该文档详细介绍了分光光度分析和比色分析的原理、方法及应用。文中涵盖了比尔定律、光谱特性、化学相互作用及噪声对分析结果的影响，并讨论了如何通过标准曲线进行分析。最后，文档还提及了不同类型的分光光度计以及荧光光谱和比色反应的必要条件。

1. 第三章 比色分析和分光光度分析 主讲教师：梁萌

2. 内容提要 分光光度分析的原理及方法 比色分析的原理及方法 分光光度分析及比色分析方法的应用

3. 第一节 分光光度分析的原理及方法

4. 一、分光光度分析的概念 分光光度分析研究电磁辐射与化合物的相互作用，是生命科学中最常用的分析技术之一 用途 测定新化合物的结构 鉴别特定化合物 测定特定化合物的浓度和数量 测定某一种特定酶的活性

5. 二、分光光度分析的原理 分子或原子在光子的激发下会由一个能态跃迁到更高的能态，从而产生光的吸收 电子从高能态回到低能态时有两种不同的情况 通过非辐射过程（如热运动） 通过发射光子 特定分子不同能态间的能量差取决于特定化合物的电子结构，而不同分子具有不同的电子态，因此分子对光的吸收是分子的电子结构和光波长的函数

6. 光谱谱图 线性光谱 当所有的分子或原子具有相同的能级时 多点曲线光谱 当分子溶解在溶剂（如水）中时，它们相对于入射光存在大量不同的取向，在每一个电子能级上又具有很多可能的震动模式，这些差异影响激发电子所需的能量，导致量子化的能量差异扩大

7. 透光率与吸光度 透光率 T 光路上有样品时监测器在给定波长所测得的光强与光路上没有样品时所测得的光强的比值 吸光度 A 溶液透光率的负对数

8. 三、比尔定律（朗伯 - 比尔定律） 对给定波长的光的吸光度与光路中吸光分子的数目呈正比，因为光路中分子的数目时分析物浓度和光径长度的直接函数，因此溶液的吸光度与这些变量呈正比。即：吸光度与吸光样品的浓度和吸收溶液的光径（ l ）以及一个常数呈正比。 如果浓度以 g/L 表示，则常数为吸收系数 α ；如果浓度以 mol/L 表示，则常数为摩尔吸收系数 ε

9. （一）吸收系数 摩尔吸收系数一般指吸收峰所在波长处的摩尔吸收系数，需要指明所用波长 最大吸收波长（ λ max ） 在最大吸收波长处有最大摩尔吸收系数，因此分光光度测定在 λ max 最灵敏 如果分析物浓度高出 λ max 吸光度的线性范围，在低摩尔吸收系数的波长处测定标准曲线可获得好的线性标准曲线

10. （二）线性 比尔定律只在方法的线性范围内才有效 获得线性的方法 稀释 原始浓度＝稀释后的浓度 × 稀释因子 缩短光径 使用 λ max 之外的波长

11. （三）比尔定律的假设 所有吸光度的测定是在澄清溶液中进行（没有混浊）； 所有检测光线均通过样品溶液（没有杂散光）； 在溶液中每一个组分均有独立的光吸收，溶液中个化合物之间没有化学相互作用（没有化学相互作用）； 在吸光度测定期间，光源的输入和检测器的响应均是稳定的（没有噪声）； 没有通过发光导致的电子激发态的损失（没有荧光）。

12. （四）混浊的影响 溶液混浊的原因 其中含有不同折射率的细微的分散多元相 对吸光度的影响 散射光不能到达检测器，造成吸光度错误增加 散射光的强度 取决于微粒的数量和大小以及所用光的波长 短波长光的散射大于长波长光

13. 比浊法与浊度测定法 如果样品为均匀粒子的悬浮液，则可用光散射法测定这些粒子的浓度 比浊法 检测直接通过混浊溶液的光线，即检测透射光和前向散射光 浊度测定法 测定与入射光呈一定角度的散射光，所采用的角度可从 75 ° 到 135 ° ，一般为 90 °

14. 比浊法 散射光与浓度的关系与比尔定律相似： 其中的浊度测定吸收系数 α ’ 是粒子大小、散射光波长和所用仪器的函数

15. 浊度测定法 散射光的强度与粒子浓度成正比： 常数 k ’ 是粒子大小、散射光波长和所用仪器的函数

16. 散射光应用注意事项 每次分析进行校准 测定波长的选定 不能被溶液中任何组分吸收 一般采用 600nm 用于估计液体培养基中微生物的浓度时，必须采用其他的方法确定光散射与培养基中特定微生物的细胞密度间的关系

17. （五）杂散光 如果达到检测器的光没有通过样品溶液，则所测定的吸光度会错误的偏低 溶液的吸光度越高则杂散光的影响越大

18. 杂散光产生的原因 操作失误 样品室没有关严 比色杯中样品体积不够 仪器的结构 不能有效消除来自仪器之外的光线和样品池周围的反射光线 不能有效的利用单色光

19. （六）化学相互作用 浓度依赖的缔合与解离（单体 - 多聚体反应） 浓度约为 0.01mol/L 时的静电相互作用 溶液组分间的酸碱相互作用 疏水 / 亲水反应引起的局部溶剂改变、离子强度改变、溶液折射率的改变 基质中不同组分之间的反应

