細胞機能設計学という講義のレポートです。 mRNAの検出法、ノザンブロットハイブリダイゼーション、RT-PCR法、抗体、ウェスタンブロット法、フローサイトメーター（FACS） についてざっくりまとめています。

1. 生命機能設計学 レポート⑥
（2017/11/09 の講義分）
2017/11/16
ゆきひろ
【mRNA の検出法】
古典的な mRNA 検出法として、ドットブロットハイ
ブリダイゼーションとノザンブロットハイブリダイ
ゼーションが挙げられた（ドットブロットハイブリダ
イゼーションについては前講義でも扱った）。
【ノザンブロットハイブリダイゼーション】
ドットブロットハイブリダイゼーションでは、（自
分自身で水素結合している可能性を排除するため）一
本鎖の mRNA を紙に固定し、プローブでハイブリダイ
ズする。
一方、ノーザンブロッティングによる RNA の検出(図
1)では、細胞から核酸（DNA＋RNA）を抽出した後、サ
ンプル中の RNA が分解しないよう、RNase を含まない
DNase を用いて DNA のみを消化し、アガロース電気泳
動などによって展開する。このゲルを拡散もしくは吸
引によってメンブレンに転写し、検出したい RNA 配列
に相補的な配列を持つプローブ核酸をハイブリダイ
ズさせることで標的 RNA の量、サイズを検出する。
標識には放射性同位体（RI）を用いた方法や、DIG
（ジゴキシゲニン）などの化学物質をプローブ核酸に
結合させ、それに対する抗体を用いた方法がある。
図 1
【RT-PCR 法】
上に示したように、ノザンブロット法は核酸の抽出
から始まり、非常に作業が煩わしく、また結果を得る
のに非常に長い時間を要してしまう。
これを解決するのに用いられるのが RT(＝Reverse
Transcription)-PCR 法(図 2)である。
名前のとおり RT-PCR 法とは、cDNA を用いて PCR を
行う方法である。
この手法によりタンパク質をコードする遺伝子の
選択的増幅、少量しか存在しない mRNA の増幅と解析
に使用することが可能となった。また、遺伝子発現解
析の手法としても利用されている。DNA を増幅する基
本的な原理は通常の PCR 法と変わらない。
この方法が発明されていなければ未だにサザンブ
ロット法やノザンブロット法が用いられていたであ
ろうことから鑑みるに、PCR 法の登場は生物学会の光
明であるといえる。
図 2
【抗体】
導入遺伝子の翻訳・修飾が行われたかどうかの発現
確認（タンパク質の検出）の方法として Western blot
解析、フローサイトメーターによる解析が挙げられた。
ウェスタンブロット法では、目的タンパクの発現を
可視化する手法としては抗原抗体反応を用いられて
いる。
まずその導入として、この手法のキモである抗体と、
その名前の解釈について共有した。
抗体は可変部(Variable Region)と定常部（Constant

2. Region）とに大きく分かれており、可変部はさらに重
鎖（Heavy Chain）と軽鎖（Light Chain）とに分かれ
ている。抗体は抗原を可変部の上端で抗原を認識し、
結合する。軽鎖と重鎖はジスルフィド結合（SS 結合）
で結びついてヘテロダイマーを形成し、さらにこのヘ
テロダイマーが左右 2 つジスルフィド結合で結合して
Y 字型のヘテロテトラマーを形成する（図 3）。
図 3
また、抗体名の解釈として、「マウス抗 BSAIgG 抗体」
を例にとると、マウスは由来となった動物種を、抗 BSA
は認識する抗原を、IgG 抗体は抗体の定常部の種類を
示す。
【ウェスタンブロット法】
SDS-PAGE を行った後、タンパク質をメンブレンに転
写し、抗体を用いて特定のタンパク質を検出する方法
である。
SDS-PAGE 後のゲルにメンブレンを密着させ、分離し
たタンパク質に電圧をかけてゲルからメンブレンに
転写する。タンパク質を移動させたメンブレンに目的
タンパクを認識する一次抗体を反応させ、洗浄・ブロ
ッキング後、二次抗体を加え、これを HRP などの酵素
で標識させると、酵素活性を利用した化学発光法もし
くは発色法によりタンパク質を確認することができ
る（図 4）。
図 4
【フローサイトメーター（FACS）】
本講義で扱った 2 つ目の導入遺伝子の発現確認の方
法として、フローサイトメーターによる解析が紹介さ
れた。
フローサイトメーター(fluorescence activated
cell sorting)とは、蛍光抗体で染色した細胞を液流
に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の
細胞が発する蛍光を測定することによって細胞表面
にある抗原量を定量的に測定することのできる機器
である。
細胞内外の蛍光強度だけでなく、細胞の大きさや内
部構造といった生物学的特性も高精度で測定可能で
ある。また、生細胞の分取も可能で、これはレーザー
顕微鏡ではできない。
【参考文献・画像元 URL】
 研究ネット：
http://www.kenq.net/dic/30.html
 Wikipedia：
https://en.wikipedia.org/wiki/Northern_blot
 Thermo Fisher：
https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/lif
e-science/cloning/cloning-learning-center/i
nvitrogen-school-of-molecular-biology/rt-ed
ucation/reverse-transcription-applications.
html
 DownHouseSoftware：
https://downhousesoftware.wordpress.com/201
3/12/26/using-antibodies-as-vaccine-deliver
y-vehicles/
 G-BIOSCIENCES：The Protein Man's Blog | A
Discussion of Protein Research. Which Blocking
Agent for Western Blotting?：
https://info.gbiosciences.com/blog/bid/1592
73/which-blocking-agent-for-western-blottin
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