis ‫ويستخدم‬ ‫السكروز‬ ‫للحفاظ‬ ‫على‬ ‫الضغط‬ ‫السموزي‬ ‫المالئم‬ ‫لعدم‬ ‫انفجار‬ ‫الـ‬ spheroplast ‫من‬ ‫النفجار‬ . 2 - ‫التخلص‬ ‫من‬ ‫المكونات‬ ‫األخرى‬ ‫في‬ ‫الـ‬ spheroplast ‫مثل‬ ‫الجزيئات‬ ‫الكبرى‬ ‫وانسياب‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫ومحتويات‬ ‫الخاليا‬ . ‫ا‬‫ا‬‫ثاني‬ : ‫التنقية‬ DNA purification : ‫فصل‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ DNA ‫الكروموسومي‬ ‫عن‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫الريبوزي‬ RNA ‫والبالزميد‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 2
  • 3. ‫أوال‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫وتحرير‬ ‫الخلية‬ ‫تحليل‬ DNA : ‫زجاجي‬ ‫حبيبات‬ ‫أو‬ ‫المحللة‬ ‫اإلنزيمات‬ ‫باستخدام‬ ‫الخلية‬ ‫تحلل‬ ‫او‬ ‫ة‬ ‫المركزي‬ ‫الطرد‬ ‫أثناء‬ ‫في‬ ‫بلورية‬ . ‫اإلنزيم‬ ‫دور‬ Lysozymre : ‫لم‬ ‫الجليكوسيدية‬ ‫للرابطة‬ ‫المائي‬ ‫التحليل‬ ‫بتحفيز‬ ‫يقوم‬ ‫الجدار‬ ‫كونات‬ ‫الكربوهيدراتية‬ ( peptidoglycan ) ‫الغالف‬ ‫تحطيم‬ ‫وبالتالي‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫ويحرر‬ ‫الخارجي‬ DNA ‫مكونات‬ ‫من‬ ‫وغيره‬ ‫الخليه‬ . ‫المنظم‬ ‫المحلول‬ ‫دور‬ Buffer solution : ‫الـ‬ ‫على‬ ‫المحتوي‬ ‫محلول‬ ‫به‬ ‫المتواجد‬ ‫الوسط‬ ‫يكون‬ ‫أن‬ ‫بد‬ ‫ال‬ DNA ‫على‬ ‫يحتوي‬ ‫ملحي‬ ‫محلول‬ ،‫منظم‬ ‫محلول‬ ‫صورة‬ ‫في‬ EDTA . ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫تأين‬ ‫بسبب‬ DNA ‫أكثر‬ ‫فإنه‬ ‫سالبه‬ ‫لشحنه‬ ‫وحمله‬ ‫المقطر‬ ‫الماء‬ ‫في‬ ‫عنه‬ ‫الملحيه‬ ‫المحاليل‬ ‫في‬ ‫وذوبانا‬ ً‫ا‬‫ثبات‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 3
  • 4. ‫الـ‬ ‫أهمية‬ EDTA : 1 - ‫مثل‬ ‫الشحنه‬ ‫ثنائية‬ ‫الموجبة‬ ‫األيونات‬ ‫مع‬ ‫ترتبط‬ ( Cd+2, Mg+2, Mn+2 ) ‫ف‬ ‫األيونية‬ ‫الفوسفات‬ ‫مجموعات‬ ‫مع‬ ‫أمالح‬ ‫تكون‬ ‫قد‬ ‫التي‬ ‫ي‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ DNA . 