2. 24 中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 31 No． 3 2011
hIgG1 Fc（ Fc 段） 由复旦大学遗传工程国家重点实验室 hK1 P2，扩增 Fc 段 序 列 引 物 为 Fc P1 和 Fc P2， 种
两
惠赠； 真核表达载体 pcDNA3． 1 / myc- ）
His（ - 为 Invitrogen Linker 分别是 Linker1 和 Linker2，用于重叠延伸 PCR 扩
公司产品； CHO- 细胞为加拿大 ATG cell 公司惠赠； 大
S 增的引物 分 别 是 Linker1- hK1-
F、 Linker1 和 Linker2-F、
肠杆菌 DH5α 感受态细胞为本室保存及制备。 hK1-Linker2，均由广州英伟创津生物科技有限公司合
1． 1． 3 引物 用于扩增 hK1 基因的引物为 hK1 P1 和 成。具体序列及酶切位点见表 1。
表1 实验所用引物及 Linker 序列
Table 1 The Sequences of Primers and Linkers
Primers and Linkers Sequences（ 5' →3'）
hK1 P1 GTGA CTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGG（ Xho I）
hK1 P2 GGAGTTCTCCGCTATGGTG
Fc P1 GAGCCCAAATCTTCTGACAAAAC
Fc P2 ATCT GGATCCTCATTTACCCGGGGACAGGGAG（ BamH I）
Linker1-F GGCTCCGGTGGCGGTTCCGGT
hK1-Linker1 CACCATAGCGGAGAACTCCGGCTCCGGTGGCGGTTCC
Linker2-F GGCTCCGGCGGAGGTGGAAG
hK1-Linker2 CACCATAGCGGAGAACTCCGGCTCCGGCGGAGGTGG
Linker1 GGCTCCGGTGGCGGTTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAGGATCA GAGCCCAAATCTTCTG
GSGGGSGGGGSGGGGS（ amino acid）
Linker2 GGCTCCGGCGGAGGTGGAAGCGGCGGTGGAGGCTCCGGAGGCGGAGGTTCA GAGCCCAAATCTTCTG
GSGGGGSGGGGSGGGGS（ amino acid）
The restriction enzymes sites for Xho I（ CTCGAG） and BamH I（ GGATCC） included in the PCR primers are indicated by underlining． The
sequences which are indicated by underlining and with oblique lines are the same as the 16bp sequence of Fc fragment at its 5' end．
1． 2 方 法 循环，
72℃ 延伸 2 min，胶回收产物。同法扩增出 hK1-
1． 2． 1 融合基因 hK1- Fc 的构建
L- 以重组 hK1 基因 L2- 基因。
Fc
为模板，用引物 hK1 P1 和 hK1 P2 扩增 hK1 基因。PCR 1． 2． 2 真核表达载体 pcDNA3． 1-hK1- Fc 的构建与
L-
条件为 95℃ 预变性 3 min，
95℃ 变性 30 s，
60℃ 退火30s， 鉴定 用 Xho I、BamH I 双 酶 切 hK1- Fc 基 因 和
L-
72℃ 延伸 30s， 个循环，
33 72℃ 延伸 2min。以 pMD18- pcDNA3． 1 表达载体，胶回收后用 T4 DNA 连接酶连接，
T / hIgG1 Fc 为模板，用引物 Fc P1 和 Fc P2 扩增 Fc 基 转化 DH5α 感受态细胞，挑取单克隆进行扩增，提取质
因，
PCR 条件为 95℃ 预变性 3 min，
95℃ 变性 30 s，
56℃ 粒酶切鉴定和测序验证。
退火 30 s，
72℃ 延伸 30 s， 个循环，
33 72℃ 延伸2min，胶 1． 2． 3 稳定细胞株的构建 CHO- 细胞复苏后，
S 培养
回收 PCR 产物。用 PCR 扩增得到的 Fc 基因和人工合 于含 10% FCS 的 DMEM 培养基中。采用脂质体法转
