Introduction to Anatomic Pathology

1. 10/10/2018 17:48
Hic mors gaudet succurrere vitae
ANATOMIC
PATHOLOGY:
Introduction &
Techniques
Giulia Ottaviani, MD, PhD
Department of Biomedical, Surgical and Dental Sciences
10-Oct-18

2. 10/10/2018 17:48
Basi metodologiche utilizzate nella diagnostica
anatomo-patologica
– Definizione di anatomia patologica
– Attività principali dell’anatomo-patologo: autopsia, esame
macroscopico, esame istologico, esame citologico, esami
istochimici, esami immunoistochimici, esami molecolari;
– Modalità di invio del materiale da destinare all’esame
anatomo-patologico;
– Trattamento del materiale ai fini della diagnosi istologica:
fissazione e processazione dei campioni; allestimento e
colorazione dei preparati istologici

3. 10/10/2018 17:48
– Tecniche di immunoistochimica in anatomia patologica
– Tecniche di biologia molecolare in anatomia patologica
– Citologia diagnostica: metodi di raccolta e trattamento del
materiale citologico; cenni di citopatologia
– Microscopio ottico e osservazione dei preparati istologici
– Microscopio elettronico a trasmissione e a scansione

4. 10/10/2018 17:48
Principi di diagnostica anatomo-patologica
- I disturbi della proliferazione e differenziazione cellulare
(ipertrofia, iperplasia, metaplasia, neoplasia)
- Classificazione delle neoplasie (istotipo, grado e stadio TNM)
- Anatomia patologica del cavo orale (pre-cancerosi, neoplasie
benigne, neoplasie maligne, tumori odontogeni)
- Anatomia patologica delle ghiandole salivari
- Cenni di anatomia patologica dell’apparato digerente,
respiratorio, cardiovascolare, genitourinario

5. 10/10/2018 17:48
DEFINITION
L’Anatomia Patologica è una branca
specialistica della medicina che ha la
finalità di inquadrare le malattie mediante
esame macroscopico dell’organismo
umano e dei suoi organi
esame microscopico dei tessuti e
delle cellule
What is ANATOMIC PATHOLOGY?
Elaborated from: PubMed US National Library of Medicine: http://www.nlm.nih.gov/
Outline

6. 10/10/2018 17:48
DEFINITION Derived from the Greek
Anatomy
“Ana”= up
“tomos”= to cut
Study of the structure of organisms including their
systems, organs, tissues, and cells.
Pathology
“Pathos” = suffering or disease
“logos” = study
Study of diseases;
Study of the structural and
functional disease.
ANATOMIC PATHOLOGY

7. 10/10/2018 17:48
PURPOSES
L’Anatomia Patologica fornisce un
apporto fondamentale per
diagnosi,
prognosi e
terapia delle malattie
Why do we need ANATOMIC PATHOLOGY?
Elaborated from: PubMed US National Library of Medicine: http://www.nlm.nih.gov/
Outline

8. 10/10/2018 17:48
“Come un albero vive grazie alle sue radici
nascoste, così un ospedale non potrebbe
esistere senza la figura
dell’anatomo-patologo, spesso invisibile ai
pazienti”
SOCIETA’ ITALIANA DI ANATOMIA PATOLOGICA E CITODIAGNOSI (SIAPEC)

9. 10/10/2018 17:48
WHERE?
Provenienza del materiale che arriva nel
laboratorio di anatomia patologica
▪ SALA AUTOPTICA
prelievi organi
▪ SALA OPERATORIA
biopsie chirurgiche, endoscopiche, agobiopsie,
pezzi operatori
▪ AMBULATORI
prelievi citologici

10. 10/10/2018 17:48
◼ Epidemiology
◼ Etiology - Causes
◼ Pathogenesis - Evolution
◼ Morphology - Structural Changes
◼ Clinical Significance – Functional Changes
◼ Management
◼ Prevention
Anatomic Pathology: Aspects
Important!

11. 10/10/2018 17:48
Branches of Anatomic Pathology
◼ Histopathology
◼ Cytopathology
◼ Forensic Pathology
◼ Cardiopathology
◼ Immunohistochemistry
◼ Immunopathogy
◼ Chemical Pathology
◼ Genetics
◼ Toxicology
◼ Microbiology

12. 10/10/2018 17:48
Principali attività
dell’anatomopatologo
▪ ESAME AUTOPTICO (riscontro diagnostico)
▪ ESAME CITOLOGICO (diagnostico o preventivo)
▪ ESAME ISTOLOGICO di biopsie (chirurgiche, endoscopiche,
agobiopsie) o campioni di organi
▪ ESAME INTRAOPERATORIO (estemporaneo, al congelatore)
▪ ESAMI DI BIOLOGIA MOLECOLARE (DNA, RNA..)

13. 10/10/2018 17:48
Techniques in Anatomic Pathology
◼ Gross Pathology:
– Gross Autopsy; Gross specimen
examination and sampling
◼ Histopathology:
– Light Microscopy, Autopsy
◼ Histochemistry, Biochemical
◼ Immunohistochemistry
◼ Cytopathology
◼ Electron Microscopy
◼ Molecular Pathology
◼ Cell Cultures
◼ Medical Microbiology

14. 10/10/2018 17:48
La prima dissezione di
cui abbiamo notizia fu
eseguita nell'antica
Grecia nel V secolo
a.C.
da Alcmeone di Crotone
ANCIENT GREEK PERIOD (500 BC)

15. 10/10/2018 17:48
ANCIENT GREEK PERIOD (300 BC)
HEROPHILOS (about 325 BC)
▪ Great teacher of anatomy in
Alexandria
▪ performed -vivi-sections
(dissections of living humans)
-dissections of human cadavers
▪ regarded brain as seat of
intelligence
▪ described cerebrum, cerebellum ,
fourth ventricle
▪ first to identify nerves as sensory
or motor.
▪ He is credited with the discovery
of ovum
Cont…

16. 10/10/2018 17:48
RENAISSANCE PERIOD
LEONARDO DA VINCI (1452 – 1519)
▪ great Italian genius
▪ Painter, sculptor, architect, musician,
anatomist engineer
▪ observed dissections on cadavers
▪ Anatomical sketches (500 diagrams)
published in 1898.
▪ Originator of cross sectional anatomy
▪ First to describe moderator band of
Right ventricle.
Autoritratto, ~ 1510-15,
Sanguigna, Torino, Biblioteca Reale
“Paura d’abitare nelle tempi notturni
in compagnia di tali morti squartati
e scorticati e spaventevoli a vedere”

17. 10/10/2018 17:48
Giovan Battista Morgagni (1682-1771)
Professore di anatomia all‘Università di Padova è
stato il primo ad eseguire autopsie di routine come
mezzo diagnostico.
Morgagni eseguiva dissezioni su tutti i cadaveri dei
ricoverati deceduti nell‘Ospedale di Padova in
quanto si era reso conto che a sintomi e malattie
corrispondevano precisi segni anatomici sul corpo.
nasce con Morgagni l’Anatomia Patologica
18th CENTURY

18. 10/10/2018 17:48
20th CENTURY
CARDIAC CONDUCTION SYSTEM
IMAGING ANATOMY
- X-ray
- Ultrasound
- CT Scan
- MRI
- PET

