1. Projekt ImproveMED
Improved Medical Education in Basic Sciences for Better Medical Practicing
Application form ID: HUHR/1601/4.1./0009
Interreg V-A Programa suradnje Mađarska-Hrvatska 2014.-2020
Mjerenje krvnog protoka i reaktivnosti krvnih žila u mikrocirkulaciji kože
metodom laser Dopplera
(eng. Laser Doppler Flowmetry - LDF)
Ana Stupin
2. Sadržaj
1 UVOD...................................................................................................................................................3
1.1 Metoda mjerenja protoka metodom laser Dopplera (eng. Laser Doppler Flowmetry - LDF) ......3
1.1.1 Post-okluzivna reaktivna hiperemija.....................................................................................5
1.1.2 Iontoforeza acetilkolina i natrijevog nitroprusida.................................................................8
1.1.3 Lokalna toplinska hiperemija (LTH) ....................................................................................9
1.1.4 Lokalno hlađenje.................................................................................................................10
2 SNIMANJE KRVNOG PROTOKA U MIKROCIRKULACIJI KOŽE METODOM LASER
DOPPLERA...............................................................................................................................................12
2.1 Postavke mjerenja......................................................................................................................12
2.2 Spremanje / Učitavanje datoteka mjerenja..................................................................................13
2.2.1 Spremanje datoteka.............................................................................................................13
2.2.2 Učitavanje datoteka.............................................................................................................13
2.3 Oznake (Markeri).......................................................................................................................13
2.4 Područje interesa (eng. Region of Interest, ROI).......................................................................14
3 PROTOKOL ZA LDF MJERENJE POSTOKLUZIVNE REAKTIVNE HIPEREMEIJE
(PORH) MIKROCIRKULACIJE KOŽE I ANALIZA PODATAKA.................................................15
3.1 Protokol.......................................................................................................................................15
3.2 Analiza podataka.........................................................................................................................17
3.3 Iskustva iz Laboratorija za kliničku fiziologiju i fiziologiju sporta Medicinskog fakulteta
Sveučilišta Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku ....................................................................................20
4 LITERATURA..................................................................................................................................24
3. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
3
1 UVOD
U zadnjih nekoliko desteljeća razvijen je velik broj funkcionalnih metoda u svrhu
istraživanje i mjerenje (pato)fiziološke funkcije endotela u ljudi (Flammer i Luscher, 2010;
Ludmer i sur, 1986). Očekivano, razvijene metode intenzivirale su istraživanja u području
vaskularne fiziologije i patofiziologije, ali još uvijek nisu implementirane kao koristan
dijagnostički alat u svakodnevnoj kliničkoj praksi. Sve metode za proučavanje endotelne funkcije
dizajnirane su na način da omoguće uvid u vaskularnu/endotelnu funkciju na različitim mjestima
(vaskularnim slivovima) i u različitim vrstama krvnih žilama (provodne, otporničke krvne žile,
mikrocirkulacija). Ranije razvijene metode bile su invazivne (npr. intrakoronarna infuzija
acetilkolina), dok su novije metode ipak manje invazivne te su se usmjerile na proučavanje
periferne cirkulacije (cirkulacija podlaktice) kao surogata sistemske cirkulacije (Linder i sur, 1990;
Panza i sur, 1990; Celermajer i sur, 1992). Kao što je i očekivano, svaka od tih metoda ima svoje
prednosti i nedostatke, a niti jedna od njih ne predstavlja apsolutni zlatni standard za istraživanje
endotelne funkcije, kako u makro- tako i u mikrocirkulaciji.
Endotel krvnih žila ima kritičnu ulogu u održavanju vaskularnog tonusa, te su promjene
vaskularnog protoka rezultat složenih promjena koje se događaju upravo u endotelu. Važnost ove
funkcije endotela očituje se u tome što se termin “endotelna funkcija” najčešće koristi kako bi se
opisala sposobnost endotela da otpušta vazoaktivne supstance i na taj način regulira protok krvi
(Drexler, 1997). I upravo zbog toga glavni princip po kojem krvne žile funkcioniraju je da se
zdrave krvne žile/zdrav endotel normalno dilatira, a da bolesne krvne žile/endotel imaju
poremećenu vazodilataciju. Zbog toga se sve metode za procjenu endotelne funkcije temelje na
sposobnosti endotela da odgovori (vazodilatacijaom ili vazokonstrikcijom) na specifični stimulus
(vaskularna okluzija, farmakološki vazodilatatori, zagrijavanje itd.) (Flammer i sur, 2012).
1.1 Metoda mjerenja protoka metodom laser Dopplera (eng. Laser Doppler Flowmetry -
LDF)
Zbog svoje pristupačnosti koža predstavlja pogodno mjesto za ispitivanje funkcije humane
mikrocirkulacije i u zdravlju i u različitim vrstama bolesti (Roustit i Cracowski, 2012). U zadnja
4. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
4
tri desteljeća razvijeno je nekoliko jednostavnih i neinvazivnih metoda koje su dizajnirane u svrhu
ispitivanja funkcije periferne mikrocirkulacije u različitim stanjima, uključujući hipertenziju
(Antonios i sur, 1999; Feihl i sur, 2006), pretilost (Levy i sur, 2008), dijabetes (Chang i sur, 1997;
Yamamoto-Suganuma i Aso, 2009), starenje, bubreže bolesti (Kruger i sur, 2006) itd. Ipak, još je
uvijek otvoreno pitanje je li mikrovaskularna funkcija kože reprezentativan i primjeren pokazatelj
mikrovaskularne funkcije drugih organa.
