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細胞機能設計学 レポート④
(2017/10/26 の講義分)
2017/11/02
ゆきひろ
【一過性発現と安定形質転換】
核酸を細胞に導入するための手法は数多
く存在する。しかし全てのトランスフェクシ
ョン戦略は、導入された核酸が細胞内に存在
するのが限られた期間であるか、長期間にわ
たり細胞内に存続し、導入細胞の子孫に引き
継がれるかの二つに大別される。
 一過性発現
一過性発現では、導入された核酸は限られ
た期間だけ細胞内に存在し、ゲノムには組み
込まれない。導入された遺伝物質は細胞分裂
を介して次の世代へと受け継がれることは
なく、環境因子によって失われるか、細胞分
裂を通して薄まってしまう。しかし、高い頻
度でコピーされる状態のときに導入された
遺伝物質はその期間高い精度で発現タンパ
ク質を細胞内に存在させることにつながる。
一過的に発現される導入遺伝子は一般的
に一週間にわたり検出されるといわれてお
り、導入された細胞は通常トランスフェクシ
ョン後 24~96 時間以内に回収される。最適
な期間の間隔は細胞の種類等様々な要因に
依存するが、大部分の外来 DNA は 2~3 日以
内にヌクレアーゼによって分解されるか、細
胞分裂によって希釈され、一週間後にはその
存在は検出されなくなってしまう。したがっ
て実験のたびに遺伝子を導入する必要があ
るため、結果にぶれが生じやすいといえる。
 安定形質転換
安定トランスフェクションでは、外来 DNA
は細胞内ゲノムに組み込まれるか、プラスミ
ドとして維持される。一過性トランスフェク
ションとは異なり、長期間にわたり外来 DNA
を導入細胞およびその子孫に維持すること
を可能である。つまり安定トランスフェクシ
ョンは複数世代にわたり導入された遺伝子
を持続的に発現させることができる。しかし、
通常安定的に導入細胞のゲノムに組み込ま
れるのは、少数の外来 DNA である。このため
安定的に導入された遺伝子の発現レベルは
一過的に導入されたそれよりも低いといえ
る。
また、外来 DNA が安定的にゲノムに組み込
まれることは比較的稀であるため、安定トラ
ンスフェクションを成功させるためには効
率的な DNA 導入とその DNA を取り込んだ細胞
を選択する方法が必要とされる。
【動物細胞への遺伝子導入】
動物細胞への遺伝子導入を促進するのに
化学的、物理的または生物学的手法がある。
具体例とその原理をそれぞれ以下に示す。
 カチオンを用いた(DEAE-dextran)遺伝
子導入(化学的手法)
DEAE-dextran 法は、それぞれ負に荷電して
いる DNA と細胞膜に、カチオンを多量に含ん
だDEAE(図1)を用いて取り込む方法である。
水溶液中で負に荷電したヌクレオチドは,
正電荷を持つ DEAE-デキストランに取り囲ま
れるので細胞膜表面に接触しやすくなる。そ
の後、この DEAE-デキストラン-ヌクレオチド
複合体はエンドサイトーシスで細胞に取り
込まれる。
図 1
 エレクトロポレーションを用いた遺伝
子導入(物理的手法)
エレクトロポレーション(図 2)は、短パ
ルスの電流を利用して、DNA を細胞内に導入
する技術である。細胞を電気パルスにさらす
と細胞膜に一時的に孔が形成され、核酸はこ
の孔を通過して細胞内に入り込む。
ターゲットとなる細胞を高電圧の電場に
さらすと、細胞膜と細胞質の間で一時的に極
端な電位差が生じ、この影響で細胞膜の構造
が変化して透過性が上昇する。電場から開放
されると、細胞膜の構造は回復するが、この
際に周囲に溶解している物質(DNA)が細胞
内に取り込まれる。
図 2
 ウイルス(retrovirus)を用いた遺伝子
導入(生物的手法)
LTR、パッケージングシグナルおよび目的
遺伝子を搭載したレトロウイルスベクター
プラスミドとパッケージングに必要な gag、
pol、env 遺伝子を搭載したベクタープラスミ
ドを別々に準備し、これらを同時に導入する
ことにより自己複製能を欠いた、安全性の高
い組換えレトロウイルスを得ることができ
る(図 3)。
図 3
レトロウイルスベクタープラスミドには
標準的なクローニング方法を用いて目的の
遺伝子配列をマルチクローニングサイトに
挿入する(図 4)。
図 4
【参考文献・画像元 URL】
 Wikipedia:
https://en.wikipedia.org/wiki/Diethylam
inoethyl_cellulose
 Bio electrochemical society:
http://www.bioelectrochemical-soc.org/g
eneral/electroporation.php
 Encyclopædia Britannica:
https://www.britannica.com/science/retr
ovirus
 Slide Player:
http://slideplayer.com/slide/2079/