20. （七）噪声和其他的误差来源 仪器噪声 光源和检测器噪声的水平将影响吸光度的噪声水平 不同分光光度计噪声不同 同一台仪器的噪声水平随使用年限和使用情况变化 波长选择的误差 测定波长在吸收光谱所处位置影响吸光度的误差 每次分析时测定分光光度分析的线性范围是必要的，一般为 0.01~1.5AU

21. （八）化学非线性与仪器非线性 化学非线性 在可用于测量化合物浓度的任何波长下都能观察到吸光度与浓度的非线性关系 仪器非线性 只有在吸光度超过仪器的特性值时才能观察到，也就是说，非线性行为是所用波长的函数

22. （九）加和性 多组分溶液的吸光度在化合物之间没有化学相互作用的情况下是单个组分吸光度之和 A 混合 ＝ A 化合物 A ＋ A 化合物 B ＋…＋ A 化合物 N 可求得某一单个未知化合物的吸光度 A 化合物 A ＝ A 混合 － Σ (A 化合物 B …A 化合物 N )

23. 混合物与空白 空白：含有待测混合物中除分析物之外的所有其他成分的溶液 根据加和性原理，可以通过对空白进行数学相减或光学相减的方法得到某一组分的吸光度 只有在混合物组分间没有相互作用的情况下才能使用

24. 四、分光光度计 光源 波长选择器 样品槽 检测器 输出 光源 样品槽 光栅 检测器 阵列 输出 传统分光光度计 二极管阵列分光光度计 hv hv

25. 微量滴定板分光光度计 与传统分光光度计类似，几乎都是单光束装置，光由顶部到底部（或者相反的方向）穿过样品室 光径长度不固定，是微量滴定板孔中样品体积的函数

26. 光源、光径与样品池材料 光源 发光二极管、激光、氘灯、炭棒弧光灯、卤钨灯、钨灯、空心阴极管、汞灯等 光径 一般固定，微量滴定板分光光度计除外 样品池材料 紫外区（ 200~350nm ）：石英样品池 可见区（ 350~700nm ）：玻璃和塑料样品池 在 350~400nm 之间，玻璃和塑料样品池有一定吸收

27. 仪器的校准 暗电流：在所有电子式的分光光度计中，即使没有光线到达检测器时仍然会有的一些电信号 校准方法 阻断光路，测量零光亮 (%0T 或 ∝ A ) 的电信号 装入空白溶液，测定 100%T 的电信号

28. 五、原子吸收分光光度法 测定所形成的原子蒸汽中电离元素的原子对所选光线的吸收，是线光谱 常用于分析生物样品中痕量金属的含量 缺点 仪器运行的成本高 需要进行大量的、仔细的样品消化 误差干扰通常发生于矿物痕量元素的分析

29. 六、荧光光谱 荧光：电子通过吸收光线被激发到高能态，再由高能态跃迁回时的发射 λ 1 λ 2 λ 3 λ 2 λ 2 ＋ λ 4 λ 4 光源 激发波长 选择器 样品 发射波长 选择器 检测器

30. 荧光分光光度计的特点 吸光分子发射光的量与其浓度成正比 荧光标准曲线在低浓度（吸光度低于 0.04 ）呈线性，在高浓度呈非线性

31. 第二节 比色分析的原理

32. 一、比色反应的必要性和概念 分光光度法的局限性 比色反应 能将待分析物转化为具有足够吸光度的有色产物的特异的检测反应 只有在给定的反应条件下、在严格限制的待分析物与试剂的浓度范围内，以及在给定的时间范围内产物的吸光度才与待分析物浓度成比例

33. 双缩脲分析的光谱 试剂 +BSA 差值 试剂

34. 二、反应随时间的变化 待分析物和产物的浓度是动力学区域内时间的函数，而与平衡区域内的时间无关 可被检测的产物受自身降解过程的影响 通过立即测定达到平衡的产物可将这种降解的影响减到最小，即将降解发生的时间减到最小 反应产物的存在是瞬时的，系统永远无法达到平衡 需要在产物浓度达到最大时测定 检测过程本身是引起产物损失的原因 某些氨基酸的荧光分析中产物被光降解

35. 反应随时间的变化过程 动力学区域 平衡区域 产物损失 产物 分析物 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 20 40 60 80 100 120 140 时间 /T 产物的量 /%

36. 比色分析的形式 平衡分析 浓度不随测定过程的时间而变化 最普遍的应用 动力学分析 浓度在测定过程中发生变化

37. 三、平衡分析 测定信号为产物的吸光度 时间不影响信号的大小，产物的信号可在反应平衡部分的任何时间采集 测定的进行 当所形成产物的吸光度是待分析物浓度的线性函数（即符合比尔定律）时，可以计算摩尔吸收系数并且将其用于测定未知物的浓度 由于样品基质经常会带来干扰且反应条件的变化会引起波动，在几乎所有的比色反应的测定中，都采用标准曲线来实现未知物的测定

38. （一）标准曲线 标准曲线的作用 防止分析者的主观臆断 消除特定试剂在长期储存中变质而引起的误差 校正由于微小的计时错误和温度波动所引起的误差 标准曲线的测定 由不含待分析物的空白和一系列包含所有试剂与浓度递增的分析物的样品来测定 使用标准曲线的基本假设 未知样品中待分析物的响应因子与标准样品中的一致