2 - ‫النووي‬ ‫للحمض‬ ‫المحلل‬ ‫اإلنزيم‬ ‫تثبيط‬ deoxyribonuclease ‫المغنيسيوم‬ ‫أيونات‬ ‫إلى‬ ‫يحتاج‬ ‫ألنه‬ Mg+2 ‫المنجنيز‬ ‫أو‬ Mn+2 ‫لكي‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫تحليل‬ ‫في‬ ‫بوظيفته‬ ‫يقوم‬ DNA . • ‫القلوي‬ ‫الوسط‬ ( pH=8 ) ‫بين‬ ‫اإللكتروليتيه‬ ‫التفاعالت‬ ‫يقلل‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ DNA ‫عديدة‬ ‫واألمينات‬ ‫القلوية‬ ‫والهيستونات‬ ‫التكافؤ‬ . • ‫العالية‬ ‫القلوية‬ ( ‫درجة‬ pH ‫العالية‬ ) ‫انزيم‬ ‫نشاط‬ ‫من‬ ‫تقلل‬ nuclease ‫البروتين‬ ‫طبيعة‬ ‫وتغير‬ denature . • ‫ال‬ ‫بالحمض‬ ‫المرتبطة‬ ‫البروتينات‬ ‫فصل‬ ‫على‬ ‫تساعد‬ ‫كما‬ ‫نووي‬ DNA ‫الهيس‬ ‫للبروتينات‬ ‫الموجبة‬ ‫والشحنة‬ ‫القلوية‬ ‫بزيدة‬ ‫تونيه‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 4
  • 5. • ً‫ا‬‫ثاني‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫معقد‬ ‫فصل‬ DNA ‫والبروتين‬ : ‫التفاع‬ ‫لتعطيل‬ ‫المرحلة‬ ‫هذه‬ ‫في‬ ‫عادة‬ ‫المنظفات‬ ‫تستخدم‬ ‫الت‬ ‫السا‬ ‫الشحنة‬ ‫مع‬ ‫الشحنه‬ ‫موجبة‬ ‫الهستونات‬ ‫بين‬ ‫األيونية‬ ‫لبة‬ ‫النووي‬ ‫للحمض‬ DNA . ‫عادة‬ ‫يستخدم‬ sodium dodecyl sulphate ( SDS :) 1 - ‫صفة‬ ‫ويعطيها‬ ‫البروتينات‬ ‫مع‬ ‫يرتبط‬ ‫متأين‬ ‫منظف‬ ‫شديدة‬ ‫األيونية‬ . 2 - ‫للـ‬ ‫المحللة‬ ‫لإلنزيمات‬ ‫متلف‬ DNA ( deoxyribonucleases ) ‫البروتينات‬ ‫من‬ ‫وغيره‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 5
  • 6. • ‫األمالح‬ ‫من‬ ‫العالية‬ ‫التراكيز‬ ( ‫مثل‬ NaCl ‫وغيره‬ ) ‫تضاف‬ ‫بالح‬ ‫المرتبطة‬ ‫للبروتينات‬ ‫التام‬ ‫الفصل‬ ‫من‬ ‫للتأكد‬ ‫النووي‬ ‫مض‬ DNA ‫الشحنة‬ ‫موجبة‬ ‫األمينات‬ ‫مع‬ ‫الرابطة‬ ‫وتزيل‬ ‫عنه‬ . • ‫الحمض‬ ‫بين‬ ‫األيوني‬ ‫االرتباط‬ ‫قوة‬ ‫األمالح‬ ‫تضعف‬ ‫حيث‬ ‫الشحنه‬ ‫موجبة‬ ‫والمركبات‬ ‫النووي‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 6
  • 7. ‫ثالثا‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫فصل‬ DNA ‫الخلية‬ ‫مكونات‬ ‫من‬ ‫غيره‬ ‫عن‬ ‫الذائبة‬ ‫البروتي‬ ‫من‬ ‫المحلول‬ ‫خلو‬ ‫من‬ ‫التأكد‬ ‫يجب‬ ،‫المرحلة‬ ‫هذه‬ ‫في‬ ‫نات‬ ‫الكحول‬ ‫مع‬ ‫الكلوروفورم‬ ‫خليط‬ ‫باستخدام‬ ‫وذلك‬ isoamyl alcohol ‫المركزي‬ ‫الطرد‬ ‫ثم‬ . ‫تظهر‬ ‫ذلك‬ ‫بعد‬ 3 ‫طبقات‬ : ‫طبقة‬ ‫وبينهما‬ ‫عضوية‬ ‫سفلى‬ ‫وطبقة‬ ،‫سائلة‬ ‫عليا‬ ‫طبقة‬ ‫وسطية‬ ‫الموه‬ ‫البروتين‬ ‫من‬ ‫منضغط‬ ‫شريط‬ ‫تمثل‬ . ‫للبروتين‬ ‫سطحي‬ ‫تشويه‬ ‫الكلوروفورم‬ ‫يسبب‬ ‫والكحول‬ isoamyl alcohol ‫ثبات‬ ‫على‬ ‫ويساعد‬ ‫الرغوه‬ ‫يقلل‬ ‫بي‬ ‫وتفصل‬ ‫البروتين‬ ‫على‬ ‫المحتوية‬ ‫الفاصلة‬ ‫الطبقة‬ ‫الطبقتين‬ ‫ن‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 7