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  • 1. 細胞機能設計学 レポート④ (2017/10/26 の講義分) 2017/11/02 ゆきひろ 【一過性発現と安定形質転換】 核酸を細胞に導入するための手法は数多 く存在する。しかし全てのトランスフェクシ ョン戦略は、導入された核酸が細胞内に存在 するのが限られた期間であるか、長期間にわ たり細胞内に存続し、導入細胞の子孫に引き 継がれるかの二つに大別される。  一過性発現 一過性発現では、導入された核酸は限られ た期間だけ細胞内に存在し、ゲノムには組み 込まれない。導入された遺伝物質は細胞分裂 を介して次の世代へと受け継がれることは なく、環境因子によって失われるか、細胞分 裂を通して薄まってしまう。しかし、高い頻 度でコピーされる状態のときに導入された 遺伝物質はその期間高い精度で発現タンパ ク質を細胞内に存在させることにつながる。 一過的に発現される導入遺伝子は一般的 に一週間にわたり検出されるといわれてお り、導入された細胞は通常トランスフェクシ ョン後 24~96 時間以内に回収される。最適 な期間の間隔は細胞の種類等様々な要因に 依存するが、大部分の外来 DNA は 2~3 日以 内にヌクレアーゼによって分解されるか、細 胞分裂によって希釈され、一週間後にはその 存在は検出されなくなってしまう。したがっ て実験のたびに遺伝子を導入する必要があ るため、結果にぶれが生じやすいといえる。  安定形質転換 安定トランスフェクションでは、外来 DNA は細胞内ゲノムに組み込まれるか、プラスミ ドとして維持される。一過性トランスフェク ションとは異なり、長期間にわたり外来 DNA を導入細胞およびその子孫に維持すること を可能である。つまり安定トランスフェクシ ョンは複数世代にわたり導入された遺伝子 を持続的に発現させることができる。しかし、 通常安定的に導入細胞のゲノムに組み込ま れるのは、少数の外来 DNA である。このため 安定的に導入された遺伝子の発現レベルは 一過的に導入されたそれよりも低いといえ る。 また、外来 DNA が安定的にゲノムに組み込 まれることは比較的稀であるため、安定トラ ンスフェクションを成功させるためには効 率的な DNA 導入とその DNA を取り込んだ細胞 を選択する方法が必要とされる。 【動物細胞への遺伝子導入】 動物細胞への遺伝子導入を促進するのに 化学的、物理的または生物学的手法がある。 具体例とその原理をそれぞれ以下に示す。  カチオンを用いた(DEAE-dextran)遺伝 子導入(化学的手法) DEAE-dextran 法は、それぞれ負に荷電して いる DNA と細胞膜に、カチオンを多量に含ん だDEAE(図1)を用いて取り込む方法である。 水溶液中で負に荷電したヌクレオチドは, 正電荷を持つ DEAE-デキストランに取り囲ま れるので細胞膜表面に接触しやすくなる。そ の後、この DEAE-デキストラン-ヌクレオチド 複合体はエンドサイトーシスで細胞に取り 込まれる。
  • 2. 図 1  エレクトロポレーションを用いた遺伝 子導入(物理的手法) エレクトロポレーション(図 2)は、短パ ルスの電流を利用して、DNA を細胞内に導入 する技術である。細胞を電気パルスにさらす と細胞膜に一時的に孔が形成され、核酸はこ の孔を通過して細胞内に入り込む。 ターゲットとなる細胞を高電圧の電場に さらすと、細胞膜と細胞質の間で一時的に極 端な電位差が生じ、この影響で細胞膜の構造 が変化して透過性が上昇する。電場から開放 されると、細胞膜の構造は回復するが、この 際に周囲に溶解している物質(DNA)が細胞 内に取り込まれる。 図 2  ウイルス(retrovirus)を用いた遺伝子 導入(生物的手法) LTR、パッケージングシグナルおよび目的 遺伝子を搭載したレトロウイルスベクター プラスミドとパッケージングに必要な gag、 pol、env 遺伝子を搭載したベクタープラスミ ドを別々に準備し、これらを同時に導入する ことにより自己複製能を欠いた、安全性の高 い組換えレトロウイルスを得ることができ る(図 3)。 図 3 レトロウイルスベクタープラスミドには 標準的なクローニング方法を用いて目的の 遺伝子配列をマルチクローニングサイトに 挿入する(図 4)。 図 4 【参考文献・画像元 URL】  Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Diethylam inoethyl_cellulose  Bio electrochemical society: http://www.bioelectrochemical-soc.org/g eneral/electroporation.php  Encyclopædia Britannica: https://www.britannica.com/science/retr ovirus  Slide Player: http://slideplayer.com/slide/2079/