19. 10/10/2018 17:48
21st CENTURY
▪ VIRTUAL AUTOPSY
▪ MOLECULAR AUTOPSY

20. 10/10/2018 17:48
AUTOPSIA
DEFINIZIONE
dal greco αὐτοψία
(αὐτός «stesso» e ὄψις «vista»)
«vedere con i propri occhi»

21. 10/10/2018 17:48
ESAME AUTOPTICO
indagine post-mortem
(eseguita sul cadavere)
al fine di chiarire la causa di morte

22. 10/10/2018 17:48
Le autopsie sono una fonte importante
di informazioni mediche
Molte malattie sono state scoperte
grazie agli esami autoptici

23. 10/10/2018 17:48
Autopsia
L'autopsia o “esame post-mortem” è
un esame medico dettagliato del corpo
e dei relativi organi della persona dopo
la morte per stabilirne le cause, le
modalità ed eventualmente i mezzi che
l'hanno prodotta
Cont…

24. 10/10/2018 17:48
Può essere richiesta
◼ dal medico curante che non abbia chiara
la causa della morte
◼ dalla Direzione Sanitaria (se l'exitus è
avvenuto in struttura sanitaria: ospedale, casa di
cura, ecc.)
◼ dalla Procura della Repubblica
◼ dai familiari che si rivolgono ad una di queste
strutture
AUTOPSY

25. 10/10/2018 17:48
Si distinguono
◼ Autopsia a scopo di riscontro diagnostico
effettuata nei reparti di anatomia patologica
◼ Autopsia giudiziaria
effettuata nei reparti di medicina legale
AUTOPSY

26. 10/10/2018 17:48
MORTE NATURALE MORTE VIOLENTA
anatomo-patologico
omicidio, suicidio, accidente
medico-legale
AUTOPSIA
AUTOPSY

27. 10/10/2018 17:48
I. Autopsia a scopo di riscontro
diagnostico
ricerca le cause di morte
(per controllo diagnostico o per chiarire quesiti clinici)
---------------
si eseguono prelievi di frammenti di organi o di liquidi
biologici (sangue, urina, bile)
Su questi prelievi si effettuano esami citologici e istologici
AUTOPSY

28. 10/10/2018 17:48
I. Autopsia a scopo di riscontro
diagnostico
IMPORTANTE
Se durante l’autopsia sorge il sospetto che la morte
dipenda da un reato, il medico settore deve
sospendere le operazioni e darne
immediatamente notizia all’autorità giudiziaria

29. 10/10/2018 17:48
II. Autopsia giudiziaria (medico-legale)
Ricerca principalmente:
◼ Cause di morte – stabilisce se determinate
lesioni sono risultato di un crimine, infortunio sul
lavoro, suicidio, ecc.
◼ Epoca della morte – desumibile dai
fenomeni post-mortali cadaverici

30. 10/10/2018 17:48
Fenomeni post-mortali cadaverici
per stabilire l’epoca della morte
1. Immediati (abiotici): dovuti a
cessazione delle funzioni vitali (attività
nervosa, respiratoria e circolatoria)
2. Consecutivi (trasformativi): dovuti
a modificazioni che avvengono nel
cadavere

31. 10/10/2018 17:48
1. Fenomeni cadaverici
immediati (abiotici)
◼Raffreddamento (la T corporea si
abbassa di 0.5°C nelle prime 3-4 ore; di 1°C
all’ora nelle successive 6 ore; di 0.5°C all’ora
nelle successive 12 ore → T ambientale)
◼Disidratazione (per evaporazione di
acqua dai tessuti)

32. 10/10/2018 17:48
Il raffreddamento del cadavere non segue le
leggi fisiche di Newton
(degradazione termica di un corpo è proporzionale
alla differenza tra T del corpo e T ambiente)
ma dipende da vari fattori (condizioni somatico-
ambientali):
◼ durata processi metabolici
◼ dimensione corporea
◼ stato nutrizione
◼ clima (caldo secco, umido, ecc.)
◼ presenza di indumenti e loro natura

33. 10/10/2018 17:48
Fenomeni post-mortali
cadaverici
1. Immediati (abiotici): dovuti a
cessazione delle funzioni vitali
(attività nervosa, respiratoria e
circolatoria)
2. Consecutivi (trasformativi): dovuti
a modificazioni che avvengono nel
cadavere

34. 10/10/2018 17:48
2. Fenomeni cadaverici
consecutivi (trasformativi)
◼ Ipostasi: il sangue per gravità si sposta nelle
parti declivi del cadavere formando macchie
rosse sulla cute: livor mortis
◼ Rigidità: dovuta a rigidità muscolare: rigor
mortis
◼ Putrefazione: decomposizione dei tessuti ad
opera dei germi anaerobi; inizia quando tutto
l’ossigeno è consumato

35. 10/10/2018 17:48
Nomogramma di Henssge
(per valutare l’epoca della morte)
Calcola direttamente
l’epoca della morte in
base al punto di
incontro tra due rette
(una relativa alla
T ambientale- vicina al
cadavere
e una alla T rettale)
e al peso corporeo
C. Henßge, B. Madea. Estimation of the time since death in the early post-mortem
period. Forensic Science International 2004; 144: 167–175
ORA DELLA MORTE

36. 10/10/2018 17:48
In Italia l'autopsia non può essere
effettuata prima delle 24 ore
dopo la morte, in base
all'articolo 8 del regolamento di
Polizia Mortuaria

37. 10/10/2018 17:48
Livelli di autopsia
▪ Completa: sono esaminate tutte le
cavità del corpo (testa compresa)
▪ Limitata: solitamente esclude la testa
▪ Selettiva: sono esaminati soltanto
organi specifici

38. 10/10/2018 17:48
Tavolo anatomico e dispositivi di protezione

39. 10/10/2018 17:48
Strumenti per riscontro diagnostico

40. 10/10/2018 17:48
Apertura cavità toracica
Apertura della cavità e addominale
Estrazione dell’encefalo
◼ TAGLIO E
SCOLLAMENTO
◼ ESAME DEGLI
ORGANI
◼ ESAME DEI TESSUTI
Riscontro diagnostico

41. 10/10/2018 17:48
Estrazione cuore e polmoni
Riscontro diagnostico

42. 10/10/2018 17:48
Estrazione fegato e milza
Riscontro diagnostico

43. 10/10/2018 17:48
Ricomposizione della Salma
Riscontro diagnostico
◼ Alla fine del riscontro diagnostico il cadavere viene
ricomposto con estrema cura cucendo i tagli
effettuati

44. 10/10/2018 17:48
L’autopsia va eseguita sempre
nel rispetto della salma
evitando mutilazioni e dissezioni non
necessarie al raggiungimento
dell’accertamento della causa di morte
(DPR 10 sett. 1990, Art. 37, comma 3)

45. 10/10/2018 17:48
VERBALE DI AUTOPSIA
▪ Generalità del cadavere
▪ Data, ora, luogo ove è eseguita l’autopsia
▪ Caratteristiche somatiche generali
▪ Descrizione dei reperti osservati durante la sezione del
cadavere
▪ Elenco prelievi effettuati
▪ Eventuali fotografie
▪ Nominativo medico settore

46. 10/10/2018 17:48
AUTOPSIA VIRTUALE (Virtopsy)
Tecniche di immagine:
◼ radiologia tradizionale
◼ TAC
◼ RM
◼ angiografia