  • 8. • ‫فصل‬ ‫ويتم‬ ‫النووية‬ ‫األحماض‬ ‫على‬ ‫العليا‬ ‫الطبقة‬ ‫تحتوي‬ ‫ويتم‬ ‫ها‬ ‫اإليثانول‬ ‫كحول‬ ‫باستخدام‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫ترسيب‬ . • ‫النووي‬ ‫للحمض‬ ‫المتأينة‬ ‫الطبيعة‬ ‫بسبب‬ DNA ‫قابل‬ ‫غير‬ ‫يصبح‬ ‫القطبية‬ ‫منخفض‬ ‫عضوي‬ ‫وسط‬ ‫في‬ ‫تواجد‬ ‫إذا‬ ‫للذوبان‬ . • ‫بلف‬ ‫جمعه‬ ‫ويمكن‬ ‫الشكل‬ ‫خيطي‬ ‫راسب‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫يكون‬ ‫ه‬ ‫زجاجية‬ ‫عصا‬ ‫على‬ . • ‫والحمض‬ ‫بالبروتينات‬ ‫المعزول‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫يتلوث‬ ‫قد‬ ‫النووي‬ RNA . • ‫المتر‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫بإذابة‬ ‫البروتين‬ ‫من‬ ‫التخلص‬ ‫يمكن‬ ‫في‬ ‫سب‬ ‫والكحول‬ ‫الكلوروفورم‬ ‫خليط‬ ‫استخدام‬ ‫وإعادة‬ ‫ملحي‬ ‫وسط‬ isoamyl alcohol ‫الطبقة‬ ‫في‬ ‫بروتين‬ ‫اي‬ ‫يبقى‬ ‫ال‬ ‫حتى‬ ‫الوسطى‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 8
  • 9. • ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫يترسب‬ ‫ال‬ RNA ‫الـ‬ ‫مع‬ DNA ‫قد‬ ‫ولكنه‬ ‫النووي‬ ‫للحمض‬ ‫ملوثة‬ ‫صورة‬ ‫في‬ ‫يتواجد‬ DNA . • ‫له‬ ‫المحلل‬ ‫اإلنزيم‬ ‫باستخدام‬ ‫منه‬ ‫التخلص‬ ‫يمكن‬ Ribonuclease ( RNase ) ‫البروتين‬ ‫من‬ ‫التخلص‬ ‫بعد‬ . • ‫الكحول‬ ‫يستخدم‬ ‫قد‬ isoprobanol ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫لترسيب‬ DNA ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ً‫ا‬‫تارك‬ RNA ‫المحلول‬ ‫في‬ . • ‫النووي‬ ‫والحمض‬ ‫البروتين‬ ‫فصل‬ ‫خطوات‬ ‫إعادة‬ ‫يمكن‬ RNA ‫نووي‬ ‫حمض‬ ‫على‬ ‫للحصول‬ ‫مرات‬ ‫عدة‬ DNA ‫النقاوة‬ ‫عالي‬ . • ‫فصل‬ ‫يتم‬ ‫أن‬ ‫يفترض‬ ‫الطريقة‬ ‫بهذه‬ 50 % ‫الكلي‬ ‫المحتوى‬ ‫من‬ ‫النووي‬ ‫للحمض‬ DNA ‫المحصول‬ ‫ممتوسط‬ ،‫الخلية‬ ‫في‬ ‫يساوي‬ 1 - 2 ‫للخاليا‬ ‫الرطب‬ ‫الوزن‬ ‫من‬ ‫جم‬ ‫لكل‬ ‫ملجم‬ ‫البكتيرية‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 9
