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La penicillina
- 1. LA PENICILLINA dalla produzione all’uso Manuel Cagnin a.s. 2016/2017 I.I.S. Levi-Ponti Dipartimento Chimica Indirizzo: Chimica e Biotecnologie sanitarie
- 2. INTRODUZIONE La penicillina è un farmaco rivoluzionario perché è stato il primo di tutti gli antibiotici prodotti. Viene prodotto da alcuni tipi di miceti come gli appartenenti al genere Penicillium e Aspergillus. Per questo la produzione avviene tramite colture in bioreattori.
- 3. STORIA È stata scoperta da Alexander Fleming nel 1929, quando notò che in una piastra aperta, una muffa del genere Penicillium aveva inibito la crescita degli stafilococchi. I primi a isolarla furono E. Chain e H. Florey, studiosi di Oxford che appassionatisi agli studi Fleming riuscirono a cristallizzare il farmaco nel 1945. Nello stesso anno i due di Oxford e lo scopritore ricevettero il premio Nobel per la Medicina.
- 4. IL BIOREATTORE Si definiscono bioreattori quegli apparecchi nei quali avvengono trasformazioni biotecnologiche. Esistono vari tipi, classificabili in base: • Tipologia costruttiva • Tipologia di tecnica produttiva • Tipologia di aerazione
- 5. IL PROGETTO Prevedeva la creazione di un bioreattore: • Batch o discontinuo • Letto fluido • Agitazione meccanica • pH controllato
- 6. LA PRODUZIONE Per arrivare al prodotto finale si segue tale scaletta: • Isolamento di un ceppo di Penicillium • Preparazione del terreno di coltura • Inoculo della muffa • Estrazione del prodotto • Esaminazione del prodotto
- 7. ISOLAMENTO DEI CEPPI Si stempera un pezzo di pane ammuffito in acqua sterile. • Semina soluzione di acqua e pane in piastra di SDA (Sabouraud Dextrose Agar, fig. a destra) • Semina diretta di un pezzo di pane in SDA (fig. a sinistra) • Controllo dei sporangi per identificazione delle muffe
- 8. ISOLAMENTO DEI CEPPI Osservazione: • Con spatola grattare la superficie della muffa • Stemperare la muffa in una goccia d’acqua su un vetrino • Osservare Nell’immagine sono presenti i sporangi della prima muffa, appartengono ad un Penicillium.
- 9. ISOLAMENTO DEI CEPPI Osservazione: • Con spatola grattare la superficie della muffa • Stemperare la muffa in una goccia d’acqua su un vetrino • Osservare Nell’immagine sono presenti i sporangi della seconda muffa, appartengono ad un Penicillium.
- 10. ISOLAMENTO DEI CEPPI Osservazione: • Con spatola grattare la superficie della muffa • Stemperare la muffa in una goccia d’acqua su un vetrino • Osservare Nell’immagine sono presenti i sporangi della terza muffa, appartengono ad un Aspergillus.
- 11. ISOLAMENTO DEI CEPPI Procedere alla produzione della coltura pura: • Prelevare alcune ife della muffa e stemperararle in acqua fisio. • Seminare a striscio continuo in piastra SDA La muffa uscita sembra appartenere al genere Penicillium, ma confrontandola con altre non ne ho identificato la specie.
- 12. ISOLAMENTO DEI CEPPI Procedere alla produzione della coltura pura: • Prelevare alcune ife della muffa e stemperararle in acqua fisio. • Seminare a striscio continuo in piastra SDA La muffa uscita sembra appartenere al genere Penicillium e probabilmente è della specie notatum o chrysogenum dato il caratteristico colore verde smeraldo.
- 13. ISOLAMENTO DEI CEPPI Procedere alla produzione della coltura pura: • Prelevare alcune ife della muffa e stemperararle in acqua fisio. • Seminare a striscio continuo in piastra SDA La muffa uscita sembra appartenere al genere Aspergillus e probabilmente è della specie niger dato il caratteristico colore marrone scuro.