Jedna od često korištenih tehnika za proučavanje mikrovaskularne funkcije
mikrocirkulacije je laser Doppler (LD). LD tehnika se temelji na procjeni veličine protoka u
mikrocirkulaciji kože pomoću laserske zrake koja se reflektira od eritrocita prisutnih u
mikrocirkulaciji i time mijenja svoju valnu duljinu (učinak Dopplera) (Stern, 1975). Računalni
program određuje veličinu protoka, koji prije predstavlja indeks perfuzije (engl. flux) nego izravnu
mjeru protoka u mikrocirkulaciji kože. Perfuzija se obično izražavaju u arbitrarnim jedinicama
(perfuzijske jedinice, PU, 1 PU=10 mV) ili kao CVC (indeks perfuzije podijeljen s vrijednosti
arterijskog tlaka, mV/mmHg) (Stern, 1975). Na temelju LD tehnike, najprije je razvijena metoda
mjerenja protoka (engl. laser Doppler flowmetry, LDF) koja mjeri protok krvi u jednoj točki, a
time i u malom volumenu, ali uz visoku frekvenciju uzorkovanja. Često spominjano ograničenje
ove metode izražena je prostorna varijabilnost koja nastaje zbog regionalne heterogenosti perfuzije
kože i mjerenja protoka krvi u jednoj točki (Roustit i sur, 2010). Ipak, pokazalo se da se to
ograničenje lako može otkloniti ako se mjesto postavljanja laserske sonde označi te se ona postavi
uvijek na isto mjesto, posebice ako se motoda koristi u ponavljajućim mjerenjima. Linearni odnos
između laserskog Doppler signala i mikrovaskularnog protoka pokazan je u rasponu od 0 do 300
mL/min po 100 g tkiva (Ahn i sur, 1987). Međutim, ova metoda ne daje točnu mjeru protoka (tj.
mL/min) kao što se je slučaj kod korištenja venske pletizmografije. Stoga se LDF, umjesto kao
metoda za točno mjerenje veličine krvnog protoka u mikrocirkulaciji kože, najčešće koristi za
procjenu mikrovaskularne reaktivnosti u odgovornu na različite podražaje (vaskularna okluzija,
vazoaktivni lijekovi, zagrijavanje kože itd.) Najčešće korišteni testovi mikrovaskularne
reaktivnosti u mikrocirkulaciji kože su: post-okluzivna reaktivna hiperemija (PORH), iontoforeza
vazoaktivnih lijekova i izlaganje kože promjenama temperature – zagrijavanje ili hlađenje
(Cracowski i sur, 2006).
6. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
6
važnu ulogu u nastanku PORH-a ima EDHF (Lorenzo i Minson, 2007), dok uloga prostaglandina
još uvijek nije u potpunosti razjašnjena (Dalle-Ave i sur, 2004; Medow i sur, 2007). Nadalje,
pokazano je da inhibicija eNOS-a znatno ne utječe na nastanak PORH-a u mikrocirkulaciji kože,
što ukazuje na činjenicu da u normalnim uvjetima PORH nije ovisan o utjecaju NO-a (Wong i sur,
2003). Međutim, nedavne studije upućuju na to da inhibicija COX-a razotkriva potencijalnu
ovisnost PORH-a o NO-u u humanoj kožnoj mikrocirkulaciji (Medow i sur, 2007). Ipak, unatoč
očitoj ulozi o endotelu ovisnih vazoaktivnih medijatora u nastanku PORH-u, preporuka je da se
ova metoda koristi za procjenu i testiranje mikrovaskularne reaktivnosti općenito, a ne kao direktan
test za procjenu mikrovaskularne endotelne funkcije (Roustit i Cracowski, 2012).
Tijekom analize PORH-a, mogu se kvantificirati različiti parametri. Jedan od najčešće
korištenih parametara je vršna hiperemija (eng. peak hyperemia), koja može biti izražena kao sirov
podatak ili kao funkcija bazalnog protoka (npr. površina ispod krivulje, vršni protok minus bazalni
protok, ili relativna promjena između vršnog i bazalnog protoka izražena kao postotak [(vršni
protok - bazalni protok) ⁄ bazalni protok] x 100. Vršni protok može se također izraziti u odnosu na
tzv. maksimalnu vazodilataciju koja se postiže zagrijavanjem kože na 42 C ili više (Charkoudian,
2003). Vrijeme do vršne perfuzije (engl. time to peak) još je jedan parameter koji se može
kvantificirati tijekom PORH-a je, ali još uvijek nije utvrđen njegov značaj kao markera
mikrovaskularne reaktivnosti.
Slika 2. Parametri koji se kvantificiraju prilikom analize PORH-a (Roustit i Blaise, 2010;
Roustit i Cracowski, 2012).
7. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
7
Kada se PORH mjeri LDF-om u jednoj točki, inter-dnevna je reproducibilnost PORH-a
varijabilna, a ovisi o mjestu na koži na koje je postavljena sonda, o načinu interpretacije podataka,
i o bazalnoj temepreaturi kože. Najveći broj studija koji je istraživao reproducibilnost PORH-a
ispitivao je reaktivnost mikrocirkulacije volarne strane podlaktice, a rezultati su nekonzistentni.
Reproducibilnost je bila izvrsna (CV od 6% do 22%) kada je mjesto snimanja bilo označeno pa je
sonda postavljana svaki dan na isto mjesto (Yvonne-Tee i sur, 2005). Ipak, reproducibilnost je bila
samo dobra (eng. fair to good) (CV oko 20%) kada je sonda postavljana na otprilike isto mjesto,
ali s punom manjom preciznošću (Agarwal i sur, 2010), dok je reproducibilnost bila loša ako se
mjesto postvljanja sonde nasumično biralo iz dana u dan (CV > 40%) (Roustit i sur, 2010). Dakle,
važno je naglasiti kako je postavljanje sonde na točno isto mjesto na koži ključan čimbenik koji
poboljšava inter-dnevnu reproducibilnost PORH-a (izvrsna).