47. 10/10/2018 17:48
la TC e la RM si apprestano nei prossimi anni a
sostituire integralmente le tecniche di indagine
invasive in campo necroscopico.
• I principali vantaggi sono:
1. L’esame è di tipo non distruttivo
2. Si può ripetere l’esame più volte
3. Si possono “stressare” le dosi sulla salma, in quanto
non ci sono limiti di esposizione
AUTOPSIA VIRTUALE

48. 10/10/2018 17:48
L’autopsia virtuale si pone come obiettivi:
-evitare, quando possibile, la dissezione dei cadaveri
- limitare l’invasività
-ricavare un maggior numero di dettagli in poco tempo
- ridurre il rischio di contaminazione del personale sanitario
La diagnostica per
immagini
sta sostituendo l’autopsia
tradizionale
AUTOPSIA VIRTUALE

49. 10/10/2018 17:48
VIRTOPSY (TAC) in radiologia forense
ricostruzione 3D ossa

50. 10/10/2018 17:48
VIRTOPSY
angiografia

51. 10/10/2018 17:48
L’integrazione per sovrapposizione al computer di tutte le
immagini ottenute attraverso le diverse tecniche utilizzate
(fusion imaging), consente poi di ricostruire un modello
virtuale del cadavere, in tutti i suoi particolari, capace di
rappresentare la sintesi di tutte le informazioni raccolte.

52. 10/10/2018 17:48
UN CASO PARTICOLARE: LA RISONANZA
MAGNETICA NELLO STUDIO E NELLA DATAZIONE
DELLE MUMMIE
Mummie di celebri faraoni, giunte fino noi grazie
all’imbalsamazione, sono tuttora oggetto di
studio tramite l’utilizzo delle moderne tecniche
diagnostiche TAC e RM per effettuare le
ricostruzioni della morfologia dei corpi

53. 10/10/2018 17:48
La mummia Ötzi rinvenuta nei ghiacciai delle Alpi
• La TAC la RM hanno consentito di
“datare” l’epoca in cui era vissuto Ötzi (età del
rame: tra il 3300 e il 3100 a.C.) e di appurare che
era stato ucciso con una freccia penetrata nella
zona sotto scapolare fino a raggiungere il polmone

54. 10/10/2018 17:48
MODALITA’ DI PRELIEVO E
INVIO DI MATERIALE
BIOLOGICO
AL LABORATORIO DI
ANATOMIA PATOLOGICA
Outline

55. 10/10/2018 17:48
MODULO DI RICHIESTA
I CAMPIONI DI MATERIALE DA ESAMINARE
ARRIVANO NEL REPARTO DI ANATOMIA
PATOLOGICA SEMPRE ACCOMPAGNATI DAL
MODULO DI RICHIESTA

56. 10/10/2018 17:48
IL MODULO DI RICHIESTA DEVE ESSERE SEMPRE
COMPILATO IN MODO CHIARO (stampatello) E
COMPLETO INDICANDO:
1) Identificazione paziente
2) Identificazione mittente
3) Identificazione campione
4) Dati clinici
5) Quesiti per il patologo

57. 10/10/2018 17:48
AZIENDA OSPEDALIERA/Ambulatorio ……………….
RICHIESTA DI ESAME ANATOMO-PATOLOGICO
□ ISTOLOGICO □ CITOLOGICO
◼ Cognome ……………………………Nome …………………………………
◼ Data di nascita…………………….Eta’…………………………………….
NOTIZIE RELATIVE AL MATERIALE INVIATO:
□ Biopsia □ Pezzo chirurgico □ Aspirato □ Altro:…………….
◼ Sede dell'intervento ……………………………………..
◼ materiale prelevato ………………………………………………..
NOTIZIE ANAMNESTICHE………………………………….…………………
SOSPETTO DIAGNOSTICO……………………………………………………
MEDICO RICHIEDENTE…………………………………………..DATA ………………………………

58. 10/10/2018 17:48
CONSERVAZIONE E INVIO DEL MATERIALE
◼ Il materiale da esaminare va
introdotto in contenitori di plastica
monouso di dimensioni idonee in
relazione alle dimensioni dei
campioni stessi

59. 10/10/2018 17:48
CONSERVAZIONE E INVIO DEL MATERIALE

60. 10/10/2018 17:48
INVIO DI MATERIALE “A FRESCO”
Il materiale può essere mantenuto nel
contenitore senza nessun liquido fissativo
se la consegna in laboratorio viene
effettuata:
◼ immediatamente per le biopsie
◼ entro 1 ora per i pezzi operatori (devono essere
avvolti in garza imbevuta di soluzione fisiologica)
L’invio “a fresco” è impiegato sempre per i tessuti da
sottoporre ad esame intraoperatorio

61. 10/10/2018 17:48
INVIO DI MATERIALE IN FISSATIVO
◼ Se il materiale non è inviato in tempi
brevi è obbligatorio aggiungere nei
contenitori, come liquido fissativo,
formalina al 10% tamponata (pH 7)
◼ Il fissativo va aggiunto in quantità
pari almeno a 10 volte il volume del
campione

62. 10/10/2018 17:48
IMPORTANTE
◼ Sui contenitori va indicato (con apposita etichetta o
con pennarello indelebile) il nome del paziente e i
dati necessari per l’identificazione del caso
◼ In caso di invio di più pezzi dello stesso paziente,
segnare su ogni singolo contenitore il tipo e la sede
di ogni prelievo
--------------------------------------------------------------
◼ N.B. Sul contenitore deve essere
evidenziata l’eventualità del rischio
biologico in caso di materiale
proveniente da paziente con rilevante
patologia infettiva

63. 10/10/2018 17:48
MODELLO ORGANIZZATIVO DI UN
SERVIZIO DI ANATOMIA PATOLOGICA
I campioni che pervengono in A.P. con il
relativo modulo vengono
immediatamente accettati con il
sistema informatico e viene loro
assegnato un
numero di identificazione
che li seguirà il tutto il percorso
lavorativo fino al reperto

64. 10/10/2018 17:48
REPERTO DI ANATOMIA PATOLOGICA
Il Reperto, redatto dall’anatomo
patologo, comprende una descrizione
dell’esame macroscopico e
dell’esame microscopico di un dato
materiale da esaminare e si conclude
con la
Diagnosi

65. 10/10/2018 17:48
Esame istologico n……………………………………………………Data…………………..
Paziente …………………………
Data nascita………………….
Inviato da………………………..
Materiale inviato: parotide
Descrizione macroscopica:
Parotide di cm 5,5 x3 x1,3 che presenta ad una estremità in sede sottocapsulare
neoformazione biancastra duro-elastica di cm. 0.9. Il restante parenchima non presenta
alterazioni di rilievo.
Descrizione microscopica:
Variabilità della componente cellulare con cellule epiteliali e mioepiteliali in varie configurazioni.
Presenza di capsula fibrosa.
Diagnosi istologica:
Adenoma pleomorfo della parotide; margini indenni
Il Medico anatomo-patologo
------------------------------------------

66. 10/10/2018 17:48
La diagnosi si basa sull’osservazione al microscopio
di tessuti o cellule posti su vetrini (portaoggetto)
E’ importante conoscere i procedimenti
utilizzati in anatomia patologica per
ottenere i vetrini da esaminare