- 14. TERRENO DI COLTURA Il terreno utilizzato è una composizione specifica di elementi: COMPONENTE PERCENTUALE Carboidrato principale D-Lattosio 3-4 % Altri carboidrati Glucosio 0-0,5 % q.v. (quantità variabile) Precursore specifico Acido fenilacetico (G) Acido fenossiacetico (V) q.v. 0,5% q.v. Acidi Organici Acido Lattico Acido acetico 0,5% 0,05% Fonti di Azoto e Antischiuma Solfato di ammonio, Aminoacidi, Peptidi, Ammoniaca Azoto totale 230-340 ppm = 0,03% q.v. 0,15-0,25%
- 15. FORMAZIONE Si continua quindi con la semina della muffa nel bioreattore, facendola crescere per 5 giorni a temperatura ambiente (20-25°C). In figura il quinto giorno dalla semina.
- 16. RAFFINAZIONE La raffinazione viene effettuata tramite: • Filtrazione del terreno (fig. in alto) • Abbassamento della temperatura • Abbassamento del pH • Estrazione con solvente acetato di n-butile (fig. in basso a sinistra) • Aggiunta di citrato di sodio per cristallizzare (fig. in basso a destra)
- 17. TESTING DEL RISULTATO Per testare il prodotto si procede con PAR-test (potere antibatterico residuo). Quindi: • Seminare alcune piastre con Escherichia coli • Inserire al centro un disco imbevuto del nostro prodotto • Controllare l’inibizione
- 18. CONTROLLO DELLE PIASTRE Dopo 24h controllare la crescita. L’inibizione può essere data dalla presenza della penicillina nell’ inoculo.
- 19. STRUTTURA CHIMICA Per penicilline si intende una classe di molecole aventi in comune un nucleo costituito da un anello tiazolin β-lattamico risultante dalla condensazione tra la β-tiovalina e la glicina acilata: Anello tiazolin β-lattamico
- 20. CLASSIFICAZIONE PENICILLINE NATURALI: Sono le prime penicilline estratte, si producono a partire direttamente da un microorganismo.
- 21. CLASSIFICAZIONE PENICILLINE SEMISINTETICHE: Si producono a partire dall’acido penicillanico che viene fatto acilare per connettere un determinato radicale.
- 22. CLASSIFICAZIONE Si dividono in 4 classi: • Prima generazione, attive solo su Gram+ e sensibili alle lattamasi. • Seconda generazione, attivo anche su pochi Gram- e sensibile alle lattamasi • Terza generazione, attive anche su molti Gram- e non sensibili alle lattamasi (aggiunta di acido clavulanico) • Quarta generazione, attive su Pseudomonas e non sensibili alle lattamasi
- 23. FUNZIONAMENTO Le penicilline sono inibitori della sintesi della parete batterica, bloccando la reazione che attacca la n-acetilglucosamina all’ n-acetilmuramico, per questo motivo è attiva sulla gran parte dei batteri.
- 24. FARMACOCINETICA Il farmaco è assorbito velocemente: • Picco massimo a 30 min dall’assunzione. • Azione battericida. • Smaltimento: emivita breve (30 minuti-1 ora). Il 10% eliminato per ultrafiltrazione glomerulare, 90% per secrezione tubulare diretta.
- 25. INTOLLERANZA Il farmaco può dare reazione allergiche soprattutto se addizionato ad acido clavulanico, un inibitore delle β-lattamasi batteriche che può causare nausea vomito ed eritemi.
- 26. MATEMATICA DEI MICROBI La replicazione delle muffe può seguire due tipi di andamento: • simil-esponenziale dove si segue la funzione: 𝑦 = 2 𝑥 • simil-logaritmico dove si segue la funzione: log2 𝑥 , dove dopo una fase di crescita molto veloce, la funzione si stabilizza
- 27. POTENZIALITÀ Un esempio delle potenzialità di questo farmaco è dato dall’OMS: All’inizio del 20° secolo di leptospirosi morivano circa 50 mila persone l’anno. Oggi grazie a questa scoperta il numero di decessi è diminuito di dieci volte e sta ancora scendendo.