Tijekom snimanja mikrovaskularne reaktivnosti uporabom ove metode treba voditi računa
o homogenizaciji kako kožne tako i temperature okoline (sobe), jer upravo temperatura ima
ključnu ulogu u regulaciji veličine bazalnog protoka u mikrocirkulaciji kože (Roustit i sur, 2010a).
Mjerenja su pokazala prihvatljivu ponovljivost (reproducibilnost) kada je temperatura kože
tijekom snimanja bila održavana na 33 °C (Roustit i sur, 2010).
Uz ovu metodu vezana je izražena heterogenost u dizajnu mjerenja u različitim studijama,
posebno u trajanju vaskularne okluzije (od 1 do 15 minuta) (Yvonne-Tee i sur, 2008) i različitim
tlakom manžete kojom se izaziva okluzija (u rasponu od 160 do 220 mmHg) (Keymel i sur, 2010).
Zbog analogije sa metodom protokom posredovane vazodilatacije (eng. flow-mediated dilation,
FMD) brahijalne arterije koja je standardizirana metoda za procjenu endotelne funkcije u velikim
(provodnim) krvnim žilama, u istraživanjima je najčešće korištena vaskularna okluzija u trajanju
od 5 minuta. Međutim, obično se koriste i kraći periodi vaskularne okluzije, budući da dulja
vaskularna okluzija doprinosi akumulaciji metabolite ishemije (npr. adenozina) koji bi
potencijalno mogli pridonijeti hiperemijskom protoku krvi nakon dužih perioda vaskularnog
okluzije.
Dakle, PORH mjeren LDF-om široko je korišten test koji daje opći (cjelokupan) indeks
mikrovaskularne funkcije, koji je kombinacija neuralnog aksonskog refleksa, COX-ovisnih puteve
i vjerojatno učinaka EDHF-a. Ipak, prilikom korištenja ovog testa treba biti oprezan kako bi se
8. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
8
izbjegla metodološka pristranost ili greška u mjerenju (trajanje okluzije, bazalna temperatura kože
i mjesto mjerenja). Dakle, unatoč tome što je PORH u sprezi s LDF-om dobar i široko primjenjivan
alat za procjenu mikrovaskularne reaktivnosti, ova metoda još uvijek zahtijeva standardizaciju.
1.1.2 Iontoforeza acetilkolina i natrijevog nitroprusida
Iontoforeza je metoda za neinvazivnu transdermalnu dostavu vazoaktivnih supstanci
(nabijenih molekula) u mikrocirkulaciju kože upotrebom električne struje male jačine.
Odgovarajuća primjena ove metode ovisi o nekoliko metodoloških čimbenika, uključujući
koncentraciju i pH otopine, jakost primijenjene struje, trajanje iontoforeze i svojstva površine kože
(debljina kože, koža s dlakama ili bez) (Kalia i sur, 2004). U kombinaciji s LDF-om, iontoforeza
acetilkolina (ACh) i natrijevog nitroprusida (SNP) široko je primjenjivan test za procjenu endotel-
ovisne i endotel-neovisne vazodilatacije mikrocirkulacije kože (Cracowski i sur, 2006; Turner i
sur., 2008). Što se tiče mehanizama, studije su pokazalu da aplikacija ACh-a inducira endotel-
ovisnu dilataciju koju pretežno posreduju COX-ovisni metaboliti (iako rezultati još uvijek nisu
jednoznačni) (Durand i sur, 2004; Holowatz i sur, 2005), a NO joj značajno ne doprinosi (Noon i
sur., 1998). Uz vazodilataciju ovisnu o endotelu, primjena ACh također izaziva neuralni aksonski
refleksa (Berghoff i sur, 2002).
Ipak, uz metodu iontoforeze veže se nekoliko metodoloških pitanja:
a) sama struja može inducirati nespecifičnu vazodilataciju koja bi mogla ometati vazodilatacijsku
potentnost primijenjene supstance, a smatra se da ovisi o isporučenom električnom naboju i uzorku
po kojem se struja isporučuje (za sličan naboj, ponavljane aplikacije izazivaju više nespecifične
vazodilatacije nego kontinuirana ionoforeza) (Durand i sur., 2002);
b) nespecifična vazodilatacija uzrokovana strujom također može ovisiti o česticama medija koji je
korišten za otapanje i razrjeđivanje primijenjene vazoaktivne supstance (npr. voda iz slavine,
destilirana voda, deionizirana voda, fiziološka otopina); destilirana voda uzrokuje izraženiju
nespecifičnu vazodilataciju uzrokovanu strujom nego fiziološka otopina (iontoforeza ACh-a ili
SNP-a izaziva sličnu vazodilataciju u mikrocirkulaciji kože, neovisno jesu li ACh ili SNP otopljeni
i razrjeđeni u destiliranoj vodi ili fiziološkoj otopini) (Farrell i sur., 2002)
9. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
9
c) prirodna otpornost kože također može utjecati na isporuku vazoaktivne supstance, te se kao dio
dobre prakse preporučuje smanjiti otpornost kože na mjestu aplikacije blagim uklanjanjem
površnog sloja epidermisa ljepljivom trakom ili alkoholom (Turner i sur, 2008);
d) na reproducibilnost ACh- ili SNP-ovisne vazodilatacije utječe i prostorna varijabilnost (paziti
da mjesto aplikacije bude isto kod ponavljanih mjerenja) (Agarwal i sur, 2010; Blaise i sur, 2010);
e) vazodilatacija ovisi o samom mjestu iontoforeze, budući da na primjer SNP-inducirana dilatacija
nije mogla biti izazvana na volarnoj, već samo na dorzalnoj strani prsta (Roustit et al. 2009).