  • 10. ‫إ‬ ‫حتياطات‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫عملية‬ ‫أثناء‬ ‫هامة‬ DNA 1 - ‫تلوث‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫بإنزيمات‬ ‫تحلل‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ DNase ‫هو‬ ‫الملوث‬ ‫األساسي‬ ‫لتحضيرات‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫النقي‬ . ‫لذلك‬ ‫ي‬ ‫جب‬ ‫استخدام‬ ‫خاليا‬ ‫طازجه‬ ‫في‬ ‫الطور‬ ‫اللوغاريتمي‬ ‫للتقليل‬ ‫من‬ ‫تحل‬ ‫ل‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫وتكسره‬ ‫ا‬‫ا‬‫انزيمي‬ . 2 - ‫تجنب‬ Shearing of DNA : ‫يجب‬ ‫تجنب‬ ‫تحلل‬ ‫وتكسر‬ ‫أشرطة‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫الكروموسومي‬ ‫الطويلة‬ ‫ذات‬ ‫األوزان‬ ‫الجزيئية‬ ‫الثقيلة‬ ‫بسبب‬ ‫القوة‬ ‫الميكانيكية‬ . 3 - ‫تجنب‬ ‫التلوث‬ ‫بالمحاليل‬ ‫الكيميائية‬ ‫المستخدمه‬ ‫في‬ ‫تنق‬ ‫ية‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ : ‫مثل‬ ‫التلوث‬ ‫بالفينول‬ ،‫والكلوروفورم‬ ‫مما‬ ‫يؤثر‬ ‫على‬ ‫ف‬ ‫صل‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫النقي‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 10
  • 11. 4 - ‫يجب‬ ‫تجنب‬ ‫زيادة‬ ‫تركيز‬ ‫الخاليا‬ ‫للعينة‬ ‫التي‬ ‫يستخلص‬ ‫منها‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫لتجنب‬ ‫زيادة‬ ‫تركيز‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫أو‬ ‫تكسر‬ ‫األشرطة‬ ‫ذات‬ ‫األوزان‬ ‫الجزي‬ ‫ئية‬ ‫العالية‬ . 5 - ‫يجب‬ ‫التأكد‬ ‫من‬ ‫فصل‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫عن‬ ‫البروتينات‬ ‫والمواد‬ ‫الكيميا‬ ‫ئية‬ ‫الملوثة‬ . 6 - ‫يجب‬ ‫ترسيب‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ DNA ‫باستخدام‬ ‫اإليثانول‬ ، ‫األيزوبروبانول‬ ، ‫البولي‬ ‫إيثلين‬ ‫جليكول‬ PEG . 7 - ‫غسيل‬ ‫وإذابة‬ ‫الحمض‬ ‫النووي‬ ‫باستخدام‬ ‫المحاليل‬ ‫المنظمة‬ ‫المناسبة‬ . ‫إ‬ ‫حتياطات‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫عملية‬ ‫أثناء‬ ‫هامة‬ DNA Amal AlGhamdi- MIC251-2011 11