39. 例：标准曲线的测定 回归分析结果为： R2=0.9968 ，斜率为 15.52 ，则可知未知 1 样品中的蛋白浓度为 0.168×15.52=2.61mg/ml 1 0.168 4 1 未知 1 5 1 0.379 4 1 6 4 1 0.261 4 1 4 3 1 0.143 4 1 2 2 1 0.000 4 1 0 1 空白样品号 ABS 双缩脲的量 /ml 样品量 /ml 蛋白浓度 /(mg/ml) 样品号

40. （二）比色分析必要条件 产品浓度与分析物浓度成正比 产物具有高的摩尔吸收系数 检测反应对分析物有选择性 反应完成 99% 以上，即比色反应是定量的 反应时间合理，在适当的时间内达到平衡

41. 1. 比例 所形成的产物的量与分析物的量成正比是比色分析的基础 没有分析物被副反应消耗 测定过程中反应产物稳定 最好的办法是了解样品基质的化学组成，采用能限制分析物被破坏的分析试剂和测定方案

42. 2. 摩尔吸收系数 大多数的比色反应产物的摩尔吸收系数范围在 (1×10 3 )~(1×10 5 ) (AU L)/mol 摩尔吸收系数的理论最大可能值在 1×10 5 (AU L)/mol 左右 比色产物的摩尔吸收下限在 1×10 3 (AU L)/mol

43. 3. 反应选择性 选择性 基于与分析物上的功能基团的化学偶联 基于特异的化学反应 干扰 基于特殊功能基团的化学反应 水合茚三酮测定总蛋白中游离氨基酸和肽的干扰 基于同分析物发生反应引起试剂的变化 双辛可宁酸 (BCA) 测定总蛋白中其它还原性物质的干扰 基于试剂发色团溶剂环境的改变 某些蛋白结合分析中利用水环境到非水环境时最大吸收波长的位移和吸光度的改变

44. 4. 产物的定量生成 理想的情况是比色反应能定量进行，即大于 99% 的分析物转化为产物 低于 99% 的转化率会导致灵敏度降低和结果不准确 不完全的反应一般是由于选用了不合适的温度－时间组合或不合适的试剂－分析物的比例所引起的

45. （三）温度 反应温度影响反应达到平衡的时间，但对于在水溶液中平衡的产物浓度影响很小 需要对所采用的温度进行权衡 温度依赖性考虑的问题 太低的温度可能导致不完全的反应，必然引起不精确的结果 当衍生反应的时间太长时，温度的增加将减少达到平衡所需的时间

46. 温度对反应时间的影响曲线 低温 高温 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 20 40 60 80 100 120 时间 量 /% 产物 分析物

47. （四）试剂浓度 采用不合适的试剂浓度与分析物浓度配比是导致非线性比色反应的通常原因之一 通常采用大大过量的试剂 根据质量作用定律，被分析物转化为产物的百分数是试剂 / 被分析物的比例和比色反应平衡常数的函数 动力学理论要求高的试剂浓度以使反应更快地达到平衡 使用零分析物即空白调整比色测定的零点的依据是试剂浓度在比色反应过程中没有大的变化 注意副反应对试剂浓度的影响

48. （五）反应产物的稳定性 产物稳定性的知识是选择测定比色反应产物量的时间的关键 如果产物在分析条件下稳定时间长，则吸光度的测定可在空闲的时候进行 如果产物的寿命短，产物的浓度必须在产物稳定的时间内快速测定

49. （六）产物测定的空白和波长选择 选择在产物具有强吸收的波长处进行测量，所选波长不应与混合物中其它组分的吸收波长重叠，而且波长设定中小的误差不致引起大的吸光度误差 试剂、产物及样品基质的光谱重叠情况 产物光谱与其它光谱没有重叠 产物与试剂具有交叠的光谱 产物、试剂和样品基质的光谱均有重叠 产物与分析物具有交叠的光谱

50. 产物、试剂和样品基质光谱重叠的可能 (b) 不 是 不 是 2 ？ 是 是 ？ 4 (c) 是 是 不 是 3 (a) 不 是 不 不 1 例子 样品基质 产物 分析物 试剂 编号 (a) 没有重叠的光谱 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 波长 /nm 吸光度 基 质 试 剂 产 物 (b) 产物与试剂的光谱交叠 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 波长 /nm 吸光度 基质 试剂 产物 (c) 大范围的光谱交叠 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 波长 /nm 吸光度 基质 试剂 产物

51. 1. 产品光谱与其它光谱没有重叠 此时于产物最大吸收波长处测得的吸光度只源于产物，含有分析物的样品的基质和试剂在检测波长处均没有吸收，对检测结果没有干扰 选择产物具有最大吸收的波长

52. 2. 产物与试剂具有交叠的光谱 于产物最大吸收波长处所测得的吸光度来源于反应产物和试剂，样品基质中不包含在产物波长范围内有吸收的化合物 选择产物具有最大吸收的波长 需要进行空白样的校正，因此要求在反应中试剂的浓度没有大的变化

