2. El WESTERN BLOT, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar
proteínas específicas en una muestra determinada .
•
Prueba de VIH
• la encefalopatía espongiforme
bovina, comúnmente llamada
"enfermedad de las vacas
locas".
• la enfermedad de Lyme
3. PROCEDIMIENTO
a) Preparación de la muestra. Extracción de
las proteínas de las muestras biológicas
mediante disrupción mecánica o química.
4. b) Electroforesis en gel de Acrilamida. Las
proteínas en el extracto se separan de acuerdo
a su tamaño mediante electroforesis. Se
prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida.
5. c) Transferencia electroforética a una
membrana. Las proteínas son transferidas
electroforéticamente a un soporte rígido o
membrana, dónde quedan inmovilizadas.
6. d) Hibridación del Anticuerpo. La membrana con
las proteínas inmovilizadas debe tratarse para
bloquear las zonas con ausencia de proteínas
y así evitar la unión no específica de los
anticuerpos.
7. e) Detección de las Bandas. Después de un
lavado de la membrana para eliminar el
anticuerpo no unido, se procede a detectar
la localización de la banda en la membrana.
8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
• Las proteínas se extraen mediante procesos
químicos y/o mecánicos.
• El método elegido dependerá del tipo de
muestra de partida, de la localización
subcelular de la proteína y de las
condiciones óptimas que requiera el
anticuerpo para reconocer el epítopo
proteico.
9. Métodos físicos de la disrupción de muestras.
MÉTODO
DESCRIPCIÓN
TIPO DE MUESTRA
Licuadora
La muestra se tritura mediante
cuchillas rotatorias
Gran cantidad de tejido
Homogeneizador Dounce
Tubo de vidrio con pistón
ajustado maja las células por
acción de corte
Células tisulares, útil para
protocolos de enriquecimiento
de proteínas mitocondriales o
nucleares.
Homogeneizador de
ultrasonidos
Ondas de sonido emitidas por
una sonda para romper las
membranas celulares
Células, tejido, bacterias
Pulverización de Nitrógeno
liquido
La muestra se pulveriza
utilizando un mortero y una
almirez refrigerados
Tejido animal o no vegetal
Perlas de vidrio
La ruptura celular se produce
por agitación de las perlas de
vidrio
Levaduras
10. Soluciones de tampón y detergentes
TIPO/LOCALIZACIÓN
PROTEÍNA DE INTERÉS
DETERGENTE O SOLUCIÓN
TAMPÓN
Detergente suave no iónico
COMENTARIOS
Nativa (no desnaturalizada)
Evitar detergentes
desnaturalizantes (SDS,
Deoxicolatos)
Citoplasmáticos (soluble)
Puede combinarse con
métodos mecánicos, tales
como el homogeneizador
Dounce
Citoplasmático (unida a
citoesqueleto)
Membrana mitocondrial o
nuclear
Lisado total de celulas
Tris-HCl
Tris – Triton
NP-40, RIPA (multiples
détergentes), Triton X-100
NP-40, RIPA,
Triton X-100
Los detergentes Triton son
suaves y no iónicos
Para antígenos con niveles
bajos de expresión pueden
ser necesarios procesos de
enriquecimiento
11. Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas que
pueden degradar la proteína de interés. Por tanto, es
importante evitar, durante la preparación de la
muestra, cualquier actividad proteásica.
• Evitar excesivos ciclos de congelación/descongelación.
• Trabajar rápido y mantener las muestras en frío
durante todo el proceso.
• Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis.
12.
13. ELECTROFORESIS EN
ACRILAMIDA
• Previamente a la
electroforesis, es
importante determinar la
concentración de proteínas
por las siguientes razones:
1. Asegurar la carga de la
cantidad correcta de
proteínas en el gel.
2. Realización de Western
Blot cuantitativos o
semicuantitativos.
14. 1. Una vez se tienen las muestras de proteína
• se pueden conservar congeladas, teniendo cuidado en evitar
ciclos repetitivos de congelación/ descongelación.
• se pueden utilizar inmediatamente, con un tampón de carga
2. las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante
5-10 minutos
3. cargar la muestra en un gel de electroforesis.
15. Inicio de electroforesis
• Antes de la carga del gel, es importante diseñar el experimento
incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de
los resultados.
1. Marcadores de peso molecular
2. Controles positivos
16. TRANSFERENCI
A DE
MEMBRANA
• Después de la separación
electroforética de las proteínas
por su peso molecular, éstas
deben transferirse desde el gel de
electroforesis a la membrana.
17. • Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos. Es muy
importante bloquear los sitios de unión de la membrana sin
reaccionar con el antígeno, para reducir la unión inespecífica
de las proteínas.
18. HIBRIDACIÓN DEL ANTICUERPO
• Después del proceso de bloqueo, la membrana se incuba con
el anticuerpo primario lavados anticuerpo secundario
conjugado con HRP (D. indirecta)
19. DETECCIÓN DE LAS BANDAS
Los métodos directos
utilizan un anticuerpo
primario conjuga-do con un
marcaje detectable, como
un enzima, biotina o
molécula fluorescente.
Lo métodos indirectos
utilizan dos anticuerpos; un
anticuerpo primario y un
anticuerpo secundario
contra la especie del primer
anticuerpo.
20. • Los métodos más comúnmente utilizados para
detectar proteínas son:
1. Quimioluminiscencia
2. Fluorescencia
3. Colorimetría.
21. QUIMIOLUMINISCENCIA
• Los métodos de detección de
quimioluminiscencia utilizan
comúnmente anticuerpos
secundarios conjugados con
peroxidasa (HRP). La reacción entre
el encima y el substrato produce
luz, que puede ser detectada
mediante la exposición de la
membrana a una película de rayos X