  • 12. • ‫الخ‬ ‫الجينات‬ ‫جميع‬ ‫على‬ ‫المحتوية‬ ‫الوراثية‬ ‫الخريطة‬ ‫تحديد‬ ‫اصة‬ ‫الدقيق‬ ‫الحي‬ ‫بالكائن‬ . • ‫القوا‬ ‫وتتابع‬ ‫الجزيئي‬ ‫تركيبه‬ ‫في‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫يحمل‬ ‫عد‬ ‫جينا‬ ‫صورة‬ ‫في‬ ‫الوراثية‬ ‫المعلومات‬ ‫جميع‬ ‫النيتروجينيه‬ ‫ت‬ . • ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫فصل‬ ‫عند‬ DNA ‫نسبة‬ ‫معرفة‬ ‫يمكن‬ ‫للكائنات‬ ‫السيتوسين‬ ‫إلى‬ ‫الجوانين‬ G:C % ‫الحي‬ ‫الكائن‬ ‫تعريف‬ ‫وبالتالي‬ ‫يتبعها‬ ‫التي‬ ‫المملكة‬ ‫ومعرفة‬ . • ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخدام‬ DNA ‫الحيوية‬ ‫التقنيه‬ ‫تجارب‬ ‫في‬ Biotechnology : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫مع‬ ‫معينة‬ ‫جينات‬ ‫ربط‬ ‫مثل‬ DNA ‫البروتي‬ ‫المواد‬ ‫بعض‬ ‫انتاج‬ ‫عمليات‬ ‫في‬ ‫للبكتيريا‬ ‫أو‬ ‫نيه‬ ‫مجال‬ ‫وفي‬ ‫الدوائية‬ ‫المجالت‬ ‫في‬ Gene therapy . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 12
  • 13. • ‫التجربة‬ ‫من‬ ‫الغرض‬ : ‫الحمض‬ ‫على‬ ‫الحصول‬ ‫للبكتيريا‬ ‫الكرموسومي‬ ‫النووي‬ ‫بصور‬ ‫نقيه‬ ‫ة‬ . • ‫األدوات‬ : 1 - ‫بيئة‬ Luria Bertani ( LB ) ‫سائلة‬ . 2 - ‫بكتيريا‬ ‫من‬ ‫نقية‬ ‫عزلة‬ E. Coli . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 13
  • 14. 3 - ‫منظم‬ ‫محلول‬ Buffer ( Tris/EDTA/glucose ) ‫له‬ ‫ويرمز‬ ALS-I . 4 - 2 ‫الصوديوم‬ ‫هيدروكسيد‬ ‫عياري‬ 2 N NaOH . 5 - 4 % ‫محلول‬ ‫من‬ SDS ( Sodium dodecyl sulphate .) 6 - 3 ‫الصوديوم‬ ‫أسيتات‬ ‫مولر‬ 3 M Sodium Acetate pH=6.0 . 7 - ‫خليط‬ ‫محلول‬ ( phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol ) 25:24:1 8 - ‫كحول‬ Isoprpanol . 9 - ‫كحول‬ 70% Ethanol . 10 - ‫األيونات‬ ‫منزوع‬ ‫مقطر‬ ‫ماء‬ Distilled deionized water ( DDW ) . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 14
  • 15. ‫تابع‬ / ‫األدوات‬ : 11 - ‫غطاء‬ ‫ذات‬ ‫معقمة‬ ‫بالستيكية‬ ‫أنابيب‬ Eppendorf tubes ( 1.5-2 ml .) 13 - ‫الكترونيه‬ ‫دقيقة‬ ‫ماصات‬ Electromicropipett ‫األحجام‬ ‫مختلفة‬ ( (2-20µl, 10-100µl, 100-1000µl . 14 - ‫األلكترونية‬ ‫الماصات‬ ‫نهايات‬ . • Tips with different size 15 - ‫حوامل‬ ‫للألنابيب‬ . • (Racks for tube) 16 - ‫الماصات‬ ‫لنهايات‬ ‫حوامل‬ Quarts cuvettes . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 15