53. 3. 产品、试剂和样品基质光谱交叠 在产物的检测波长处，样品基质、产物和试剂均有吸收，总的吸光度包含样品基质加上溶剂、试剂以及反应产物的吸光度之和 必须设计空白 一套包含溶剂 一套只包含溶解试剂的溶剂

54. 设计方案：步骤一 以已知浓度的分析物作一条标准曲线 用“ 0” 分析物样品作零点，同时比色测定包含未知量分析物的 3 个样品 包含未知量分析物的吸光度 ABS 总反应混合物 ＝ ABS 反应产物 ＋ ABS 试剂 ＋ ABS 基质 空白的吸光度 ABS 总空白混合物 ＝ ABS 试剂 净吸光度 ABS 步骤 1 净 ＝ ABS 产物 ＋ ABS 基质

55. 步骤二 测定 3 个样品中来源于样品基质的吸光度 分别取含有不同量分析物的 3 个样品，加入与步骤 1 中试剂体积等量的溶解试剂的溶剂，其中不应含有任何活性试剂 以只包含样品溶剂和溶解试剂的溶剂作为光学空白测定样品基质的吸光度 净吸光度 ABS 步骤 2 净 ＝ ABS 基质

56. 步骤三 步骤 1 所测得的吸光度减去步骤 2 所测得的吸光度，所得吸光度为样品中检测反应产物的吸光度 ABS 步骤 1 净 － ABS 步骤 2 净 ＝ ABS 反应产物 用已知标准样品回归分析的结果求出样品中未知物浓度

57. 例：可乐饮料中蛋白浓度的测定 在可乐饮料中蛋白质含量增加的研究中，采用双缩脲分析测定可乐饮料中的蛋白。问题是可乐饮料中含有焦糖，其在测定双缩脲反应产物吸光度的波长 550nm 处有吸收。在这种情况下怎样测定可乐饮料中的蛋白质浓度呢？

58. 步骤 1 和步骤 2 绘制已知浓度蛋白（牛血清蛋白）双缩脲分析的标准曲线。用表 (a) 中的“ 0” 蛋白样品作为空白去调整分光光度计的零点 用双缩脲分析测定可乐样品中蛋白的浓度。用步骤 1 中“ 0” 蛋白样品作为空白去调整分光光度计的零点

59. 标准曲线的测定和未知样品分析 回归分析得： y=16.706x ， R 2 =0.9999 0.36 4 1 ? 未知 3 0.15 4 1 ? 未知 2 0.23 4 1 ? 未知 1 0.358 4 1 6 D 0.240 4 1 4 C 0.122 4 1 2 B 0.00 4 1 0 A ABS （样品 A 为空白） 双缩脲体积 /ml 样品体积 /ml 蛋白浓度 /(mg/ml) 样品号

60. 步骤 3 测定可乐样品中焦糖的吸光度，用“ 0” 可乐样品作为空白去调整分光光度计的零点 4 0 4 1 0 0 空白 4 4 0.062 4 0 0 1 3 3 4 0.062 4 0 0 1 2 2 4 0.061 4 0 0 1 1 1 空白样品号 ABS 双缩脲溶剂体积 /ml 样品溶剂体积 /ml 双缩脲体积 /ml 样品体积 /ml 未知样品号 样品号

61. 步骤 4 从步骤 2 所得吸光度减去步骤 3 所得吸光度，测得的吸光度即为双缩脲试剂与可乐饮料中蛋白反应产物的吸光度，再用步骤 1 回归结果求蛋白的浓度 5.0 0.298 0.062 0.36 3 1.46 0.088 0.062 0.15 2 2.82 0.169 0.061 0.23 1 可乐饮料中蛋白浓度 /(mg/ml) 净 ABS 步骤 3 的 ABS 步骤 2 的 ABS 未知样品号

62. 4. 产物与分析物具有交叠的光谱 这是一种非常难解决的情况 尝试使用同试剂、基质和产物具有与交叠光谱一样情况的空白 产生有色产物的反应可能改变分析物的电子结构 可能改变分析物中使其具有重叠光谱结构部分的电子结构 解决方法 寻找其它的产物和分析物光谱不重叠的方法 寻找去掉分析物中与反应产物有重叠光谱的组成部分的方法

63. 四、动力学分析 考虑经典反应 在任何时刻某化合物形成的净速率与其形成的速率和降解的速率之差成比例

64. （一）动力学的比色测定 如果在反应中，试剂的浓度比分析物的浓度大得多；而所测的速率是在反应过程的早期，实际上没有产物的降解，则方程可变为 演变为一个假一级速率方程式，此时可用产物形成的速率和假一级速率方程式去确定分析物的浓度 产物的信号可以在某一固定时刻收集或等于信号和时间函数曲线的斜率

65. （二）响应曲线 如果测定在固定时刻进行，响应曲线就是固定时刻的吸光度对分析物浓度的曲线图 如果测定的是浓度变化的斜率，响应曲线就是斜率对分析物浓度的曲线图

66. 1. 固定时刻动力学分析 优点是使用方便，可使用低值设备，不需要记录仪和类似的设备 缺点是产物的信号不是在多个时间点记录的，分析者不能直接确定随时间具有固定的速率的假设是否正确 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 10 20 30 40 时间 /min 吸光度 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 5 10 15 20 25 [ 分析物 ] 吸光度 (10min 后 )