Sažeto rečeno, iontoforeza ACh-a i SNP-a široko se primijenjuje za procjenu endotel-
ovisne i -neovisne vazodilatacije mikrocirkulacije kože i u zdravlju i bolesti. Međutim, pri
tumačenju rezultata treba uzeti u obzir složenost mehanizama uključenih u te odgovore. Štoviše,
studije koje koriste ionoforezu trebaju biti pažljivo dizajnirane kako bi se smanjila strujom-
inducirana nespecifična dilatacija: upotreba struje niske jačine, fiziološka otopina (radije nego
destilirana voda) bi se trebala koristiti kao medij za otapanje i razrjeđivanje vazoaktivnih substanci,
te prethodno treba mjesto na koži gdje će se vršiti iontoforeza očistiti alkoholom kako bi smanjili
prirodnu otpornost kože što je više moguće.
1.1.3 Lokalna toplinska hiperemija (LTH)
Lokalna toplinska hiperemija (LTH) predstavlja periferni mikrovaskularni odgovor kože
na lokalno zagrijavanje koji je posredovan zajedničkim učinkom neuralnog aksonskog refleksa i
o NO-u ovisne endotelne vazodilatacije (Cracowski i sur, 2006). LTH je karakteriziran početnom
vršnom hiperemijom (u prvih 5 minuta) koja ovisi o osjetilnim živcima, a zatim održavanim
platoom koji je uglavnom ovisan o NO-u (Minson i sur., 2001). Plato se pojavljuje 20-30 minuta
nakon početka grijanja (Minson, 2010) a kada se period grijanja produlji, opaža se pojava
"odstranjivanja" (tj. sporo vraćanje perfuzije prema osnovnoj liniji bazalnog protoka).
Zbog ovih dviju nezavisnih faza LTH, tijekom analize podataka mogu se kvantificirati
različiti parametri. Najčešće korišteni parametri za interpretaciju LTH-a su vršna perfuzija
(vazodilatacija ovisna o aksonskom refleksu) i plato perfuzije (vazodilatacija ovisna o NO-u).
Također, podatci mogu biti izraženi u “sirovom” (eng. row) obliku kao perfuzijske jedinice, ili kao
10. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
10
CVC, koji predstavlja perfuziju u odnosu na bazalni protok ili perfuziju u odnosu na maksimalnu
vazodilataciju. Zanimljivo, vrlo često se kao opći pokazatelj endotelne funkcije koristi površina
ispod krivulje (eng. area under the curve, AUC) čitavog mjerenja, unatoč tome što se na taj način
prikriva utjecaj aksonskog refleksa u toj vazodilataciji (Kruger i sur, 2006).
Slika 3. Lokalna toplinska hiperemija (LTH). (Roustit & Cracowski, 2012)
Reproducibilnost LTH snimane LDF-om značajno ovisi o mjestu postavljanja laserske
sonde (Roustit i sur, 2010). Studije su pokazale da je interdnevna reproducibilnost prihvatljiva
kada se LTH mjeri na prstima šake, ali ne i kada se mjeri na podlaktici (Roustit i Cracowski, 2012).
S druge strane, neki autori su pokazali puno bolju reproducibilnost na podlaktici kada se za
mjerenje koriste tzv. integrativne sonde.
Baš kao i kod snimanja PORH-a, postoji velika heterogenost u dizajnu studija koje koriste
LTH, uključujući temperaturu lokalnog zagrijavanja (42-43 °C) (Johnson i sur, 2010) kao i vrstu
uređaja koji se koristi za zagrijavanje kože (Roustit i Cracowski, 2012). Studije su pokazale da
zdravi ispitanici dobro podnose lokalno zagrijavanje na 44 °C, dok su se ispitanici s poremećenom
mikrovaskularnom funkcijom (npr. sistemska skleroza) žalili na bol ili osjećaj peckanje na mjestu
zagrijavanja.
1.1.4 Lokalno hlađenje
Lokalno hlađenje je drugi temperaturni podražaj koji se koristi u sprezi s LDF-om. U
istraživanjima se koriste različite metode hlađanja uključujući uranjanje ruke ili prsta u hladnu
11. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
11
vodu (Maver i Strucl, 2000), prislanjanje uložaka za zamrzavanje na kožu (Cankar i Finderle,
2003) ili korištenje ugljičnog dioksida (Lutolf i sur, 1993). Zbog svoje jednostavnosti, najčešće
korištena metoda hlađenja je uranjanje u hladnu vodu kako kod zdravih, tako i kod bolesnih
ispitanika (Foerster i sur, 2007).
Lokalno hlađenje kože potiče početnu vazokonstrikciju, za kojom slijedi prolazna
vazodilatacija, i na kraju produljena vazokonstrikcija (Johnson i Kellogg, 2010). Pokazano je da
početna vazokonstrikcija ovisi o norepinefrinu, a produljena vazokonstrikcija uključuje i
norepinefrin i inhibiciju NO sustava (Johnson i Kellogg, 2010). Rezultati su pokazali da ova
metoda ima najbolju reproducibilnost kada protokol hlađenja traje 30 minuta na 15 °C (Roustit i
sur. 2010c).
Slika 4. Lokalno hlađenje. (Roustit & Cracowski, 2012)
13. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
13
2.2 Spremanje / Učitavanje datoteka mjerenja
2.2.1 Spremanje datoteka
Mjerenje možete spremiti tek kad je snimanje završeno. Izaberite File Save ili Save As,
ili kliknite ikonu na alatnoj traci kako biste sačuvali datoteku.
2.2.2 Učitavanje datoteka
Kako biste učitali (otvorili) ranije snimljeno mjerenje (u posebnom preglednog prozoru),
izaberite File Open ili kliknite ikonu na alatnoj traci. Popis nedavno korištenih datoteka
bit će prikazan u izborniku File Menu.