67. 10/10/2018 17:48
HISTOPATHOLOGY
Outline

68. 10/10/2018 17:48
Preparazione di materiale per
esame istologico
Problema
◼ i tessuti biologici sono per lo più molli
◼ Per poter ottenere sottili sezioni
istologiche, il tessuto deve essere
indurito prima del taglio tramite:
- FISSAZIONE
- INCLUSIONE in paraffina

69. 10/10/2018 17:48
Outline
1. Collection
2. Fixation
3. Grossing
4. Processing
5. Embedding
6. Sectioning
7. Staining
8. Mounting
HISTOTECHNOLOGY

70. 10/10/2018 17:48
Collection of Surgical Specimen
◼ Clinical Details
◼ Adequate specimen
◼ Proper Fixative
◼ 1:10 proportion
◼ 10% buffered
Formalin

71. 10/10/2018 17:48
FISSAZIONE
Trattamento dei prelievi con sostanze
chimiche per evitare che i tessuti vadano
incontro a processi degenerativi:
◼ autolisi = dovuta a enzimi liberati dai lisosomi che
distruggono le cellule
◼ putrefazione o eterolisi = azione di microrganismi
che invadono il materiale biologico

72. 10/10/2018 17:48
FISSAZIONE
I fissativi sono composti chimici che
“fissano” le molecole presenti nelle cellule
e nei tessuti nella posizione in cui si
trovano in vivo
Viene così preservata l’identità strutturale
del tessuto

73. 10/10/2018 17:48
TIPI DI FISSATIVI
Coagulanti
◼ Alcol etilico
◼ Alcol metilico
◼ Acetone
Non coagulanti
◼ Aldeide formica- in soluzione (formalina)
◼ Acido acetico
Miscele fissative
◼ Formalina neutra tamponata
◼ Liquido di Bouin (formalina + acido picrico + acido acetico)
◼ Liquido di Carnoy (etanolo + cloroformio + acido acetico)

74. 10/10/2018 17:48
FORMALINA NEUTRA
TAMPONATA (10%- pH 7.2-7.4)
Composizione
Formaldeide 100 ml
Acqua distillata 900 ml
Fosfato di sodio dibasico 6.5gr
Fosfato di sodio monobasico 4 gr

75. 10/10/2018 17:48
PARAMETRI DA CONTROLLARE
NELLA FISSAZIONE
◼ Spessore (<0.5 cm)
◼ Temperatura (ambiente o,
possibilmente, +4°C)
◼ pH

76. 10/10/2018 17:48
TAKING SAMPLES
Edge of lesions.
◼ Wall of cysts.
◼ Include normal
areas.
◼ Avoid necrotic area.
◼ Whole specimen if
small.
◼ Direction, mark

77. 10/10/2018 17:48

78. 10/10/2018 17:48
Inking the Margins*
◼ To mark surgical
margin.
◼ Spread of lesion
◼ Malignancy
◼ Adequacy of removal
◼ Different colors to
identify margins

79. 10/10/2018 17:48
Sampling Technique
Ottaviani G. Crib death. 2nd Ed. Springer
Germany 2014 ©

80. 10/10/2018 17:48
Cassette per inclusioni
istologiche in paraffina

81. 10/10/2018 17:48
Fixation
◼ Specimen bits are
placed in porous
cassettes
◼ Not more than 5mm
thick
◼ In 10% formalin
◼ 1 mm/hour fixation
◼ ~ 6 hour

82. 10/10/2018 17:48
◼ Preservative
◼ Provides stability
◼ Protects from infection
◼ Prevents autolysis
◼ Permits sectioning and staining
Fixation:

83. 10/10/2018 17:48
◼ After fixation is
Replacing aqueous
formalin with
alcohol in gradual
sequence (70, 95,
100%) to make
way for paraffin.
TISSUE PROCESSING

84. 10/10/2018 17:48
PRIMA DELL’INCLUSIONE:
PROCESSAZIONE
a) DISIDRATAZIONE
b) CHIARIFICAZIONE

85. 10/10/2018 17:48
prima dell’inclusione:
a) DISIDRATAZIONE
Trattamento con alcol etilico a concentrazioni
crescenti (da 70-80% a 100%) per eliminare
l’acqua dai tessuti
scopi:
1) indurimento del tessuto
2) per facilitare l’inclusione in paraffina (la
paraffina non è solubile in acqua)

86. 10/10/2018 17:48
Prima = Passaggi prima dell’inclusione,
per ottenere
DISIDRATAZIONE – CHIARIFICAZIONE:
◼ Etanolo 80
◼ Etanolo 90
◼ Etanolo 100
◼ Xilolo

87. 10/10/2018 17:48
prima dell’inclusione:
b) CHIARIFICAZIONE
In sostanze quali benzolo o xilolo:
◼ rimuovono l’alcol (rendendo il pezzo
trasparente)
◼ sono solubili in paraffina e quindi ne
permettono l’infiltrazione

88. 10/10/2018 17:48
disidratazione
Etanolo 80 2-3 ore
Etanolo 90 2-3 ore
Etanolo assoluto I 1-5 ore
Etanolo assoluto II 1-5 ore
chiarificazione
Xilolo I alcuni minuti
Xilolo II alcuni minuti
(→trasparenza)

89. 10/10/2018 17:48
MACCHINE AUTOMATICHE PER LA FISSAZIONE,
DISIDRATAZIONE E CHIARIFICAZIONE DEI
CAMPIONI DI TESSUTO

90. 10/10/2018 17:48
EMBEDDING
◼ Paraffin block with embedded
tissue
◼ consistency to cut
◼ Paraffin blocks taken for
sectioning

91. 10/10/2018 17:48
INCLUSIONE IN PARAFFINA
1. INCUBAZIONE A CALDO 50-60°C
2. SOLIDIFICAZIONE A T AMBIENTE

92. 10/10/2018 17:48
TESSUTO INCLUSO IN PARAFFINA
PRONTO PER IL TAGLIO AL MICROTOMO

93. 10/10/2018 17:48
BLOCCHETTO IN PARAFFINA

94. 10/10/2018 17:48
Problema
◼ la luce del microscopio può attraversare
solo materiale di spessore molto ridotto
• per questo motivo il tessuto incluso in
paraffina deve essere sezionato mediante
speciali apparecchi, detti microtomi

95. 10/10/2018 17:48
SECTIONING
◼ Microtome
◼ 3-10 microns
◼ Ribbon of sections
◼ taken on hot water
bath

96. 10/10/2018 17:48
TAGLIO AL MICROTOMO

97. 10/10/2018 17:48
Blocchetto paraffina

98. 10/10/2018 17:48
microtomi
elettronici

99. 10/10/2018 17:48
Picking up sections
◼ Floating
sections onto
slides
◼ Common
“float” artefact
G.O., Università degli Studi di Milano

100. 10/10/2018 17:48
Bagnomaria
◼ le sezioni (4-8 µm) sono poste in
acqua calda con un pennello per
ammorbidire la paraffina, poi raccolte
sui vetrini portaoggetti

101. 10/10/2018 17:48
Microscope slide preparation:
◼ Taking the section
onto slide
◼ Flat, no air bubbles,
no stretch or breaks.