67. 2. 斜率方法 优点是有多个信号 / 时间的数据点，分析者可检查浓度随时间变化是否呈线性；大量数据点的收集减少了噪声对观测的影响 缺点是计算复杂，仪器价值高

68. （三）温度对动力学分析的影响 温度对动力学分析影响较大 Arrhenius 方程阐明了温度对反应速率的直接影响 对反应速率还有间接的影响

69. 五、动力学分析与平衡分析的比较 较少，但选择性不如动力学分析 有很多潜在的干扰，但有时可用于避免发生于平衡分析中的副反应 潜在的干扰 质量作用定律 假一级动力学， Arrhenius 方程 主要方程式 影响平衡时间，对平衡浓度影响很小 控制温度很重要 反应温度的影响 需要足够的时间达到平衡 关键性的 测定时间的影响 吸光度 吸光度随时间的改变 测定的信号 平衡分析 动力学分析 特点

70. 动力学分析与平衡分析的比较 很少 经常 分析中使用摩尔吸收定律 低 高 仪器价格 高 低 灵敏度 需要空白 常常以反应溶液作为自身的光学空白 空白 比较重要 不太重要 产物稳定的重要性 长 短 反应时间 平衡分析 动力学分析 特点

71. 六、分析方法的选择 应考虑分析物的化学性质、样品中分析物的预期值、分析反应的化学过程以及含有分析物基质的化学性质 通过分析基质与未知样品相近或相同的已知浓度的样品来验证

72. 第三节 分光光度分析及比色分析的应用

73. 一、酶及其作为试剂的应用 酶与特定底物的高特异性相互作用 产物的高特异性 高的酶催化活性 使用的酶的命名应标明酶的来源种类、热稳定性、以及是否此酶已被专门设计用于特定的分析或介质等信息

74. （一）酶促比色反应 酶促比色反应几乎可以用任何系统来检测，吸收法、荧光法、化学发光最常见 即使对自然界中不存在的一些化合物进行化学分析，仍然可以用酶来实现 偶联酶（指示剂酶）的应用日益普遍 酶联免疫分析（ ELISA ） 检测低浓度分析物

75. （二）使用酶试剂进行分析的类型 终点分析 分析物定量转变为产物 动力学分析 反应速度与分析物的浓度成比例 抑制分析 反应速度被抑制的百分率与分析物浓度成比例

76. （三）终点分析 一般使用过量的酶进行反应直至 99% （或更多）的反应物转化为产物 两个状态 分析物作为底物、产物或辅助因子参加的酶促反应 在直接的或进一步的化学或酶促反应完成之后通过某些物理过程来检测产物

77. 1. 转化时间推导 进行酶促反应的测定 确定特定时间内使反应达到平衡时所需的酶量 选择测定产物浓度的方法 理论上需要达到 100% 的转化率，实际上 99% 以上的转化率是可以接受的

78. （ 1 ） S>>Km 此时米氏方程简化为 v ≈ v max =[E tot ] k cat 则此时可用上式直接进行计算即可

79. （ 2 ） S<<K m 此时米氏方程可简化为 积分得 则达到 99% 转化时

80. 2. 偶联反应 当反应平衡不利于反应物定量地转化为产物，或者产物不是直接可测时，常通过偶联反应来进行 特异反应是指仅与分析物反应，但所得到的产物对许多反应来讲是非特异的 指示反应则将初始反应的产物定量转化成可被检测的物质

81. （ 1 ）葡萄糖的偶联分析 特异反应：葡萄糖氧化酶催化产生过氧化氢 指示反应：使用辣根过氧化酶将过氧化氢与一染料前体转化为有色产物和水

82. （ 2 ）常见发光反应 鲁米诺（ 3- 氨基邻二甲酰环肼）反应 荧光素酶反应

83. （ 3 ）乙醇偶联分析 特异反应 乙醇脱氢酶催化氧化还原反应，将乙醇氧化成乙醛 使用辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，利用 NADH 在 340nm 处有吸收而 NAD + 没有吸收可监测反应进程 指示反应 非酶促反应与 NADH 的氧化过程相偶联，导致染料的还原，其颜色变化在可见区监测

84. 特异反应

85. 特异反应的局限性 技术上很难通过测量 NADH 在 340nm 处的吸光度随时间的变化来监测酶促反应 该反应的热力学常数倾向于乙醇和 NAD + 的产生 生成的 NADH 抑制乙醇脱氢酶的作用

86. 指示反应

87. 采用 PMS 和 MTT 指示反应的优点 不仅是 NADH 的浓度有效地保持在零，而且 NAD + 的浓度也保持在一个恒定值 还原的染料 MTT 的摩尔吸收系数大于 NADH ，因此染色偶联分析比直接监测 NADH 更灵敏

88. （ 4 ）偶联反应的优点 产生可检测的产物 将不易达到平衡的反应转化为偶联反应，使借助于偶联反应的平衡得到产物 保持初级反应中非分析底物处于恒定的水平 避免初级反应中存在产物抑制而发生的问题

89. 3. 循环反应 主要针对分析物的浓度很低的情况，在这种情况下即使分析物定量地转化成产物也难以检测到产物的浓度 循环反应需要小心控制分析时间，并需要建立校准曲线来订正一定时间内相对于样品中的分析物所产生的底物的量 （反应 1 ） （反应 2 ） 净反应：