Da biste učitali prethodno mjerenje za praćenje dodavanja, odaberite Monitor Monitor
Monitoring Append.
2.3 Oznake (Markeri)
Oznake vam omogućuju postavljanje točaka interesa unutar mjerenja.
• Dodajte oznaku pomoću Edit Markers Add menu, ikone na alatnoj traci ili pritiskom
na tipku Ins. Nakon odabira, kliknite lijevi klik na prozor za mjerenje / pregled na mjestu gdje
želite dodati oznaku. Nakon dodavanja oznake, pojavljuje se uređivač oznaka koji vam omogućuje
promjenu oznaka, vremena itd. Novi oznaka postaje aktivna oznaka.
• Da biste izbrisali aktivnu oznaku odaberite Edit Marker Delete ili ikonu .
• Za brisanje svih oznaka, odaberite Edit Markers Delete All.
14. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
14
2.4 Područje interesa (eng. Region of Interest, ROI)
Za izvršavanje većine analiza, uklanjanje segmenta s artefaktima ili spremanje segmenta u
drugu datoteku, mora se stvoriti područje interesa (ROI) za postavljanje početnih i završnih točaka
segmenta podataka.
• Za dodavanje ROI-a odaberite Edit Region of Interest Add menu, ikonu na alatnoj
traci ili pritisnite Shift + Ins na tipkovnici. Napravite jedan lijevi klik u prozoru mjerenja / pregleda
na mjesto na kojem želite početak ROI-ja. Pojavit će se okvir za uređivanje ROI-ja koji vam
omogućuje promjenu entiteta ROI-ja. Kada se klikne OK, novi ROI postaje aktivni ROI.
• Za kasnije uređivanje ROI-ja koristite Edit Region of Interest Edit menu ili pritisnite
Shift + F2. Možete i dvaput kliknuti na ROI na sredini područja ROI na gornjoj traci iznad zaslona
grafikona.
• Granice aktivnih ROI-ja možete premjestiti postavljanjem pokazivača miša preko početnih ili
završnih linija; držite lijevu tipku miša i povucite liniju u drugu poziciju.
• Za brisanje aktivnog ROI-ja odaberite Edit Region of Interest Delete ili ikonu na alatnoj
traci .
• Za brisanje svih ROI-ja odaberite Edit Region of Interest Delete All.
• Za uklanjanje segmenta s artefaktima ili za spremanje segmenta mjerenja u drugu datoteku,
dodajte ROI koji sadrži segment i odaberite Edit Active ROI menu.
15. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
15
3 PROTOKOL ZA LDF MJERENJE POSTOKLUZIVNE REAKTIVNE
HIPEREMEIJE (PORH) MIKROCIRKULACIJE KOŽE I ANALIZA PODATAKA
Izvor: Laboratorij za kliničku fiziologiju i fiziologiju sporta, Medicinski fakultet Osijek.
Korišten uređaj: moorVMS-LDF Monitor, Moor Instruments Limited, Millwey, Axminster, Devon,
EX13 5HU, UK.
3.1 Protokol
Protok u mikrocirkulaciji određujemo uporabom neinvazivne metode laser Doppler
flowmetrije, LDF (MoorVMS-LDF, Axminster, UK). Mjeri se promjena u protoku krvi tijekom
reaktivne hiperemije koja uslijedi nakon prekida protoka. Reaktivna je hiperemija složeni
mikrovaskularni odgovor na kratkotrajnu ishemiju gdje endotel i njegov odgovor na razne
relaksacijske ili konstrikcijske čimbenike podrijetlom iz endotela ima značajnu ulogu.
Mjerenje se izvodi u prostoriji pri sobnoj temperaturi (23.5±0.5 °C). Pacijent treba proći
kroz 30 min aklimatizacije u prostoriji u kojoj se obavlja mjerenje kako bi se izbjegle promjene u
protoku krvi koje mogu nastati kao odgovor na promjene temperature prilikom prikupljanja
podataka. Prilikom mjerenja su ispitanici u supiniranome ležećemu položaju. Sonda se uređaja
pričvrsti na volarnu stranu podlaktice ispitanika, 13-15 cm iznad ručnoga zgloba kako bi se
izbjegle vidljive vene pomoću adhezivnog držača koji je omogućio proizvođač uređaja.
Dogovorno se odabire mjesto na podlaktici na kojemu uređaj pokazuje protok između 5 i 10
arbitrarnih jedinica (perfusion units, PU), kako bi mjerenja bila ujednačena. Ukoliko se rade
ponavljana ispitivanja na pojedinome ispitaniku, potrebno je označiti mjesto na koje je bila
pričvršćena sonda uređaja kako bi se izbjegle promjene u protoku koje su posljedica heterogenosti
krvožilne mreže podlaktice. Kako bi se izbjegla pojava artefakata u snimkama, ruka ispitanika
postavljena je u jastuk kako se ruka ne bi micala budući da je uređaj izrazito osjetljiv i na najmanje
pokrete. Iz istoga razloga ispitanika treba uputiti da mora strogo mirovati prilikom mjerenja kako
bi se izbjegla pojava artefakata.
Mjerenje započinje 5-minutnim snimanjem bazalnoga protoka. Nakon toga se manžeta
postavljena oko nadlaktice napuše 30-50 mmHg iznad vrijednosti sistoličkoga tlaka ispitanika
kako bi se zaustavi protok u brahijalnoj arteriji. Prva okluzija traje 1 min. Nakon toga se naglo
16. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
16
otpušta zrak iz manžete i prati nastala reaktivna hiperemija na monitoru. Po završetku nastavlja se
10 min snimanja bazalnoga protoka nakon kojega uslijedi druga okluzija u trajanju od 2 min.