  • 16. ‫تابع‬ / ‫األدوات‬ : 14 - ‫الرج‬ ‫جهاز‬ (Vortex ) . 15 - ‫جهاز‬ ‫الضوئي‬ ‫الطيف‬ ‫تحليل‬ (Spectrophotometer) . 16 - ‫دقيق‬ ‫مركزي‬ ‫طرد‬ ‫جهاز‬ Microcentrifuge . 16 - ‫المستهلكات‬ ‫من‬ ‫للتخلص‬ ‫علبة‬ Biohazard Container 17 - ‫المستهلكات‬ ‫من‬ ‫للتخلص‬ ‫أكياس‬ Biohazard Bags Amal AlGhamdi- MIC251-2011 16
  • 17. ‫ا‬‫ل‬‫أو‬ : ‫الستخالص‬ ‫في‬ ‫المستخدمه‬ ‫المحاليل‬ ‫تحضير‬ : 1 - ‫تحضير‬ ‫المنظمة‬ ‫المحاليل‬ Buffers 1 - ‫محلول‬ ALS-I : : ‫من‬ ‫يتكون‬ 2.5 ml of Tris HCl (stock: 1M, pH 8) 2.5 ml of EDTA (stock: 0.5M, pH 8) Glucose 0.9 gm of ‫إلى‬ ‫يضاف‬ 100 ‫مقطر‬ ‫ماء‬ ‫مل‬ DDW ‫درجة‬ ‫عند‬ ‫ويحفظ‬ ، ‫حرارة‬ 4̊ ‫م‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 19
  • 18. ‫ا‬‫ا‬‫ثالث‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫خطوات‬ DNA ‫البكتيري‬ : • ‫يلقح‬ 5 ‫بيئة‬ ‫من‬ ‫مل‬ LB ‫بكتيريا‬ ‫من‬ ‫نقي‬ ‫بلقاح‬ E. coli ‫وتحضن‬ ‫لمدة‬ 12 - 24 ‫عند‬ ‫ساعه‬ 37 ˚ ‫م‬ . • ‫بيئة‬ ‫بأنبوبة‬ ‫ونحتقظ‬ LB ً‫ا‬‫أيض‬ ‫وتحضن‬ ‫تلقيح‬ ‫بدون‬ . • ‫ينقل‬ 1.5 ‫دقيقة‬ ‫مركزي‬ ‫طرد‬ ‫أنبوبة‬ ‫إلى‬ ‫المزرعة‬ ‫من‬ ‫مل‬ microcentrifuge ‫الر‬ ‫من‬ ‫نتخلص‬ ‫ثم‬ ‫دقيقتين‬ ‫لمدة‬ ‫ويطرد‬ ‫ائق‬ . • ‫في‬ ‫الراسب‬ ‫يعلق‬ 120uL ‫منظم‬ ‫محلول‬ ‫من‬ Buffer ( Tris/EDTA/glucose ) ‫جهاز‬ ‫في‬ ‫األنبوبة‬ ‫وترج‬ Vortex ً‫ا‬‫جيد‬ ( ‫ا‬ ‫تكتل‬ ‫عدم‬ ‫من‬ ‫للتأكد‬ ً‫ا‬‫جيد‬ ‫الراسب‬ ‫تعليق‬ ‫يجب‬ ‫لخاليا‬ ‫البكتيريه‬ .) Amal AlGhamdi- MIC251-2011 22
  • 19. • ‫الراسب‬ ‫إلى‬ ‫يضاف‬ 8uL ‫محلول‬ ‫من‬ 2N ‫هيدروكسيد‬ ‫من‬ ‫الصوديوم‬ NaOH ‫و‬ 8uL ‫محلول‬ ‫من‬ 4% SDS ‫يرج‬ ‫ثم‬ ‫الرج‬ ‫جهاز‬ ‫استخدام‬ ‫بدون‬ ً‫ا‬‫جيد‬ ‫المزيج‬ vortex . • ‫مباشرة‬ ‫يضاف‬ 22uL ‫من‬ 3M ‫أسيتات‬ ‫محلول‬ ‫من‬ ‫الصوديوم‬ NaAc ‫درجة‬ ‫في‬ pH=6.0 . ً‫ا‬‫جيد‬ ‫المزيج‬ ‫ويرج‬ ‫الد‬ ‫المركزي‬ ‫بالطرد‬ ‫المزيج‬ ‫يرسب‬ ‫ثم‬ ‫الرج‬ ‫جهاز‬ ‫بدون‬ ‫قيق‬ ‫لمدة‬ 10 ‫دقائق‬ . ‫ا‬‫ا‬‫ثالث‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫خطوات‬ DNA ‫البكتيري‬ : Amal AlGhamdi- MIC251-2011 23