90. NADPH 的测定 反应进行一段时间之后中止，分别测定谷氨酸和 6- 磷酸葡萄糖酸的浓度

91. 4. 生物高分子消化 当复杂的生物高分子消化（或合成生物高分子）是分析的一部分时，经常使用终点分析 测量 RNA 、 DNA 、蛋白和淀粉时通常先进行预消化，然后再分析一种或几种水解产物 注意事项 选择适宜的反应时间 定量地消化，否则不但回收率底，而且精密度不高

92. 纤维素存在下测定淀粉 酸催化水解 淀粉葡萄糖苷酶催化水解

93. （四）动力学分析 分析物浓度的酶促反应测定也可通过测量反应速度并将其浓度相关联而达到 通常是在反应速度与分析物浓度成比例的情况下作一条工作曲线 大多数这种分析均按两者成正比进行，即假一级反应来进行

94. 假一级反应 酶催化 当 [S]<<Km 时，米氏方程可简化为一级反应 v =( v max /K m )[S] 非酶催化 当一种反应物浓度远远大于另一种反应浓度时的初速度为假一级反应

95. 假一级反应标准曲线

96. 动力学分析的类型 偶联反应也可用于动力学分析，具有与终点分析同样的优点 非假一级反应也可进行动力学分析 酶促反应的抑制剂也可用于测定底物的浓度

97. 动力学分析的优缺点 优点 通常比终点分析省时 具有更好的特异性 缺点 对本底抑制更为敏感，需要较昂贵的设备 应具有其固有的分析质量控制程序

98. （五）酶的特异性 要求：酶应当能够催化底物使其转化为可检测的产物，而不能催化基质中的其他成分转化为可检测的产物 选择酶的原则 应充分明确分析物的化学结构以便确定酶是否催化预期的反应 分析中要使用特异的酶，如果有结构类似于分析物的化合物可能存在，就一定要核实酶分析体系的特异性，以确保只有分析物被作用，或只产生单一产物 基质中是否含有除分析物之外的其他可被酶催化检测的化合物

99. （六）酶的失活 不可逆失活 破坏了一级结构或三级结构：加热、 pH 值的变化、重金属的毒性、蛋白水解酶的作用、“自杀性底物”、氧化作用等 可考虑加入过量不干扰测定的蛋白 可逆失活 与底物类似物结合等

100. （七）酶促比色反应的精确性 干扰因素较多，必须进行仔细校正 确认酶制剂是否具有预期的活性 分析生物材料时需要做样品空白、酶空白及阳性对照以确保分析结果正确

101. 1. 阳性对照 采用阳性对照验证酶分析中酶的反应活性 标准的阳性对照是每组分析中都作一条标准曲线 确定用于计算样品浓度的分析参数 作为分析的阳性对照常将目前分析的标准曲线与以前同样方法分析的标准曲线进行对比

102. 2. 标准加入法 必要性 验证酶在无论分析物基质存在与否的情况下都具有相同的活性 做法 分别在分析物基质存在与不存在的情况下作一条标准曲线，将所测得的结果对加入的标准品的量作图，计算出基质存在或不存在时反应曲线的斜率

103. 标准加入法曲线

104. 标准加入法的反应体系 1 4.0 0.0 0.5 0.5 D 4.0 8 1 4.0 0.0 0.5 0.5 C 2.0 7 1 4.0 0.0 0.5 0.5 B 1.0 6 1 4.0 0.0 0.5 0.5 A 0.0 5 1 4.0 0.5 0.0 0.5 D 4.0 4 1 4.0 0.5 0.0 0.5 C 2.0 3 1 4.0 0.5 0.0 0.5 B 1.0 2 1 4.0 0.5 0.0 0.5 A 0.0 1 空白号 试剂量 /ml 稀释液量 /ml 基质中的样品体积 /ml 已知浓度的标准的体积 /ml 标准加入 加入已知分析物浓度 /(mg/ml) 样品序号

105. 测定标准曲线所需溶液 2.0 0.4 1.6 8.0 D 2.0 1.2 0.8 4.0 C 2.0 1.6 0.4 2.0 B 2.0 2.0 0 0 A 总体积 /ml 稀释量 /ml 储备液量 /ml 已知分析物浓度 /(mg/ml) 样品号

106. 标准加入法体系的不同 反应体系中有额外的两栏，一个是向基质中加入样品，一个是加入稀释液 加入的标准品的体积＋稀释剂的体积＋样品的体积＝分析中样品的总体积，而且加入标准品的体积是总分析样品体积的一半 反应体系中标准品被等体积的稀释液或样品稀释所致 反应体系中样品 1 既不含样品，也不含标准品，故作为空白，但它与其他样品一样被稀释 样品 5 的吸光度可用于计算基质中样品的原始浓度

107. （八）分析物的损失 分析物被副反应所消耗 如果被消耗或不能用于反应，会导致结果偏低 如果分析物的损失与浓度成正比例，使用标准添加或回收率测定等其他方法可以检测丢失的量 如果损失是固定的且处于一个低水平，则难以建立合适的校正因子 最好知道样品的化学组成而采取适合于分析物和基质的分析方法

