A hepatotoxicitás in vitro modelljei

1. Improved Medical Education in Basic
Sciences
for Better Medical Practicing
ImproveMEd
A hepatotoxicitás in vitro modelljei

2. In vitro vizsgálatok a
hepatotoxicitás vizsgálatára

3. Source: http://cellbank.nibiohn.go.jp/legacy/celldata/jcrb0403.htm
1. Hepatocita sejtkultúrák
Source: https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/HB-8065.aspx?geo_country=h

4. 2. A Trypan Blue festék kizárási teszt
Source: https://bitesizebio.com/13687/cell-counting-with-a-hemocytometer-easy-as-1-2-3/
Source:
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/cellcounting.html
Source:https://www.researchgate.net/figure/51450741_
Trypan-blue-staining-Optical-microscopic-images-of-the-
CT-26-cells-treated-with-a
é𝑙𝑒𝑡𝑘é𝑝𝑒𝑠 𝑠𝑒𝑗𝑡𝑒𝑘 𝑡𝑒𝑙𝑗𝑒𝑠 𝑠𝑧á𝑚𝑎
𝑚𝑙
= 𝑚𝑒𝑔𝑠𝑧á𝑚𝑜𝑙𝑡 é𝑙𝑒𝑡𝑘é𝑝𝑒𝑠 𝑠𝑒𝑗𝑡𝑒𝑘 𝑠𝑧á𝑚𝑎 ×
ℎ𝑖𝑔í𝑡á𝑠𝑖 𝑓𝑎𝑘𝑧𝑜𝑡
𝑛é𝑔𝑦𝑧𝑒𝑡𝑒𝑘 𝑠𝑧á𝑚𝑎
× 10 000
𝑠𝑒𝑗𝑡𝑒𝑘
𝑚𝑙

5. 3. Oil red O staining
A sejteket fixáljuk
4% -os
paraformaldehiddel.
Remove fixative and
rinse twice with
cooled PBS.
Add Oil red O to
cells by using 0.2
micron syringe filter.
Öblítsük le jól
dH2O-val, amíg a víz
tiszta lesz.
Adjunk
hematoxylint a
magfestéshez.
Remove and rinse
well with dH2O until
the water runs clear.
Leave the final
dH2O rinse on the
cells for microscopy.
A lipidek pirosak
lesznek, a magok
pedig kék színnel
jelennek meg.
Source:https://atomscientific.com/product/Oil_red_O_Stain_Kit

6. 4. MTT
A sejteket, általában 96
lyukú lemezre (pl. 2x103
sejt / lyuk egy hétig tartó
kísérletre) helyezzük.
24 órás inkubálás után a
sejteket megfelelő időben
kezeljük szerekkel.
Remove medium and add fresh
medium with 0.5 mg/ml MTT.
El távolítjuk az MTT hordozót. A
sejtek szolubilizálásához egyenlő
térfogatú 0,04 M HCI-t adunk
izopropanolban vagy 10% SDS-
oldatban.
Leolvassuk abszorbanciát a
Microplate olvasón.
Az alacsonyabb abszorbancia
értékek a sejtproliferáció
csökkenését jelzik
(összehasonlítva a kontrollokkal),
és a magasabb értékek a
sejtproliferáció növekedését jelzik.
Source: https://www.slideshare.net/ChanderKNegi/mtt-cell-proliferation-assay

7. 5. RT-PCR
Keverjük össze a
templát RNS-t, a
primereket és a DEPC-
H2O-t 14 µl-ig a PCR-
csőben és inkubáljuk.
Az egyes mintákhoz 7,8-
8 μl reakcióelegyet
adunk, és 50 percig
inkubáljuk 42 ° C-on.
Adjunk hozzá 1 µl RNáz
inhibitorot (10 μg)
minden mintához, és
inkubáljuk 20 percig 37 °
C-on.
Adjunk hozzá 10 μl
minden primert a PCR
csövekhez. Ezután adjon
hozzá 15,5 μl alap
keveréket.
Adjunk hozzá 1-10 mg
RT-PCR cDNS és DEPC
H2O hígítást 65 μl-ig.
Mindegyik mintát 3
csepp ásványi olajjal
átfedjük, és mintát át
futtatjuk PCR-n

8. 6. Western blotting
SDS-PAGE electrophoresis
Nedvesítse meg a membránt
MetOH-ban és a szivacsot és
a szűrőpapírt a transzfer
pufferben.
Hozzon létre egy átviteli
„szendvicset”.
Mozgassa a szendvicset az
átviteli berendezésbe, és
adjon transzfer puffert a
készülékhez. Ezután helyezze
be az elektródákat át 45-90
percig.
Blokkolja a membránt 5% -os
sovány tejjel TBST-ben 1
órán át.
Az elsődleges antitestet 5%
BSA-ban adjuk hozzá, és
rázógépen inkubáljuk.
A membránt TBST-vel
háromszor mossuk, majd a
konjugált másodlagos
antitest ajánlott hígításával
inkubáljuk a blokkoló
pufferben
Ismételje meg a mosási
eljárást.
A membránt a HRP-vel jelölt
antitest által jelzett jel
alapján detektáljuk.
Source: https://www.creative-diagnostics.com/Sample-Gel-Preparation.htm

9. A NAFLD zsírsav-in vitro modelljei
1. Adjuk hozzá semleges közeget.
2. Adjunk hozzá közeget és 99% metanolt.
3Adjunk hozzá közeget és 0,33 mM PA-oldatot.
4. Adjunk hozzá közeget és 0.66mM PA oldatot.
5. Adjunk hozzá közeget és 0.66mM OA oldatot.
6. Adjunk hozzá közeget és 1.32mM OA oldatot.
Inkubáljuk 24 órán át, és végezzük a fent említett vizsgálatokat

10. Az acetaminofen által kiváltott hepatotoxicitás
1. . Adjuk hozzá semleges közeget.
2. . Adjuk hozzá közeget és 100% DMSO.
3. Adjuk hozzá közeget és 0.5 mM APAP oldatot.
4. Adjuk hozzá közeget és 5 mM APAP oldatot.
5. Adjuk hozzá közeget és 10 mM APAP oldatot.
6. Adjuk hozzá közeget és 20 mM PA oldatot.
Inkubáljuk 2, 6 és 24 óráig, és végezzük a fent említett vizsgálatokat.

11. Amiodaron és tamoxifen indukált hepatotoxicitás
1. Adjuk hozzá semleges közeget.
2. Adjuk hozzá közeget és 99% MetOH
3. Adjuk hozzá közeget és 10 μM amiodaron oldatot.
4. Adjuk hozzá közeget és 20 μM amiodaron oldatot.
5. Adjuk hozzá közeget és 5 μM tamoxifen oldatot.
6. Adjuk hozzá közeget és 10 μM tamoxifen oldatot.
Inkubáljuk 24 órán át és 48 óráig, és végezzük a fent említett vizsgálatokat.