Nakon otpuštanja manžete poslije druge okluzije, nastavlja se snimanje 10 min bazalnoga protoka.
Potom uslijedi treća okluzija u trajanju od 3 min, nakon koje se nastavi snimanje 10 min bazalnoga
protoka. Nakon toga je mjerenje završeno.
Shematski prikaz protokola:
17. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
17
3.2 Analiza podataka
Promjene u protoku krvi izražene su u arbitrarnim jedinicama (PU). Kako bi se odredila
relativna promjena protoka prilikom post-okluzivne hiperemije, podaci se izražavaju kao ‘površina
ispod krivulje’ (area under the curve, AUC) tijekom bazalnoga protoka, okluzije te reperfuzije.
• Otvorite snimljeno mjerenje (Open a Recorded Session) - otvara se prozor preglednika u kojem
se mogu odabrati prethodno snimljene datoteka moorVMS koje je potrebno analizirati.
• Analiza započinje analizom 1-min PORH, zatim 2-min PORH ten a kraju 3-min PORH
• Za 1-min PORH dodajemo ROI ( ) u trajanju od točno 1 minute, zatim odemo na ikonicu
Statistika , te očitamo broj pod Area koji predstavlja AUC za bazalni protok u trajanju od 1
minute.
18. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
18
• Isti postupak ponovimo za period okluzije (1 min) i reprfuzije (1 min)
19. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
19
• Budući da protok ne dostiže nultu vrijednost, čak i kada je perfuzija odsutna, vrijednosti protoka
izražene su u obliku postotka u odnosu na neki određeni uspoređivač (u ovom slučaju bazalni
protok). Odredili smo postotak protoka tijekom okluzije i reperfuzije u odnosu na bazalni protok.
Konačan rezultat izražen je kao razlika postotka promjene protoka tijekom okluzije i reperfuzije u
odnosu na bazalni protok (R-O).
• Isti postupak ponovimo za 2-min PORH I 3-min PORH, s tim da za 2-min PORH označavamo
ROI u trajanju od 2 minute, a za 3-min PORH ROI u trajanju od 3 minute.
20. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
20
3.3 Iskustva iz Laboratorija za kliničku fiziologiju i fiziologiju sporta Medicinskog
fakulteta Sveučilišta Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku
Rasic L, Cavka A, Bari F, Drenjancevic I (2014). Reproducibility of post-occlusion reactive
hyperaemia assessed by laser Doppler flowmetry in young healthy women. Periodicum
Biologorum 116(1):77-82.
Abstract
The aim of this study was to evaluate the day-to-day and inter-subject reproducibility of post
occlusive reactive hyperaemia (PORH) measured by laser Doppler flowmetry (LDF) in young
healthy female subjects. In addition, we looked for most reproducible form of data presentation.
10 healthy female subjects were tested 4 times during 2 weeks. Blood flow was measured during
baseline, vascular occlusion (1, 2 and 3 min) and PORH. Parameters studied were: increase inflow
during vascular reperusion (R), difference between % of flow change during repofusion and
occlusion (delta R-O) in relation to baseline, time-to-peak (TtP) and latency time of the flow to go
back to baseline levels (LT). Coefficient of variation (CV; with 95% confidence interval) and
intraclass correlation coefficient (ICC; with 95% confidence interval) were calculated for each
parameter. CVs of 10%, 10-25% and >= 25% were considered good, moderate and poor
reproducibility.An ICC value of < 0.40, 0.40-0.75 and > 0.75 considered as poor, fair-to-good and
excellent reproducibility.
None of the parameters showed significant differences across the measurements. Obtained CVs
for all parameters have shown moderate reproducibility (10-25%), except CV for TtP which was
>= 25%. R-O was the most reproducible parameter of reactive hyperemia, indicated by the lowest
CV and highest ICC (0.60), which is considered fair-to-good reproducibility.
The results of this study suggest that parameter R-O is fair-to-good reproducible for LDF
assessment of PORH in young healthy women and it can be a useful and reliable noninvasive
clinical measurement index of microvascular function.
Keywords: laser Doppler flowmetry; rnicrocirculation; endothelium
22. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
22
Cavka A, Cosic A, Jukic I, Jelakovic B, Lombard JH, Phillips SA, Seric V, Mihaljevic I,
Drenjancevic I. The role of cyclo-oxygenase-1 in high-salt diet-induced microvascular
dysfunction in humans. J Physiol. 2015 Dec 15;593(24):5313-24. doi: 10.1113/JP271631.
Key points:
Recent studies have shown that some of the deleterious effects of a high-salt (HS) diet are
independent of elevated blood pressure and are associated with impaired endothelial function.
Increased generation of cyclo-oxygenase (COX-1 and COX-2)-derived vasoconstrictor factors and
endothelial activation may contribute to impaired vascular relaxation during HS loading. The
present study aimed to assess the regulation of microvascular reactivity and to clarify the role of
COX-1 and COX-2 in normotensive subjects on a short-term HS diet. The present study
demonstrates the important role of COX-1 derived vasoconstrictor metabolites in regulation of
microvascular blood flow during a HS diet. These results help to explain how even short-term HS
diets may impact upon microvascular reactivity without changes in blood pressure and suggest
that a vasoconstrictor metabolite of COX-1 could play a role in this impaired tissue blood flow.