TM
成的 Linker1 为模板， Linker1- 为正向引物， P2
以 F Fc 染细胞，具体方法按照 Lipofectamine 2000 试剂说明
为反向引物扩增出 Linker1- PCR 条件为 95℃ 预变性
Fc， 书进行。重组质粒转染 48 h 后，细胞以 1∶ 2 000 比例转
95℃ 变性 30 s，
3 min， 62℃ 退火 30 s，
72℃ 延伸 30 s，
33 入 100 mm 培养皿中培养，加入终浓度为 700 μg / ml 的
个循环，
72℃ 延伸 2 min，胶回收产物。用上一步扩增 G418 筛选，以转染空载体和未转染组作对照。12 天后
得到的 Linker1- 为模板， hK1-
Fc 以 Linker1 及 Fc P2 为 挑取单克隆转入 96 孔板培养，待细胞长满后依次转入
引物扩增出 5'端带一段与 hK1 基因 3'端 19 bp 序列相 24 孔板， mm 培养皿扩大培养。细胞经冻存复苏及
100
同的 K-Linker1- 基因（ K- Fc） ，
Fc L1- PCR 条件为 95℃ 预 连续传代后，进行检测。
变性 3 min，
95℃ 变性 30 s，
60℃ 退火 30 s，
72℃ 延伸 30 1． 2． 4 hK1- Fc 蛋 白 表 达 的 检 测
L- 重 组 细 胞 用 CD
s， 个 循 环，
33 72℃ 延 伸 2 min， 回 收 产 物。最 后 用
胶 CHO- 无血清培养基培养 3 天后，
A 收集上清， SDS-
经
PCR 扩增得到的 K- Fc 和 hK1 基因为模板，
L1- 使用 hK1 PAGE 后，转印至 PVDF 膜， 脱脂牛奶封闭后，
5% 相继
基因上游引物（ hK1 P1） 和 Fc 基因下游引物（ Fc P2） 扩 加入一抗和二抗（ 1∶ 10 000） 孵育、洗膜后，ECL 发光试
增出 hK1- Fc 融合基因，
L1- PCR 条件为 95℃ 预变性 3 剂显影。 实 验 采 用 了 兔 抗 人 hK1 多 克 隆 抗 体 （ 1 ∶
95℃ 变性 30 s，
min， 67℃ 退火 30 s，
72℃ 延伸 30 s， 个
33 5 000） 及 HRP 标记的鼠抗人 IgG1 Fc 抗体（ 1∶ 2 000） 为
3. 2011， 3）
31（ 邓春平 等： hK1- Fc 融合蛋白在 CHO 细胞中的表达及其活性研究
L- 25
一抗进行检测。
1． 2． 5 hK1- Fc 蛋白表达量的检测
L- 采用逐步降低
血清的方法，驯化稳定细胞株，使之适应 CD CHO 无血
5
清培养。采用批式培养，细胞以 5 × 10 / ml 密度接种于
100 ml 摇瓶中，加入 10 ml CD CHO 无血清培养基，于
37℃ ， CO2 培养箱中， 90 r / min 的转速悬浮培养
5% 以
细胞。每日取样 并 利 用 台 盼 蓝 排 阻 法 测 定 活 细 胞 密
度，细胞存活率并留样，利用 S-2266 底物标准曲线法测
定重组蛋白含量。
1． 2． 6 融合蛋白的表达与纯化 重组细胞于无血清
培养基中培养一定时间后，收集上清， 000r / min 离心、
9
图1 重叠延伸 PCR 构建 hK1- Fc 融合基因
L-
0． 22μm 滤膜过滤后用 Protein A – Agarose 亲和层析柱
Fig． 1 Construction of fusion hK1- Fc
L-
纯化，收集洗脱液。BCA 法测定蛋白浓度。
gene by SOE PCR
1． 2． 7 重组蛋白分子量测定 采用 SDS-PAGE 法和基
质辅助激光解析飞行时间质谱法（ MALDI-TOF-MS） 检
测融合蛋白的分子量。MALDI-TOF- 由中山大学生
MS
命科学学院完成。
1． 2． 8 融合蛋白纯度检测 采用高效液相色谱法
（ HPLC ） 检 测 纯 化 蛋 白 的 纯 度。 条 件 为： TSK
图2 融合基因 hK1- Fc 和 hK1- Fc
L1- L2-
G3000SWXL 柱，流动相为 0． 15mol / L PB， 6． 5，
pH 检测
Fig． 2 PCR products of hK1- Fc and
L1-
波长 280 nm，流速为 1 ml / min，上样量 20 μl。
hK1- Fc gene
L2-
1． 2． 9 融合蛋白的活性测定 测定方法参照周同 M： DNA marker DL2000； 1： hK1- Fc gene； 2： hK1- Fc gene
L1- L2-
［4］