108. 二、酶活性测定 酶的应用十分广泛 必须用测定酶活的方法表征酶的特性 不能用测定蛋白的方法来提供准确的酶的活性信息 在提取和贮存过程中酶活的降低

109. （一）酶动力学 米氏方程 米氏方程的假设 不考虑 E + P -> ES 的反应，即适用于反应的初始状态 底物浓度远大于酶的浓度，可用初始浓度计算 ES 可在相当一段时间内保持浓度的恒定

110. 初始速度与实际速度

111. 不同酶浓度的时间－吸光度曲线

112. 酶浓度对初始速度的影响

113. （二）酶活性的测定 酶活性分析即是将底物、缓冲液及其他成分混合均匀，然后进入酶，并立即开始倒计时。随着时间的延长，测量产物的产量，将其与相应的时间作图。由于反应需要在初始速度的条件下进行，故只取图中初始的直线部分，求其斜率 分类 连续酶分析：底物的减少与产物的增加随时间而变化，测定产物浓度不必终止反应 非连续酶分析：需要将反应体系分成等份，将反应终止之后才能测定产物浓度

114. 1. 连续酶分析 如果底物与产物在分析介质中具有明显不同的分析波长，则可以使用连续分析的方法 例如：碱性磷酸酶催化水解 p - 硝基苯基磷酸酯的反应

115. 典型连续分析结果

116. 连续酶分析的计算 将单位时间内吸光度的变化，即 Δ A/t 转换成每分钟浓度的变化，即将 Δ A/t 除以产物的摩尔吸收系数 将每升的浓度变成每 ml 的浓度 从速度与酶浓度计算活性 单一酶浓度测定：活性等于速度除以酶的浓度 多个酶浓度计算：一个酶浓度对应一个反应速度，将速度对浓度作图，斜率为比活力

117. 多个酶浓度计算示例 0.112 10.0 0.027 2.5 0.083 7.5 0.012 1.0 0.054 5.0 0 0.0 速度 /[μmol/(ml·min)] 酶浓度 /(μg/ml) 速度 /[μmol/(ml·min)] 酶浓度 /(μg/ml)

118. 2. 非连续酶分析 在酶催化后的产物不能被分光光度法直接测定，需要通过比色反应将其转化为可测的产物时使用 方法 加入酶之后在不同时间从反应混合物中取出一小份，中止反应 通过比色反应产生带色物质 酶反应 中止反应 比色反应 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

119. 非连续酶分析的计算 首先为比色分析作一条标准曲线，然后计算其 R 2 、灵敏度、检测限及线性范围 对应于每一种酶浓度将每等份的比色吸光值对时间作图 计算对应每一酶浓度的相应曲线的斜率 将上一步所得斜率除以标准曲线灵敏度，得到相应单位的初始速度 列表，其中应包括酶浓度和计算出来的速度 绘制速度对酶浓度的曲线，计算其斜率，即比活性

120. 例： AP 的非连续酶法活力测定 假设以 p - 硝基苯酚基磷酸酯为底物，通过非连续分析法分析碱性磷酸酶（ AP ）的活性。通过非连续分析释放的磷酸盐分子，测定出反应的速度，分析包括磷钼酸盐与孔雀绿形成的深色显色复合物。

121. （ 1 ）标准曲线的测定 准备一系列试管，加入不同量的无机磷酸盐（ 0 ， 4 ， 8 ， 12 ， 16 ， 20 nmol/0.4ml ），终体积均为 0.4ml 向各管中加入 2.6ml 孔雀石试剂混匀，静置 10min ，于 645nm 测定各个样品的吸光度 绘制标准曲线，测定分析线性范围 0.622 50 20.0 0.469 40 16.0 0.349 30 12.0 0.215 20 8.0 0.090 10 4.0 0.000 0 0.0 吸光度 645nm P 1 浓度 /(nmol/ml) P 1 浓度 /(nmol/0.4ml)

122. 磷酸盐标准曲线

123. （ 2 ） AP 活性的非连续分析 反应中使用 0, 1.5, 2.5, 5μg/μl 的 AP ，共 3ml 反应混合物 开始分析之前，准备另一套试管用于生色反应，各管中加入 2.6ml 孔雀石试剂 零样品的准备：将除酶之外的全部试剂混匀后，加入酶混匀，并立即取出 0.4ml 混合物加入至孔雀石试剂中，并开始记录比色反应时间 分别于 1, 2, 3 和 5min 时刻各取 0.4ml 等份的酶溶液加入至含孔雀石试剂的标记为 1, 2, 3, 5min 的试管中 样品与显色剂混合 10min 后测量 645nm 处的吸光度

124. 不同酶浓度下时间与吸光度数据 标准曲线 /[0.01318AU/(nmol/ml)] 13.35 7.44 4.62 0.00 除以斜率新单位 /[nmol/(ml·min)] 0.17594 0.09803 0.06089 0.00 最小二乘法斜率 /(AU/min) 0.853 0.488 0.312 0 5 0.503 0.29 0.17 0 3 0.317 0.186 0.105 0 2 0.153 0.099 0.076 0 1 0.02 0.01 0.01 0 0 5 2.5 1.5 0 酶浓度 /(μg/ml) 时间 /min