  • 20. • ‫والتخلص‬ ‫الراسب‬ ‫سحب‬ ‫يتم‬ ‫الدقيقة‬ ‫الماصة‬ ‫باستخدام‬ ‫منه‬ . ‫يتم‬ ‫ينق‬ ‫ثم‬ ‫دقيقتين‬ ‫لمدة‬ ‫المركزي‬ ‫بالطرد‬ ‫الرائق‬ ‫ترسيب‬ ‫الرائق‬ ‫ل‬ ‫معقمة‬ ‫مركزي‬ ‫طرد‬ ‫أنبوبة‬ ‫إلى‬ . • ‫األنبوبة‬ ‫إلى‬ ‫يضاف‬ 2uL ‫من‬ 10ug/mL ‫النزيم‬ RNase ‫درجة‬ ‫في‬ ‫وتحضن‬ ‫بالحرارة‬ ‫المثبط‬ 37 ‫لمدة‬ ‫م‬ 10 ‫دقائق‬ . • ‫باستخدام‬ ‫مرتين‬ ‫الرائق‬ ‫يستخلص‬ 100uL ‫من‬ ‫الخليط‬ ‫من‬ ( ‫الفينول‬ : ‫الكلوروفورم‬ : ‫أيزوأميل‬ ‫كحول‬ .) • ‫يضاف‬ 1vol ‫إلى‬ ‫األيزوبروبانول‬ ‫من‬ ‫الشف‬ ‫العلوية‬ ‫الطبقة‬ ،‫افة‬ ‫لمدة‬ ‫ويترك‬ ‫الخليط‬ ‫يمزج‬ 5 ‫دقائق‬ . ‫ا‬‫ا‬‫ثالث‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫خطوات‬ DNA ‫البكتيري‬ : Amal AlGhamdi- MIC251-2011 24
  • 21. • ‫لمدة‬ ‫المزيج‬ ‫يرسب‬ 5 ‫الفائق‬ ‫السرعة‬ ‫على‬ ‫دقائق‬ ‫ة‬ ‫الرائق‬ ‫من‬ ‫نتخلص‬ ‫ثم‬ ‫المركزي‬ ‫للطرد‬ . • ‫باستخدام‬ ‫مرتين‬ ‫الراسب‬ ‫يغسل‬ 200uL ‫من‬ ‫كحول‬ 70% Ethanol ‫وبعدها‬ ‫مره‬ ‫كل‬ ‫يطرد‬ ‫ثم‬ ‫ليجف‬ ‫الراسب‬ ‫يترك‬ . ‫ا‬‫ا‬‫ثالث‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫خطوات‬ DNA ‫البكتيري‬ : Amal AlGhamdi- MIC251-2011 25
  • 22. ‫الحم‬ ‫الستخدام‬ ‫المعقم‬ ‫المقطر‬ ‫الماء‬ ‫في‬ ‫الراسب‬ ‫يعلق‬ ‫ض‬ ‫وال‬ ‫كالتركيز‬ ‫التالية‬ ‫الخطوات‬ ‫في‬ ‫المعزول‬ ‫النووي‬ ‫تنقية‬ . ‫مالحظة‬ : ‫خ‬ ‫كل‬ ‫بعد‬ ‫المحلول‬ ‫في‬ ‫التغير‬ ‫تسجيل‬ ‫يجب‬ ‫طوة‬ . ‫ا‬‫ا‬‫ثالث‬ : ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫استخالص‬ ‫خطوات‬ DNA ‫لبكتيري‬ : Amal AlGhamdi- MIC251-2011 26
  • 23. ‫العمل‬ ‫اثناء‬ ‫هامة‬ ‫مالحظات‬ • ‫الرغوه‬ ‫ظهور‬ ‫لتجنب‬ ‫عنيفة‬ ‫بصورة‬ ‫الرج‬ ‫عدم‬ ‫على‬ ‫الحرص‬ . • ‫القلوية‬ ‫المادة‬ SDS ‫العالية‬ ‫الحرارة‬ ‫مع‬ 55-60 ˚ ‫الدهون‬ ‫إذابة‬ ‫إلى‬ ‫تؤدي‬ ‫م‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫وتحرر‬ ‫الخلوي‬ ‫الجدار‬ ‫في‬ . • ‫انزيم‬ ‫استخدام‬ ‫يمكن‬ proteinsae K ‫لتخلص‬ ً‫ا‬‫أيض‬ ‫العالية‬ ‫الحرارة‬ ‫مع‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫مع‬ ‫ترتبط‬ ‫قد‬ ‫بروتينات‬ ‫أي‬ ‫من‬ . • ‫الى‬ ‫الماصة‬ ‫ادخال‬ ‫طريق‬ ‫عن‬ ‫اضافته‬ ‫ويمكن‬ ‫الثلجي‬ ‫الكحول‬ ‫يضاف‬ ‫نهاية‬ ‫انب‬ ‫في‬ ‫الكحول‬ ‫إضافة‬ ‫أو‬ ،‫االنبوبة‬ ‫في‬ ‫تحميله‬ ‫ثم‬ ‫ومن‬ ‫االنبوبه‬ ‫معقمة‬ ‫وبة‬ ‫باس‬ ‫بماصة‬ ‫بالسكب‬ ‫ببطء‬ ‫إضافته‬ ‫أو‬ ، ‫اليها‬ ‫المحلول‬ ‫يضاف‬ ‫ثم‬ ‫تير‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 27