等 的方法。使用 hK1 蛋白特异性生色底物 S-2266 测
定。其活性单位（ U） 的计算公式为： U / ml = 0． 173 6 ×
2． 2 真核表达载体的构建与验证
A405 × 样品稀释倍数。比活性（ U / mg） = 活性（ U / ml） / 对 筛 选 得 到 的 重 组 子 pcDNA3． 1-hK1- Fc 和
L1-
pcDNA3． 1-hK1- Fc 进行 Xho I、
L2- BamH I 双酶切鉴定，
蛋白浓度（ mg / ml） 。
分别得到了一条 1 524bp 和 1 527bp 的产物（ 图 3） ，大
2 结 果 小与预期相符。测序结果证明重组基因序列正确。
2． 1 融合基因的构建
PCR 扩增出 hK1 和 Fc 基因后，通过重叠 PCR 技术
（ gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR） 扩增
出 hK1- Fc 融合基因（ 图 1） 。第一步反应中，
L- Linker1 基
因 3'端 16 bp 序列与 Fc 基因 5'端相同，
作为重叠部分，
依
靠 SOE PCR 将两段基因连接起来； 第二步反应中，引物
hK1-Linker1 的 5'端 19 bp 序列与 hK1 基因 3'端相同，其
3'端 18 bp 序列与 Linker1 的 5'端相同，此步反应得到的
图3 重组质粒 pcDNA3． 1-hK1- Fc 的
L-
K- Fc 基因的 5'端带有一段与 hK1 基因 3'端 19 bp 相
L1-
限制性酶切分析
同的序列， hK1 基因共同作为下一步重叠延伸 PCR 的
与 Fig． 3 Restriction enzyme analysis of
模板，扩增出 hK1- Fc 基 因。同 法 扩 增 hK- Fc 基
L1- L2- recombinant plasmid pcDNA3． 1-hK1- Fc
L-
因。hK1- Fc 基因全长 1 524 bp，
L1- hK1- Fc 基因全长
L2- M： DNA marker； 1： pcDNA3． 1-hK1- Fc digested with Xho I and
L1-
电泳结果与理论值相符（ 图 2） 。
1 527 bp， BamH I； 2： pcDNA3． 1-hK1- Fc digested with Xho I and BamH I
L2-
4. 26 中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 31 No． 3 2011
2． 3 Western blotting 检测融合蛋白的表达 表2 蛋白的活性测定
为检测融合基因在细胞中的表达，采用兔抗人 hK1 Table 2 Analysis of activity of proteins
多克隆抗体（ 图 4a） 及 HRP 标记的鼠抗人 IgG1 Fc 单 样品 比活性（ U / mg）
克隆抗体（ 图 4b） 对细胞内及培养上清中的融合蛋白 hK1 13． 3 ± 0． 14
hK1- Fc
L1- 9． 6 ± 0． 28
进行了检测。结果显示在 60 kDa 附近有一条清晰的条
hK1- Fc
L2- 9． 2 ± 0． 17
带，表明融合蛋白在细胞中得到有效表达。 hK1-Fc 7． 8 ± 0． 16
3 讨 论
利用重组基因技术对现有蛋白质进行改造以改善
其某些方面的性质是生物制药研发的一个重要方向。
重组蛋白质药物的长效化研究是其中一个重要领域，
目的在于减少给药次数，降低药物在体内的波动，提高
图4 hK1 多抗（ a） 和 Fc 单抗（ b） 检测 ［5］
患者依从性等 。其中蛋白质重组融合技术，是通过
融合蛋白的表达
基因工程手段将蛋白 质 药 物 基 因 与 载 体 蛋 白 基 因 融
Fig． 4 Identification of fusion protein by western
合，在同一调控原件的控制下表达目的产物。目前最
blotting with anti-hK1 polyclonal antibody（ a） and anti-
Fc monoclonal antibody（ b）
常用的载体蛋白是免疫球蛋白的 Fc 段和人血清白蛋
1： Supernate of stable cells transfected with hK1- Fc； 2： Lysate of
L1- 白（ human serum albumin，HSA） 。大量研究表明 HSA
stable cells transfected with hK1- Fc； 3： Supernate of stable cells