125. 不同酶浓度下 AP 催化反应的时间过程

126. 测定酶比活性

127. （三）酶分析反应条件 合理选择和应用特定的反应条件对酶活性的分析十分重要 大多数酶活性分析是针对特定基质而发展出来的，在将这些方法应用至不同的基质时，应当确认其是否仍然有效

128. （四）偶联反应和多底物酶 偶联反应 如果反应平衡不利于底物定量转化为产物，或者产物难以检测，可以利用偶联反应进行酶活的测定 多底物酶 要求所有的底物达到酶饱和的水平，从而可以通过 V max 的条件计算未知的多底物酶的量

129. 三、酶联免疫吸附测定

130. （一）背景及综述 抗体和抗原结合的高选择性 免疫吸附测定法 纯抗体的获得为其提供了物质上的基础 利用蛋白质定量粘附于硝化纤维和新型塑料，尤其是聚苯乙烯和聚氯乙烯的性质 抗体的定量 报告基团技术（ reporter group technology ）

131. ELISA 法的定义 酶联免疫吸附测定法（ ELISA 法）是将酶用作报告基团在体外用化学交联剂共价连接到抗体或抗原上，通过测定酶活对酶－抗体缀合物进行定量，即酶放大体系的免疫吸附形式 现代分析方法中灵敏度和选择性最高 灵敏度来自作为报告基团的酶 选择性来自抗体或抗原的选择性

132. 小分子量物质抗体的制备 将分析物共价结合到一个诸如牛血清蛋白等中等大小的蛋白上 制备针对分析物－牛血清蛋白缀合物的抗体，所制备的是多重抗体 制备用牛血清蛋白作为活性结合位点的亲和色谱柱 在牛血清蛋白柱上分离所制备的针对分析物－牛血清蛋白缀合物的抗体

133. （二） ELISA 的种类和变化

134. 1. 双抗体测定法 通常称为“夹心测定法”，用于测定已知抗原的浓度 抗原“夹”于两抗体分子之间 需要亲和纯化的多克隆抗体 单克隆抗体或多克隆抗体必须结合于抗原上不同的不相重叠的抗原决定簇 未修饰和被修饰（抗体－酶缀合物）的抗体均被使用

135. 双抗体法的步骤 获得分析物的未标记的抗体 将未标记的分析物的抗体加入并结合于微滴定板的小孔中 洗涤小孔除去未结合的抗体 于小孔中加入封闭蛋白溶液以封闭小孔表面残留的蛋白结合位点 洗涤并除去未结合的封闭蛋白 加入分析物（抗原）使之结合于小孔中 洗涤并除去未结合的抗原 加入酶标记抗体，使之与分析物结合 洗涤并除去未结合的酶标记抗体 加入酶底物开始酶反应 终止酶反应 用 ELISA 平板读数器定量酶催化反应产物

136. 注意事项 逐盒确定与之滴定板结合的最佳初始浓度 逐盒检查确定抗原－抗体结合的最佳浓度 在很宽的浓度范围内分析已知浓度的分析物，以找出每个测定可用的线性部分 在一系列浓度范围内分析含有未知浓度分析物的样品

137. 实例：测定兔血清中 IgG 浓度 10.0 2.0 12 0.50 0.05 6 7.5 1.0 11 0.25 0.03 5 5.0 0.50 10 0.10 0.02 4 2.5 0.30 9 0.075 0.01 3 1.0 0.20 8 0.050 0.005 2 0.75 0.10 7 0.025 0 1 [ 兔血清 ]/( μ g/ml) 0.1ml/ 孔 行 C 和 D [ 兔 IgG]/( μ g/ml) 0.1ml/ 孔 行 A 和 B 列 [ 兔血清 ]/( μ g/ml) 0.1ml/ 孔 行 C 和 D [ 兔 IgG]/( μ g/ml) 0.1ml/ 孔 行 A 和 B 列

138. 标准曲线及响应曲线

139. 计算 一旦标准浓度与未知浓度响应曲线的线性部分已经确定，就可以计算分析物的浓度

140. 2. 抗体捕获测定法 与双抗体法类似 不同之处在于抗体捕获测定法的蛋白抗原直接结合于微滴定板的孔中 结合的抗原的测定 直接测定与其结合的酶偶联抗体的酶活性 间接方法：抗体先与分析物（抗原）结合，然后再与针对第一抗体的酶偶联抗体结合，之后测定酶的活性即可

141. 间接法举例 测定人血样品中是否含有抗特定微生物的抗体 首先将抗原（微生物蛋白）结合到聚苯乙烯上，加入要测定的抗微生物抗体的血清 加入抗人免疫球蛋白抗体－酶缀合物 加入底物进行酶反应，检测有色物质 需要以纯的抗原进行系统校准，但是第一抗体则不必是纯化的形式

142. （三） ELISA 法的注意事项 准确性 生物体系中不同化合物之间存在大量免疫学的相似性，因此，使用前常需证明测定抗体与基质中分析物之外的物质之间没有交叉反应 精密度 可变性较多，如微滴定板的不同批次、酶偶联抗体的不同批次、生物基质中的某些组分的干扰，因此，具有较高的相对标准偏差，经常需要平行测定 3 份，相关系数≥ 0.95 即可