Abstract:
The present study aimed to assess the effect of a 1-week high-salt (HS) diet on the role of cyclo-
oxygenases (COX-1 and COX-2) and the vasoconstrictor prostaglandins, thromboxane A2 (TXA2
) and prostaglandin F2α (PGF2α ), on skin microcirculatory blood flow, as well as to detect its
effect on markers of endothelial activation such as soluble cell adhesion molecules. Young women
(n = 54) were assigned to either the HS diet group (N = 30) (∼14 g day(-1) NaCl ) or low-salt (LS)
diet group (N = 24) (<2.3 g day(-1) NaCl ) for 7 days. Post-occlusive reactive hyperaemia (PORH)
in the skin microcirculation was assessed by laser Doppler flowmetry. Plasma renin activity,
plasma aldosterone, plasma and 24 h urine sodium and potassium, plasma concentrations of TXB2
(stable TXA2 metabolite) and PGF2α , soluble cell adhesion molecules and blood pressure were
measured before and after the diet protocols. One HS diet group subset received 100 mg of
indomethacin (non-selective COX-1 and COX-2 inhibitor), and another HS group subset received
200 mg of celecoxib (selective COX-2 inhibitor) before repeating laser Doppler flowmetry
measurements. Blood pressure was unchanged after the HS diet, although it significantly reduced
after the LS diet. Twenty-four hour urinary sodium was increased, and plasma renin activity and
plasma aldosterone levels were decreased after the HS diet. The HS diet significantly impaired
PORH and increased TXA2 but did not change PGF2α levels. Indomethacin restored
microcirculatory blood flow and reduced TXA2 . By contrast, celecoxib decreased TXA2 levels
but had no significant effects on blood flow. Restoration of of PORH by indomethacin during a
HS diet suggests an important role of COX-1 derived vasoconstrictor metabolites in the regulation
of microvascular blood flow during HS intake.
23. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
23
Cavka A, Cosic A, Grizelj I, Koller A, Jelaković B, Lombard JH, Phillips SA, Drenjancevic
I. Effects of AT1 receptor blockade on plasma thromboxane A2 (TXA2) level and skin
microcirculation in young healthy women on low salt diet. Kidney Blood Press Res.
2013;37(4-5):432-42. doi: 10.1159/000355723.
Abstract
OBJECTIVE: To determine the effect of AT1 receptor antagonism on skin microcirculation and
plasma level of thromboxane A2 (TXA2).
METHODS: Healthy women (n=20) maintained 7 days low salt (LS) diet (intake <40 mmol
Na/day) without (LS) or together with 50 mg/per day of losartan (a selective AT1 receptor
inhibitor) (LS diet+losartan group). Laser Doppler flowmetry (LDF) measurements of changes in
post occlusive hyperemic blood flow, plasma concentration of stable TXA2 metabolite
thromboxane B2 (TXB2) and plasma renin activity (PRA) aldosterone concentration, electrolytes
(Na(+), K(+)), as well as blood pressure and heart rate were determined before and after study
protocols.
RESULTS: PRA and aldosterone increased significantly after 7 days of both LS diet and LS
diet+losartan. LS diet or LS diet+losartan administrations had no significant effect on post-
occlusion hyperemia While there was no change in TXB2 after LS diet TXB2 significantly
increased after one week of LS+losartan compared to control levels (cTXB2 pg/mL control
101±80 vs. LS diet+losartan 190±116, p<0.05).
CONCLUSION: These data suggest that inhibition of AT1 receptors could lead to activation of
AT2 receptors, which maintain hyperemia, despite the increased level of vasoconstrictor TXA2.
These findings also suggest an important role of crosstalk between renin-angiotensin system
(RAS) and arachidonic acid metabolites in the regulation of microcirculation under physiological
conditions.
24. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
24
4 LITERATURA
Agarwal SC, Allen J, Murray A, Purcell IF. Comparative reproducibility of dermal microvascular
blood flow changes in response to acetylcholine iontophoresis, hyperthermia and reactive
hyperaemia. Physiol Meas 31: 1–11, 2010.
Ahn H, Johansson K, Lundgren O, Nilsson GE. In vivo evaluation of signal processors for laser
Doppler tissue flowmeters. Med Biol Eng Comput 25:207–211, 1987.
Antonios TF, Singer DR, Markandu ND, Mortimer PS, MacGregor GA. Structural skin capillary
rarefaction in essential hypertension. Hypertension 33: 998–1001, 1999.
Berghoff M, Kathpal M, Kilo S, Hilz MJ, Freeman R. Vascular and neural mechanisms of ACh-
mediated vasodilation in the forearm cutaneous microcirculation. J Appl Physiol 92: 780–788,
2002.
Blaise S, Hellmann M, Roustit M, Isnard S, Cracowski JL. Oral sildenafil increases skin
hyperaemia induced by iontophoresis of sodium nitroprusside in healthy volunteers. Br J
Pharmacol 160: 1128–1134, 2010.
Cankar K, Finderle Z. Gender differences in cutaneous vascular and autonomic nervous response
to local cooling. Clin Auton Res 13: 214–220, 2003.
Celermajer DS, Sorensen KE, Gooch VM, Spiegelhalter DJ, Miller OI, Sullivan ID, Lloyd JK,
Deanfield JE Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of
atherosclerosis. Lancet. 1992; 340:1111–1115.
Chang CH, Tsai RK, Wu WC, Kuo SL, Yu HS. Use of dynamic capillaroscopy for studying
cutaneous microcirculation in patients with diabetes mellitus. Microvasc Res 53: 121–127, 1997.
Charkoudian N. Skin blood flow in adult human thermoregulation: how it works, when it does not,
and why. Mayo Clin Proc 78: 603–612, 2003.
Cracowski JL, Minson CT, Salvat-Melis M, Halliwill JR. Methodological issues in the assessment
of skin microvascular endothelial function in humans. Trends Pharmacol Sci 27: 503–508, 2006.
25. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
25
Dalle-Ave A, Kubli S, Golay S, Delachaux A, Liaudet L, Waeber B, Feihl F. Acetylcholine-
induced vasodilation and reactive hyperemia are not affected by acute cyclo-oxygenase inhibition
in human skin. Microcirculation 11: 327–336, 2004.