102. 10/10/2018 17:48
Problema
◼ Le sezioni istologiche così ottenute sono
normalmente quasi incolori e prive di
contrasto
• prima dell’osservazione al microscopio, le
sezioni devono essere colorate

103. 10/10/2018 17:48
PRIMA DELLA COLORAZIONE
◼ DEPARAFFINAZIONE con xilolo per
rimuovere la paraffina
◼ REIDRATAZIONE con scala discendente
degli alcoli (etanolo da 100% a 70%) per
creare affinità con le sostanze coloranti
(acquose)

104. 10/10/2018 17:48
Adesso = Passaggi prima della
colorazione, per ottenere
DEPARAFFINAZIONE – REIDRATAZIONE
◼ Tabella scala discendente x idratazione
• Xilolo
• Etanolo 100
• Etanolo 90
• Etanolo 80

105. 10/10/2018 17:48
• Is the process of coloring cells, cellular
constituent & tissue fibers to facilitate optical
differentiation by microscopic examination.
• Is the union between a colored dye & a tissue
substrate which resists simple washing.
.
STAINING

106. 10/10/2018 17:48
COLORAZIONE
per permettere lo studio al microscopio dei
tessuti che in genere sono incolori
◼ coloranti basici- si legano alle molecole
con pH inferiore a 7 (acide), come il DNA
◼ coloranti acidi- si legano alle molecole con
pH superiore a 7 (basiche), come gran parte
delle proteine citoplasmatiche

107. 10/10/2018 17:48
 Most commonly used staining methods are –
 Hematoxylin and Eosin staining in Histopathology
 Gram’s Stain and Ziehl-Neelson staining in Microbiology.
 Romanowsky staining in Hematology.
 Papanicoloau staining in Cytology
COMMON STAINING METHODS

108. 10/10/2018 17:48
EMATOSSILINA - EOSINA
1) Ematossilina (colorante basico) si lega
a strutture acide:
colora in viola i nuclei (DNA) e i nucleoli (RNA
ribosomiale)
2) Eosina: (colorante acido) si lega a
strutture basiche:
colora in rosa il citoplasma delle cellule e le
fibre collagene (contengono in prevalenza
proteine basiche)

109. 10/10/2018 17:48
Colorazione ematossilina/eosina
• Se una porzione di tessuto o di
una cellula si colora di blu/viola,
viene detta basofila ed è
colorata dall'ematossilina
• Nuclei e ribosomi generalmente
sono basofili
• Se una porzione si colora in
rosso /arancio /rosa, viene
detta acidofila o eosinofila
(è colorata dall'eosina)
◼ le proteine del citoplasma sono acidofile

110. 10/10/2018 17:48
◼ Ematossilina 10 min
◼ H20 di fonte 10
◼ Eosina 2-4 min
◼ Lavaggio H20 distillata
EMATOSSILINA - EOSINA

111. 10/10/2018 17:48
Colorazione vetrini

112. 10/10/2018 17:48
Automated Staining
◼ Routine stain H&E
◼ Hematoxylin (basic)
◼ Eosin (acidic)
◼ Nucleus is acidic and
cytoplasm is relatively
basic
◼ Special stains

113. 10/10/2018 17:48
NORMAL SALIVARY GLAND

114. 10/10/2018 17:48
Le T. First Aid USMLE Step 1, 2010 McGrawHill ©
++ - -
BACTERIAL CELL WALLS
GRAM STAIN DIFFERENTIAL STAINS

115. 10/10/2018 17:48
GRAM STAIN
DIFFERENTIAL STAINS
Tortora GJ, et al. Microbiology: An Introduction, 12th Edition, Pearson, 2016: p. 65 ©
1ARY STAIN
Crystal violet
MORDANT
IODINE
DECOLORANT
ALCOHOL
2ARY STAIN
SAFRANIN

116. 10/10/2018 17:48
GRAM STAIN
Classifies bacteria into
gram-positive or gram-negative
–Gram-positive bacteria have thick
peptidoglycan cell walls:
color purple/blue
–Gram-negative bacteria have thin
peptidoglycan cell walls and a layer of
lipopolysaccharides: color red/pink
DIFFERENTIAL STAINS

117. 10/10/2018 17:48
COVERSLIPPING
◼ Clearing - xylene
◼ Thin glass coverslips
to protect the section
◼ Using mounting
media (Eg. DPX,
Resins, Canada
balsam etc.)

118. 10/10/2018 17:48
Montaggio dei vetrini
(dopo la colorazione)
con un vetrino
coprioggetto
interponendo una
goccia di resina
naturale (balsamo
del Canada) o
sintetica (Eukitt)

119. 10/10/2018 17:48
MOUNTING THE SLIDE
(A) Apply a single drop
of mounting
medium upon
tissue section.
(B) Hold coverslip at
45º allowing the
drop to spread
along the edge of
the slip.
(C) Let go of slip and
allow medium to
spread slowly.

120. 10/10/2018 17:48

121. 10/10/2018 17:48
G.O., Università degli Studi di Milano

122. 10/10/2018 17:48
Reporting
◼ Additional sections
◼ Deeper / Thinner
sect.
◼ Special Stains/tech.
◼ Reference..
◼ Discussions with Clin.
◼ Diagnosis
◼ Report Typing
◼ Despatch.
◼ (>3-5 days)

123. 10/10/2018 17:48
Alcune varianti della metodica
istopatologica

124. 10/10/2018 17:48
INTRAOPERATIVE FROZEN SECTIONS
Esame istologico intraoperatorio
(estemporaneo - al congelatore)
su materiale prelevato durante un intervento chirurgico
al fine di chiarire una diagnosi o qualora siano emersi
durante l’intervento nuovi quesiti diagnostici
La diagnosi intraoperatoria può modificare l’intervento
Outline

125. 10/10/2018 17:48
ESAME INTRAOPERATORIO
o “estemporaneo” o “al congelatore”
Eseguito in corso di intervento chirurgico
◼ Il materiale deve pervenire FRESCO in Anatomia
Patologica, eventualmente avvolto in garze
inumidite con soluzione fisiologica
◼ qui viene congelato e tagliato al criostato
◼ Le sezioni sono colorate rapidamente con
ematossilina/eosina e osservate al microscopio

126. 10/10/2018 17:48
Preparazione di materiale istologico
◼ Per poter ottenere sottili sezioni
istologiche, il tessuto deve essere
indurito prima del taglio tramite:
1) FISSAZIONE
2) INCLUSIONE
oppure
CONGELAMENTO

127. 10/10/2018 17:48
CONGELAMENTO
◼ IN AZOTO LIQUIDO (provoca congelamento
“istantaneo”- in pochi secondi -fino a -150°C del
materiale biologico senza produrre danni strutturali)
◼ Il materiale può essere immediatamente tagliato
con l’apposito microtomo: il CRIOSTATO che
consente di tagliare sezioni di 4-5 micron a basse
temperature (da -10°C a -25°C)
ESAME INTRAOPERATORIO

128. 10/10/2018 17:48
criostato
ESAME INTRAOPERATORIO

129. 10/10/2018 17:48
Frozen Sections:
◼ Freezing acts as
embedding agent by
forming minute ice
crystals within cells.
◼ More rapid (5min),
◼ Liquid nitrogen.
Freezing Microtome
ESAME INTRAOPERATORIO

