生命機能設計学 第五回の講義レポートです。 吸光度による核酸の検出、DNAの検出、ハイブリダイゼーションとプローブ、プローブの検出、Dot blot 法によるターゲットDNAの検出、アガロースゲル電気泳動、DNAの可視化、サザンブロット解析法 についてざっくりまとめています。

1. 生命機能設計学 レポート⑤
（2017/11/02 の講義分）
2017/11/09
ゆきひろ
【吸光度による核酸の検出】
サンプルに一定の波長の光を当て、抜けた光との光
量の減衰具合（程度）を吸光度（Optical Density＝
OD(Absorbance＝A)）と定義され、以下のように求め
られる。
A = − log10 (
𝐼
𝐼₀
)
（A：吸光度, I(λ）：透過光量, I₀(λ)：入射光量）
水は波長約 240nm を境に吸光度が大きく下がり、そ
こに DNA を溶かして水溶液とした場合、DNA を構成す
る 4 種の塩基の吸収ピーク波長は A：259nm T：267nm G：
253nm C：267nm であり、これらが混ざった吸収を示す。
溶液中に別の物質が存在した場合、A260 の測定では
正確な核酸濃度は測定できない。
不純物のない状態での波長スキャンデータ（図 1）
図 1
と照らし合わせることでより正確な値を推定する。
タンパク質の混入の有無を判断するには、A260/A280
の値が有用であることが経験からわかっている。
核酸は A260 で吸光度がピークになるのに対してタン
パク質は A280 にピークを持つことから、A260/A280 比を求
めることで DNA の純度の指標とすることがでるといえ
る。
A280 に高い吸収がある場合、タンパク質が混入して
いることになる。DNA の場合は A260/A280≧1.8、RNA の場
合は A260/A280≧2.0 であれば純度が高いと判断できる
（図 2）。
図 2
【DNA の検出】
分光光度計で吸光度を測定すれば、溶液中の DNA の
純度と量を求めることができる。しかし、サンプル内
の溶質がプラスミドとゲノムの混合物だった場合、前
項で示したような原理上、正確な（プラスミドだけの）
吸光度を求めることができない。外来 DNA のみを識
別・検出したい。
【ハイブリダイゼーションとプローブ】
前項での問題の解決策として、ハイブリダイゼーシ
ョンという方法がある。
一本鎖にした DNA もしくは RNA に、相補的な一本鎖
DNA や RNA を混ぜ、２本鎖の雑種核酸を作ることを指
す。相補的な断片は蛍光物質、ラジオアイソトープ等
何らかの標識をつけたもの（プローブ）が用いられる。
この方法により、RNA-RNA、DNA-RNA、DNA-DNA の雑
種形成が可能である。
メンブレンにくっつけた RNA もしくは一本鎖 DNA
に、雑種形成を行わせるものを特にドットブロットハ
イブリダイゼーションという。
【プローブの検出】
ハイブリダイズするプローブを検出する方法は講
義では 3 つ紹介された。以下に示す。
1. 放射性同位元素（32P）を使う方法（DNA のリン酸
結合部に 32P を取りこませたプローブを作る）
2. Biotin-Avidin 系を使う方法
3. DIG 系を使う方法
【Dot blot 法によるターゲット DNA の検出】
以下に DIG 系を用いた Dot blot 法の具体例(結果のみ)
を示す（図 3）。

2. 図 3
この実験系では、発色基質として
5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)が用いられており、図
3 からわかるとおり DNA スケールが（ng/dot）と非常
に高感度で精度が高いことがわかる。
しかし、Dot blot 法では規模に限界があるため電
気泳動による分離と検出が行われることも多い。
【アガロースゲル電気泳動】
数ある電気泳動の中でも、オーソドックスなものと
して、アガロースゲル電気泳動法が挙げられる。
この手法はその名のとおりアガロースゲルを使用
して泳動する方法であり、核酸をその大きさに応じて
分離する。
【DNA の可視化】
DNA は 2 本鎖の内部にインターカレートしたエチジ
ウムブロマイド分子（以下 EtBr）を持つと、核酸が吸
収した UV 光のエネルギーを EtBr に転移させる（図 4）。
エネルギーを受け取った EtBr は、励起されて蛍光を
放射する。
図 4
【サザンブロット解析法】
サザンブロッティング法とは、プローブと相補的な
塩基配列を持つ DNA 断片を特異的に検出する手法であ
る。
DNA を扱う際、サザンブロッティングを行い、特定
の DNA 配列に関しその場所、配列などを把握する。
方法は、制限酵素で処理した DNA 断片をアガロース
ゲルで電気泳動後、メンブレンへ拡散もしくは吸引す
ることによって転写する（図 5）。
転写後の膜に検出したい DNA 配列と相補的な塩基配
列をもつプローブ配列をハイブリダイズさせ、目的の
DNA 配列のみを検出する。
図 5
【参考文献・画像元 URL】
 Laser Create Coop：
http://www.lasercreate.com/useful/lineup/op
tical_density.html
 分光倶楽部 基礎講座 第 5 回：核酸の濃度測定：
https://www.gelifesciences.co.jp/technologi
es/spectro/spectclub/theo_05.html
 APS Journal：
http://ajpgi.physiology.org/content/288/4/G
842
 Chem-Station：
https://www.chem-station.com/blog/2017/09/t
cne.html
 Analysis of DNA by the Southern Blot
technique：
https://www.mun.ca/biology/scarr/Gr12-18.ht
ml