Drexler H. Endothelial dysfunction: clinical implications. Prog Cardiovasc Dis 1997; 39:287-324.
Durand S, Fromy B, Bouye P, Saumet JL, Abraham P. Current-induced vasodilation during water
iontophoresis (5 min, 0.10 mA) is delayed from current onset and involves aspirin sensitive
mechanisms. J Vasc Res 39: 59–71, 2002.
Durand S, Tartas M, Bouye P, Koitka A, Saumet JL, Abraham P. Prostaglandins participate in the
late phase of the vascular response to acetylcholine iontophoresis in humans. J Physiol 561: 811–
819, 2004.
Feihl F, Liaudet L, Waeber B, Levy BI. Hypertension: a disease of the microcirculation?
Hypertension 48: 1012–1017, 2006.
Ferrell WR, Ramsay JE, Brooks N, Lockhart JC, Dickson S, McNeece GM, Greer IA, Sattar N.
Elimination of electrically induced iontophoretic artefacts: implications for non-invasive
assessment of peripheral microvascular function. J Vasc Res 39: 447–455, 2002.
Flammer AJ, Anderson T, Celermajer DS, Creager MA, Deanfield J, Ganz P, Hamburg NM,
Lüscher TF, Shechter M, Taddei S, Vita JA, Lerman A. The assessment of endothelial function:
from research into clinical practice. Circulation. 2012 Aug 7;126(6):753-67. doi:
10.1161/CIRCULATIONAHA
Flammer AJ, Luscher TF. Three decades of endothelium research: from the detection of nitric
oxide to the everyday implementation of endothelial function measurements in cardiovascular
diseases. Swiss Med Wkly. 2010; 140:w13122.
Foerster J, Kuerth A, Niederstrasser E, Krautwald E, Pauli R, Paulat R, Eweleit M, Riemekasten
G, Worm M. A coldresponse index for the assessment of Raynaud’s phenomenon. J Dermatol Sci
45: 113–120, 2007.
Holowatz LA, Thompson CS, Minson CT, Kenney WL. Mechanisms of acetylcholine-mediated
vasodilatation in young and aged human skin. J Physiol 563:965–973, 2005.
27. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
27
Medow MS, Taneja I, Stewart JM. Cyclooxygenase and nitric oxide synthase dependence of
cutaneous reactive hyperemia in humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol 293: H425–H432,
2007.
Minson CT, Berry LT, Joyner MJ. Nitric oxide and neurally mediated regulation of skin blood
flow during local heating. J Appl Physiol 91: 1619–1626, 2001.
Noon JP, Walker BR, Hand MF, Webb DJ. Studies with iontophoretic administration of drugs to
human dermal vessels in vivo: cholinergic vasodilatation is mediated by dilator prostanoids rather
than nitric oxide. Br J Clin Pharmacol 45: 545–550, 1998.
Panza JA, Quyyumi AA, Brush JE Jr, Epstein SE. Abnormal endothelium-dependent vascular
relaxation in patients with essential hypertension. N Engl J Med. 1990 Jul 5;323(1):22-7
Roustit M, Blaise S, Cracowski JL. Sodium nitroprusside iontophoresis on the finger pad does not
consistently increase skin blood flow in healthy controls and patients with systemic sclerosis.
Microvasc Res 77: 260–264, 2009.
Roustit M, Blaise S, Millet C, Cracowski JL. Reproducibility and methodological issues of skin
post-occlusive and thermal hyperemia assessed by single-point laser Doppler flowmetry.
Microvasc Res 79:102–108, 2010.
Roustit M, Cracowski JL. Non-invasive assessment of skin microvascular function in humans: an
insight into methods. Microcirculation. 2012 Jan;19(1):47-64. doi: 10.1111/j.1549-
8719.2011.00129.x.
Roustit M, Maggi F, Isnard S, Hellmann M, Bakken B, Cracowski JL. Reproducibility of a local
cooling test to assess microvascular function in human skin. Microvasc Res 79: 34–39, 2010c.
Roustit M, Millet C, Blaise S, Dufournet B, Cracowski JL. Excellent reproducibility of laser
speckle contrast imaging to assess skin microvascular reactivity. Microvasc Res 80: 505–511,
2010a.
Stern MD. In vivo evaluation of microcirculation by coherent light scattering. Nature 254: 56–58,
1975.
28. Stupin Ana Laser Doppler Flowmetry (LDF)
28
Turner J, Belch JJ, Khan F. Current concepts in assessment of microvascular endothelial function
using laser Doppler imaging and iontophoresis. Trends Cardiovasc Med 18: 109–116, 2008.
Wong BJ, Wilkins BW, Holowatz LA, Minson CT. Nitric oxide synthase inhibition does not alter
the reactive hyperemic response in the cutaneous circulation. J Appl Physiol 95: 504–510,
Yamamoto-Suganuma R, Aso Y. Relationship between post-occlusive forearm skin reactive
hyperaemia and vascular disease in patients with Type 2 diabetes – a novel index for detecting
micro- and macrovascular dysfunction using laser Doppler flowmetry. Diabet Med 26: 83–88,
2009.
Yvonne-Tee GB, Rasool AH, Halim AS, Rahman AR. Reproducibility of different laser Doppler
fluximetry parameters of postocclusive reactive hyperemia in human forearm skin. J Pharmacol
Toxicol Methods 52: 286–292, 2005.
Yvonne-Tee GB, Rasool AH, Halim AS, Wong AR, Rahman AR. Method optimization on the use
of postocclusive hyperemia model to assess microvascular function. Clin Hemorheol Microcirc
38:119–133, 2008.