130. 10/10/2018 17:48
TAPPE
1. ACCETTAZIONE
2. DESCRIZIONE MACROSCOPICA
3. CAMPIONAMENTO
4. CONGELAMENTO
5. SEZIONE AL CRIOSTATO
6. COLORAZIONE, MONTAGGIO
7. DIAGNOSI E REFERTAZIONE
ESAME INTRAOPERATORIO

131. 10/10/2018 17:48
ANATOMO-PATHOLOGICAL
PRINCIPLES
Outline131

132. 10/10/2018 17:48
HYPERTROPHY
▪  workload requirement of an organ part
▪ Causes  cell size & cell function
▪  protein in cellular components with
▪ ↔ cellular fluid
▪ Results in an increase in tissue mass
▪ Seen in cardiac, skeletal, and muscle tissue
▪ These cells are not capable of mitosis (so, no 
number or hyperplasia)
▪ May be a normal physiologic response
▪ as seen in an increase in muscle size with exercise
( size of cells)
132

133. 10/10/2018 17:48
HYPERTROPHY
– May be a pathological response as in myocardial
hypertrophy from HTN or valve disease
◼ Example: Left ventricular hypertrophy (LVH) –
– A PATHOLOGICAL HYPERTROPHY resulting in  size of heart d/t 
workload caused by HTN.
– There is an increase in size but function is compromised
– However, there is a LIMIT to the amount the tissue can enlarge
• Left Ventricular Hypertrophy
LVH) – seen with poorly
controlled HTN
• Myocardial cells enlarge
d/t  workload of pumping
Cont…

134. 10/10/2018 17:48
HYPERPLASIA
( N of cells)
◼ Occurs d/t to a response from appropriate
stimulus and ceases when stimulus is removed
– An increase in NUMBER of cells
◼ Restricted to cells capable of mitosis
– epidermis, intestinal epithelium, and glandular
tissue.
◼ Physiological hyperplasia
– uterus and breast enlarge in pregnancy
134

135. 10/10/2018 17:48
HYPERPLASIA
◼May be a PHYSIOLOGICAL response and
occur with hypertrophy ( in both cell size & number)
– Hyperplasia is important in wound healing
◼May also be a pathological hyperplasia
– Seen in prostatic hypertrophy (BPH), endometrial hyperplasia d/t
increased hormone stimulation, or thyroid enlargement
Benign Prostatic Hypertrophy/Hyperplasia
(BPH) – can cause difficulty
with urination
Goiter – thyroid
hyperplasia
Cont…

136. 10/10/2018 17:48
METAPLASIA
▪ One cell type is replaced by another
▪ May predispose to cancer
▪ Involves reprogramming of undifferentiated stem cells
▪ Allows to cells to better survive in a hostile
environment
▪ Is REVERSIBLE
▪ Is a response to chronic irritation and
inflammation
136

137. 10/10/2018 17:48
METAPLASIA
◼ Cells that are normally columnar or
stratified may change to squamous.
◼ Examples:
– With continued smoke exposure, ciliated columnar cells are changed to
stratified squamous cells
– Cervical cells change when exposed to STDs or HPV
◼ Think metamorphosis or change from one
form to another
– Continued exposure may predispose to cancerous
transformations.
Stratifiied squamous cellsCiliated columnar cells

138. 10/10/2018 17:48
DYSPLASIA
(ATYPICAL HYPERPLASIA)
◼ Deranged cell growth resulting in cells of varying size, shape, and
appearance
– May be associated with chronic irritation or inflammation
– May be reversible if offending agent is removed
◼ Dysplasia is considered A STRONG PRECURSOR OF CANCER!
– Example: Cervical dysplasia
– However, dysplasia is an adaptive process – may or may
not lead to cancer
◼ Decrease risk if irritation is removed or
inflammation treated.

139. 10/10/2018 17:48
Adapted from: First Aid USMLE
Step 1: p. 220, 2010 McGraw-Hill
NEOPLASTIC PROGRESSION

140. 10/10/2018 17:48
Summary: Cellular Changes
Neoplasia

Adapted from: https://uk.instructure.com/courses/1654359/files/70329046/download

141. 10/10/2018 17:48
Benign vs Malignant Tumors

142. 10/10/2018 17:48
Anatomic Pathology: Etiology of Symptoms
Foreign body
Accident
Iatrogenic
Acute
Specific
Nonspecific:
Chronic
Benign
Malignant
1- Congenital
2- Traumatic
3- Inflammatory
4- Neoplastic
5- Others

143. 10/10/2018 17:48
significato dell’analisi istologica al
microscopio di una lesione
infiammatoria
stabilire se è preneoplastica
neoplastica
(benigna o maligna)
Classificazione secondo i criteri dell’Organizzazione Mondiale della Sanità
(World Health Organization-WHO):
istotipo, grado di differenziazione, stadio
Indicazioni prognostiche

144. 10/10/2018 17:48
Classificazione dei tumori
secondo WHO
◼ Istotipo = il tessuto di origine di una neoplasia
◼ Grado di differenziazione = quanto la morfologia
delle cellule della lesione si discosta da quella delle
cellule del tessuto dal quale origina il tumore
◼ Stadio = quanto è esteso il tumore

145. 10/10/2018 17:48
Tumor Nomenclature: Histotype
Benign
Adenoma
Papilloma Squamous, Transitional
Hemangioma
Leiomyoma
Rhabdomyoma
Osteoma
Lipoma
Mature teratoma
Pleomorphic Adenoma/
Mixed tumor
Malignant
Adenocarcinoma, Papillary Carcinoma
Carcinoma Squamous, Transitional
Leukemia, Lymphoma
Angiosarcoma
Leiomyosarcoma
Rhabomyosarcoma
Osteosarcoma
Liposarcoma
Immature teratoma
Carcinoma ex pleomorphic adenoma/
Malignant mixed tumor
EpitheliumMesenchyme>1cell
type
Blood cells
Blood vessels
Smooth muscle
Skeletal muscle
Bone
Fat

146. 10/10/2018 17:48
GRADO DI DIFFERENZIAZIONE di un tumore maligno
Grado I Ben differenziato
Grado II Moderatamente
differenziato
Grado III Scarsamente differenziato
Grado IV Indifferenziato
(anaplastico)

147. 10/10/2018 17:48
STADIO di un tumore maligno
STATO DI DIFFUSIONE
1. In situ
2. Microinvasione
3. Invasione locale
4. Metastasi locale
5. Metastasi a distanza
-----------------------------
1.non infiltrazione della membrana basale (per tumori epiteliali); 2.invasione
membrana basale; 3.diffusione all’interno dell’organo; 4. diffusione non
contigua all’interno dell’organo o ai linfonodi più vicini; 5. diffusione ad altri
organi o linfonodi distanti

148. 10/10/2018 17:48
SISTEMA TNM
per definire lo stadio
◼ T – stato di avanzamento locale (dimensioni,
profondità di invasione locale)
◼ N – stato di interessamento linfonodale
(locale o a distanza)
◼ M – presenza di metastasi a distanza
Outline

149. 10/10/2018 17:48
Tumor Stage
Site & Size of 1st lesion
Regional lymph node spread
Metastasis
T= tumor size
N= node involvement
M= metastasis

