1. Molecular cloning, expression and
biochemical characterization of a cold-
adapted novel recombinant chitinase from
Glaciozyma antarctica PI12
Aizi Nor Mazila Ramli , Nor Muhammad Mahadi , Amir Rabu, Abdul
Munir Abdul Murad , Farah Diba Abu Bakar , Rosli Md Illias
Microbial Cell Factories 2011, 10:94
Lukáš Chrást

2. Článek
 Microbial Cell Factories

3. O autorech
 Department of Bioprocess Engineering
 Faculty of Chemical Engineering
 Universiti Teknologi Malaysia

4. O autorech
 Assoc. prof. Rosli Md Illias, Ph.D.
 Extremofilní mikroorganizmy a jejich enzymy
 Extremofilní proteiny, predikce struktury

5. Chitin
 Významný přírodní polysacharid
 Monomer: N-acetyl-D-glukosamin
 β-1,4-glykosidická vazba
 Buněčné stěny hub
 Exoskelet bezobratlých http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a1/Chitin.png

6. Chitinasy
 Hydrolytické enzymy
 Štěpí β-1,4-glykosidickou vazbu
 Bakterie, houby, rostliny…
 Exo- a endo-chitinasy
 3 rodiny: GH18, GH19 a GH20
PDB ID: 1EDQ

7. Mechanizmus
 Chitinasa B ze Serratia marcescens
van Aalten et al (2001) PNAS 98

8. Glaciozyma antarctica PI12
 Poměrně nový rod kvasinek
 Psychrofilní kvasinky rostoucí na ledovcích
Turchetti et al. (2011) Extremophiles 15
 Dříve Leucosporidium antarcticum
 První izolace v r. 1966
Fell et al (1969) Antonie Leeuwenhoek 35
 Velké množství izolovaných enzymů

9. Motivace
 Biotechnologický potenciál chitinas
 Zajímavé vlastnosti psychrofilních enzymů
 Využití psychrofilů ve výrobě

10. Metodika
 Sekvence z databáze, získání cDNA pomocí RACE
 Heterologní exprese v Pichia pastoris
 Stanovení pH profilu v citrát-fosfátovém a
fosfátovém pufru
 Měření teplotního profilu a teplotní stability
 Stanovení kinetických konstant
 Aktivitní assay s DNS (3,5-dinitrosalicylová kys.)

11. Výsledky

12. Výsledky
 SDS-PAGE a Glycoprotein staining kit

13. Výsledky
 100 % aktivity při
 pH = 4.0
 teplotě 15 °C
 Ovlivnění aktivity v přítomnosti iontů

14. Výsledky
 Steady-state kinetiky

15. Zhodnocení
+ Zajímavé výsledky
- pH profil ve dvou pufrech
- Zvláštní interpretace kinetických dat
- Teplotní stabilita jako reziduální aktivita

16. Děkuji za pozornost.
chr@mail.muni.cz
http://loschmidt.chemi.muni.cz/peg/

17. Dotazy