  • 24. • ‫جميع‬ ‫بعكس‬ ‫الكحول‬ ‫في‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫يذوب‬ ‫ال‬ ‫مكونات‬ ‫البروتوبالزم‬ ‫الح‬ ‫تاركة‬ ‫الكحول‬ ‫في‬ ‫تذوب‬ ‫التي‬ ‫الخلوي‬ ‫مض‬ ‫راسب‬ ‫شكل‬ ‫في‬ ‫النووي‬ • ‫لمدة‬ ‫ليستقر‬ ‫المحلول‬ ‫ترك‬ ‫يجب‬ 2 - 3 ‫رج‬ ‫عدم‬ ‫ويجب‬ ‫دقائق‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫تركيب‬ ‫لرقة‬ ‫المرحلة‬ ‫هذه‬ ‫في‬ ‫األنبوبة‬ . • ‫ع‬ ‫الكحول‬ ‫طبقة‬ ‫في‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫ترسب‬ ‫مالحظة‬ ‫ويمكن‬ ‫لى‬ ‫لزجه‬ ‫بيضاء‬ ‫مادة‬ ‫هيئة‬ . • ‫من‬ ‫أعلى‬ ‫العالية‬ ‫الحرارة‬ ‫درجة‬ ‫عامل‬ ‫نستخدم‬ 60 ˚ ‫ال‬ ‫أن‬ ‫ليجب‬ ‫م‬ ‫عن‬ ‫المائي‬ ‫الحمام‬ ‫حرارة‬ ‫درجة‬ ‫تزيد‬ 70 ˚ ‫وتتغير‬ ‫يتكسر‬ ‫النه‬ ‫م‬ ‫عن‬ ‫الحرارة‬ ‫زادت‬ ‫اذا‬ ‫طبيعته‬ 80 ˚ ‫م‬ . ‫العمل‬ ‫اثناء‬ ‫هامة‬ ‫مالحظات‬ Amal AlGhamdi- MIC251-2011 28
  • 25. 1 - ‫الموجيه‬ ‫األطوال‬ ‫من‬ ‫كل‬ ‫عند‬ ‫االمتصاص‬ ‫درجة‬ ‫يحسب‬ ( ‫نانومتر‬ nm ) 230-240-250-260-270-280-290-300-310 2 - ‫المحلول‬ ‫عن‬ ‫والصادره‬ ‫الممتصة‬ ‫األشعة‬ ‫نسبة‬ ‫نسجل‬ . 3 - ‫الموجي‬ ‫األطول‬ ‫يمثل‬ ‫السيني‬ ‫محورين‬ ‫بين‬ ‫العالقة‬ ‫من‬ ‫منحنى‬ ‫عمل‬ ‫يتم‬ ‫ه‬ ‫الممتصة‬ ‫األشعة‬ ‫مقدار‬ ‫والصادي‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 29
  • 26. 3 - conversion factor: ‫التحويل‬ ‫معامل‬ = 1* OD 260 = 50 mg of DNA/mL 4 - ‫المعادلة‬ ‫في‬ ‫بالتعويض‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫تركيز‬ ‫درجة‬ ‫نحسب‬ : Conc. Of DNA (ug/ml) = 𝑂.𝐷.260×50×𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 1000 With dilution factor of 25 (i.e. 2ml in 48ml), this formula reduced to: mg DNA/mL = OD 260 x 1.25 Results: OD 260/OD 280 = 1.7-1.8 • ‫صالحه‬ ‫العينة‬ ‫تكون‬ ‫ال‬ ‫المدى‬ ‫هذا‬ ‫خارج‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫تركيز‬ ‫كان‬ ‫إذا‬ . • ‫البروتينات‬ ‫مثل‬ ‫شوائب‬ ‫أوجود‬ ‫النووي‬ ‫الحمض‬ ‫ذوبان‬ ‫عدم‬ ‫يعني‬ ‫وهذا‬ . • ‫الكحولي‬ ‫المخلوط‬ ‫باستخدام‬ ‫الترسيب‬ ‫إعادة‬ ‫يتم‬ ‫لذلك‬ . Amal AlGhamdi- MIC251-2011 30