150. 10/10/2018 17:48
TNM
Sistema internazionale più usato per la
classificazione dei tumori maligni a cura della
UICC: Unione Internazionale Contro il Cancro,
con:
AJCC: American Joint Committee on cancer
BIJC: British Isles Joint TNM Classification Committee
CCCS: Canadian Committee on Cancer Staging
CNU-TNM: Comité Nacional Uruguayo TNM
EORTC: European Organization for Research on
Treatment of Cancer
FIGO: Féderation Internationale de Gynécologie et
d’Obstétrique
FTNM: French TNM Group
IPSP: Italian Prognostic System Project
JJC: Japanese Joint Committee

151. 10/10/2018 17:48
T= tumore primitivo
Tx=tumore primitivo non può essere definito
T0=non segni di tumore primitivo
Tis=carcinoma in situ
T1, T2, T3, T4=> a seconda dell’estensione
locale del tumore primitivo

152. 10/10/2018 17:48
N= linfonodi regionali
Nx=linfonodi regionali non possono essere definiti
N0=assenza di metastasi nei linfonodi regionali
N1, N2, N3 => a seconda del numero di linfonodi
regionali interessati dal tumore

153. 10/10/2018 17:48
M = metastasi a distanza
M0=assenza di metastasi a distanza
M1= presenza di metastasi a distanza

154. 10/10/2018 17:48
◼ Staging
– Extent of disease and relative size of tumor
– TNM staging classification system
◼ Internationally recognized system used for staging
neoplasms
◼ T: (0-4) = tumor size (primary)
◼ N: (0-3) = degree of regional lymph node
involvement
◼ M: (0-1) = presence or absence of distant
metastases
TUMOR STAGE

155. 10/10/2018 17:48
SISTEMA TNM
per definire lo stadio
Esempi:
◼ T1-N0-M0 = scarsa malignità
◼ T1-N1-MO = malignità limitata
◼ T3-N3-M1 = malignità elevata

156. 10/10/2018 17:48
CYTOPATHOLOGY
Outline

157. 10/10/2018 17:48
ESAME CITOLOGICO
Studio al microscopio di cellule isolate
prelevate da un organo o da liquidi
naturali o da versamenti (effusioni indotte
da determinate patologie) mediante varie
tecniche:
◼ apposizione
◼ abrasione
◼ agoaspirazione

158. 10/10/2018 17:48
ESAME CITOLOGICO
▪ Diagnostico
se si sospetta una malattia
▪ Screening
su persone apparentemente sane al fine di
prevenire una malattia (es. Pap-test)

159. 10/10/2018 17:48
ESAME CITOLOGICO DIAGNOSTICO
◼ Apparato genitale femminile (citologia cervico-vaginale)
◼ Apparato respiratorio (espettorato, broncoaspirato)
◼ Apparato urinario
◼ Apparato digerente
◼ Cavità sierose (versamento pleurico, ascitico, pericardico)

160. 10/10/2018 17:48
Metodi di raccolta del materiale
citologico
◼ APPOSIZIONE (su vetrino)
◼ ABRASIONE (scraping, brushing)
◼ AGOASPIRAZIONE

161. 10/10/2018 17:48
Citologia per APPOSIZIONE
Raccolta su vetrino di cellule disperse in un
liquido più o meno denso mediante:
◼ semplice appoggio del vetrino sulla superficie
da esaminare nel caso di una “secrezione” (es.
secrezione dal capezzolo)
◼ striscio su vetrino di gocce (es.sangue) o cellule
centrifugate (da urine, versamenti, escreato)

162. 10/10/2018 17:48
Citologia per APPOSIZIONE
Adapted from: Mariuzzi GM. Anatomia Patologica, Vol. I, Piccin ©

163. 10/10/2018 17:48
Preparing a SMEAR
◼ Smear- A thin film of a solution on a slide

164. 10/10/2018 17:48
Striscio su vetrino
Adapted from: Mariuzzi GM. Anatomia Patologica, Vol. I, Piccin ©

165. 10/10/2018 17:48
Citologia per AGOASPIRAZIONE
Prelievo di cellule mediante aspirazione
con ago direttamente dalla lesione (in
genere sotto guida ecografica)

166. 10/10/2018 17:48
Adapted from: Mariuzzi GM. Anatomia Patologica, Vol. I, Piccin ©

167. 10/10/2018 17:48
Citologia per AGOASPIRAZIONE
SEDI DI PIU’ FREQUENTE APPLICAZIONE
◼ Mammella
◼ Tiroide
◼ Linfonodi
◼ Ghiandole salivari
◼ Polmone
◼ Fegato

168. 10/10/2018 17:48
Prelievo per AGOASPIRAZIONE
Il radiologo localizza la
sede anatomica di una
lesione visualizzandola
sul monitor di un
ecografo; questo
permetterà di scegliere
il percorso da far
eseguire all’ago per
raggiungere la lesione
“in sicurezza”
Adapted from: Mariuzzi GM. Anatomia Patologica, Vol. I, Piccin ©

169. 10/10/2018 17:48
Adapted from: Mariuzzi GM. Anatomia Patologica, Vol. I, Piccin ©

170. 10/10/2018 17:48
170 Adapted from: Mariuzzi GM. Anatomia Patologica, Vol. I, Piccin ©

171. 10/10/2018 17:48
Adapted from: Mariuzzi GM. Anatomia Patologica, Vol. I, Piccin ©

172. 10/10/2018 17:48
FISSAZIONE DEL NODULO INSERZIONE DELL’AGO
IL CONETTO SI RIEMPIE IL MATERIALE PUO’ ESSERE STRISCIATO

173. 10/10/2018 17:48
Citologia per ABRASIONE
Rimuove le cellule dalla superficie da esaminare
mediante:
◼ Scraping (raschiamento con spatola)
◼ Brushing (raschiamento con spazzolino)
173
BRUSHING
SCRAPING

174. 10/10/2018 17:48
Scraping
lo Scraping è usato su tessuti superficiali
(es. mucosa orale, epitelio cervice uterina)

175. 10/10/2018 17:48
Brushing
Il Brushing è usato per via endoscopica sulle
mucose del tratto gastrointestinale o
respiratorio o urinario e per l’endocervice
uterina

176. 10/10/2018 17:48
Metodi di fissazione dei
prelievi citologici
◼ con spray fissativi (commerciali)
◼ in alcool (etilico, metilico)
◼ all’aria

177. 10/10/2018 17:48
Colorazioni più usate in
citologia
◼ Ematossilina/eosina
◼ Papanicolaou
◼ Giemsa

178. 10/10/2018 17:48
Striscio di mucosa orale con flora batterica

179. 10/10/2018 17:48
CITOLOGIA CERVICO-VAGINALE
PAP-Test

180. 10/10/2018 17:48
PAP-test
◼ metodo di screening molto affidabile che
permette di riconoscere precocemente il
carcinoma della cervice uterina
◼ Prende il nome da George Papanicolaou che lo
introdusse nel 1928 studiando l’effetto degli
ormoni del ciclo mestruale sulle cellule della
cervice uterina nella donna

181. 10/10/2018 17:48

182. 10/10/2018 17:48
ESOCERVICE ENDOCERVICE
GIUNZIONE SQUAMO-COLONNARE

183. 10/10/2018 17:48
CITOLOGIA CERVICO-VAGINALE
PAP-Test
TECNICA DI PRELIEVO (abrasione)
◼ Scraping dell’esocervice
con spatola (di Ayre)
◼ Brushing del canale cervicale
con spazzolino (softbrush)