L1- 或抗体 Fc 融合蛋白，其体内半衰期都有不同程度的延
transfected with hK1- Fc； 4： Lysate of stable cells transfected with
L2- 长，如 rhEPO-Fc［6］、FIX- ［7］、IFNα2b- ［8］、HSA-
Fc Fc
hK1- Fc； 5： Supernate of cells transfected with blank vector； 6：
L2- IFNα2b［9-10］和 rEX4-HSA［11］融合蛋白等。
Lysate of cells transfected with blank vector
然而，HSA 或抗体 Fc 等载体融合蛋白有时会显著
2． 4 hK1- Fc 蛋白表达量检测
L- 降低目的蛋白的生物活性。研究显示，IFNα2b-HSA 融
［12］
分泌表达 hK1- Fc 和 hK1- Fc 蛋白的细胞株
L1- L2- 合蛋白的抗病毒活性只有 IFNα2b 的 1． 1% ，Huang
［13］
于摇瓶中培养 6 天，融合蛋白的表达量在 0． 7 mg / L 以 等 也得到类似的结果； 此外，有研究者利用转铁蛋白
上（ 图 5a） ，在整 个 培 养 周 期 内 活 细 胞 密 度 最 高 可 达 （ Tf） 作为载体蛋白构建了 G-CSF- 融合蛋白，
Tf 其活性
［14］
6
1． 3 × 10 / ml 以上（ 图 5b） ，培养 4 天左右细胞存活率 也只有 G-CSF 的 10% ； 前期研究也显示 hK1- 融
Fc
［4］
下降到 90% 以下（ 图 5c） 。每日细胞密度、活力及蛋白 合蛋白的活性也只有 hK1 的 50% 左右 。这可能是由
表达量见图 5。 于融合蛋白的两部分相互影响使得蛋白不能有效地与
［15- ］
2． 5 hK1- Fc 蛋白的纯化与检测
L- 受体或底物结合进而影响其活性
16
。为此，有研究
细胞培养上清采用亲和层析纯化后，SDS-PAGE 显 者通过在融合蛋白之间插入一段连接肽（ Linker） 以期
［12］
示在 60 kDa 左右有单一条带，经扫描分析纯度在 95% 消除这种影响，来改善融合蛋白的活性。Zhao 等 在
以上（ 图 6） 。HPLC 结果也表明蛋白纯度在 95% 以上 IFNα2b 和 HSA 之间插入不同特征的连接肽，得到一系
（ 图 7） 。飞 行 时 间 质 谱 检 测 显 示，hK1- Fc 和 hK1-
L1- 列融合蛋白，其活性较不含连接肽的蛋白都有不同程
L2- 蛋白的分子量分别为 60． 3kDa 和 60． 9kDa。
Fc 度的提高； 有研究者采用类似方法构建的含连接肽的
2． 6 生物活性检测 G-CSF- Tf 融 合 蛋 白， 活 性 约 是 G-
L- 其 CSF- 的 10
Tf
采用 hK1 蛋白特异性底物 S-2266 测定融合蛋白的 倍
［14］
； Black 等［17］在木聚糖酶 A（ XYLA） 活性区域片段
活性。同时以 hK1 蛋白和 hK1- 蛋白为对照，
Fc 比较其 （ CDS） 与细胞膜结合区域片段（ CBDs） 之间插入连接肽
比活性。结果显示，hK1 的比活性为 13． 3 U / mg，hK1- 构建的融合蛋白（ CDS- CBDs） 活性较 CDS-
L- CBDs 也有
Fc 为 7． 8 U / mg，hK1- Fc 和 hK1- Fc 则分别为 9． 6
L1- L2- 提高； Gustavsson 等
［15］
在脂肪酶和细胞膜结合区片段之
U / mg 及 9． 2 U / mg， hK1- 有所提高（ 表 2） 。
较 Fc 间插入不同长度的连接肽，发现其活性较不含连接肽
的蛋白都有所提高，并和天然存在的脂肪酶相当，且其
5. 2011， 3）
31（ 邓春平 等： hK1- Fc 融合蛋白在 CHO 细胞中的表达及其活性研究
L- 27
图5 重组细胞于摇瓶培养时蛋白表达（ a） 、
细胞密度（ b） 及活力（ c） 的日变化曲线
Fig． 5 Curve of cell density（ b） ，viability（ c） and protein expression output（ a） of recombinant cells in shake flask
1： Cell line expressed hK1- Fc； 2： Cell line expressed hK1- Fc
L1- L2-
融合蛋白 hK1- Fc 和 hK1- Fc 的比活性分别为 9． 6
L1- L2-
U / mg 和 9． 2 U / mg， hK1- 蛋白分别提高了 23% 和
较 Fc
［12］ ［18］
18% （ 表 2） ，这与 Zhao 等 和田硕等 的结果类似。
同时，还对重组 CHO- 细胞进行了无血清悬浮培
S
养，经无血清驯化后采用批式培养，蛋白表达量在 0． 7
mg / L 以上（ 图 4 ） ； 优化培养条件后，蛋白的表达量在
1． 6 mg / L 以上。对比 同 类 实 验， 小 红 等［19］ 在 CHO
宋
图6 纯化后蛋白的 SDS-PAGE 检测
细胞中悬浮培养表达重组人神经生长因子的表达量为
Fig． 6 SDS-PAGE analysis of purified fusion protein
0． 83 mg / L，经培养优化后最高表达量为 1． 55 mg / L。
1： Protein marker； 2： Protein hK1- Fc； 3： Protein hK1- Fc
L1- L2-
因此，研究得到的重组细胞株的表达量相对较高，有助
于重组蛋白的大规模生产。
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L-
and Analysis of its Bioactivity
DENG Chun-ping1 TAO Jian- 2
jun HOU Yong- 2
min ZHONG Ling1
（ 1 School of Pharmaceutical Sciences， Yat-
Sun Sen University，Guangzhou 510006，China）
（ 2 Techpool Bio-pharma Co． Ltd． ，Guangzhou 510520，China）
Abstract To further modify the recombinant human kallikrein 1 （ hK1 ） for higher activity，new form of
recombinant human kallikrein 1 （ hK1- Fc） was constructed by fusion of the human kallikrein1 gene and the
L-
coding sequences for Fc fragment of human IgG1 with a flexible linker peptide． The fusion gene hK1- Fc was
L-
constructed by PCR，then inserted into expression vector pcDNA3． 1，and expressed in Chinese Hamster Ovary
cells． The chimeric protein was purified by Protein A affinity chromatography，and further analyzed by SDS-
PAGE、 Western blotting、 MALDI- TOF- and HPLC． The bioactivity of fusion protein in vitro was determined by
MS
the reaction with its substrate． The results showed that recombinant expression vector pcDNA3． 1- hK1- Fc was
L-
constructed successfully and the cell lines stably secreting fusion protein were obtained； The expression output of
the fusion protein was higher than 0． 7 mg / L in batch culture； The purity of the protein with about 60 kDa
molecular weight was higher than 95% ，and the biological activity of the fusion protein was more than 9． 2 U /
mg，which increased more than 18% than that of hK1- fusion protein．
Fc
Key words Kallikrein 1 Fusion protein CHO cell