184. 10/10/2018 17:48
MODALITÀ PRELIEVO PER PAP-TEST
speculum, vetrini, porta vetrini,
spatola di Ayre, softbrush
prelievo
prelievo cell. esocervice
con spatola
prelievo cell. endocervice
con brush
striscio su vetrino

185. 10/10/2018 17:49

186. 10/10/2018 17:49
Citologia cervico-vaginale in fase
liquida
La citologia in fase liquida si differenzia dal
Pap- test tradizionale:
◼ per le modalità di allestimento dei vetrini
◼ per la qualità dei risultati (significativo aumento
dell’individuazione di lesioni, riduzione dei prelievi
inadeguati)

187. 10/10/2018 17:49
Colorazione Papanicolaou
◼ Passaggi in alcol etilico (scala discendente: 80%→50%)
◼ Ematossilina di Harris
◼ H2O distillata
◼ Soluzione acquosa di HCl 0.25%
◼ H2O distillata
◼ Passaggi in alcol etilico (scala ascendente: 50%→80%)
◼ Orange G6

188. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA CERVICO-VAGINALE
PAP-Test
Sui vetrini comunque ottenuti si osservano
cellule epiteliali provenienti sia
dall’esocervice che dall’endocervice

189. 10/10/2018 17:49
Strato superficiale: cellule
appiattite di grandi dimensioni (50µ)
con nucleo picnotico
Strato intermedio: molti strati di
cellule più grandi con aumento del
volume citoplasmatico (il nucleo
rimane di uguali dimensioni)
Strato parabasale: 2-3 linee di
cellule di maggiori dimensioni con
citoplasma più evidente (frequenti
mitosi)
Strato basale: piccole cellule con
scarso citoplasma allineate in uno
strato
EPITELIO PAVIMENTOSO PLURISTRATIFICATO
ESOCERVICE (Portio)

190. 10/10/2018 17:49
PAP-test
Colorazione Papanicolaou
◼ Cellule strato
superficiale: nucleo
piccolo, citoplasma rosa
◼ Cellule strato
intermedio: nucleo
più grande, citoplasma
azzurro

191. 10/10/2018 17:49
PAP-test
Colorazione Papanicolaou
◼ Cellule strato
parabasale e
basale: aggregato di
cellule monomorfe
tondeggianti di piccole
dimensioni

192. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA CERVICO-
VAGINALE
epitelio endocervice
◼ Strato colonnare:
unico strato di
cellule cilindriche
alte con nucleo
basale picnotico
mucosecernenti

193. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA CERVICO-VAGINALE
PAP-Test
POSSIBILI QUADRI DIAGNOSTICI
•PROCESSI INFIAMMATORI
•PROCESSI PRE-NEOPLASTICI
(DISPLASIA)
•PROCESSI NEOPLASTICI

194. 10/10/2018 17:49
Infezione da Papillomavirus

195. 10/10/2018 17:49
“High-grade
dysplasia”
CIN IIICIN II
“Low-grade dysplasia”
CIN I
Cytology of CIN (Pap smear)
Adapted from: Robbins’ Pathologic Basis of Disease, 7th Ed., Elsevier ©
Normal

196. 10/10/2018 17:49
Pap-test
Normal Dysplasia Invasive ca.

197. 10/10/2018 17:49
Progressione nello sviluppo del carcinoma
della esocervice uterina

198. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA APPARATO
RESPIRATORIO

199. 10/10/2018 17:49
Organi dell’apparato respiratorio
Cavità nasali
Faringe
Laringe
Trachea
Bronchi
Bronchioli
Polmone
sinistro
Polmone
destro
Diaframma
Albero
respiratorio
3 lobi
2 lobi
POLMONI
coperti da pleure

200. 10/10/2018 17:49
EPITELIO RESPIRATORIO
Epitelio che tappezza trachea e bronchi:
◼ pseudostratificato (tutte le cellule toccano
la membrana basale)
◼ ciliato
◼ contiene cellule caliciformi
mucosecernenti

201. 10/10/2018 17:49
Ciliary escalator
Trapped
particles
in mucus
Cilia
Goblet cells
Ciliated cells
Computer-enhanced
Modified from: Tortora GJ et al. Microbiology; 12th Ed., Pearson 2016: p. 444 ©
EPITELIO PSEUDOSTRATIFICATO

202. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA APPARATO RESPIRATORIO
esame cellule di sfaldamento provenienti dai
diversi tratti dell’apparato respiratorio:
◼ Bocca
◼ Faringe
◼ Laringe
◼ Trachea
◼ Bronchi
◼ Bronchioli
◼ Alveoli

203. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA APPARATO
RESPIRATORIO
Modalità di esame
◼ Espettorato
◼ Broncoaspirato
◼ Brushing (spazzolamento)
broncoscopia

204. 10/10/2018 17:49
Methods for Cytological
Sampling of the Lung
•Sputum
➢Spontaneously expectorated
➢Induced
•Bronchoscopic procedures
➢Bronchial brushing
➢Bronchial washing
➢Bronchiolo-Alveolar Lavage (BAL)
•Fine needle aspiration (FNA), including Endobronchial
Ultrasound (EBUS) guided FNA (EBUS/EUS-FNA)

205. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA APPARATO RESPIRATORIO
POSSIBILI QUADRI DIAGNOSTICI
•PROCESSI INFIAMMATORI
•PROCESSI PRE-NEOPLASTICI
(DISPLASIA)
•PROCESSI NEOPLASTICI

206. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA
ESPETTORATO
Espettorato: materiale proveniente
dall’apparato respiratorio emesso
spontaneamente dal paziente
In condizioni di normalità contiene:
◼ Cellule cavo orale
◼ Cellule ciliate
◼ Macrofagi
◼ Linfociti
◼ Muco

207. 10/10/2018 17:49
Cellule
ciliate
normali
Corpo
estraneo
Infezione
virale
Materiale
schiumoso
(origine
alveolare)
Carcinoma
squamoso
adenocarcinoma
CMV
Brushing bronchiale

208. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA DEI VERSAMENTI

209. 10/10/2018 17:49
VERSAMENTI SIEROSIVERSAMENTI SIEROSI
CITOLOGIA DEI VERSAMENTICITOLOGIA DEI VERSAMENTI
Riscontro ed identificazione morfologicaRiscontro ed identificazione morfologica
delle cellule presenti nei liquididelle cellule presenti nei liquidi
sviluppatisi in condizioni patologichesviluppatisi in condizioni patologiche
nelle principalinelle principali cavita’cavita’ sierose del corpo:sierose del corpo:
1) pleurica1) pleurica
2)2) pericardicapericardica
3) peritoneale3) peritoneale

210. 10/10/2018 17:49
Body Cavities: Lateral View
◼ Thoracic Cavity
Lined by serous
membranes
◼ Abdominopelvic
Cavity
– Abdominal Cavity
– Pelvic Cavity

211. 10/10/2018 17:49
Thoracic Cavity
(Anterior View)
◼Mediastinum: a
potential space that
contains the heart,
great vessels,
trachea, esophagus,
etc
◼Pericardial
Cavity: contains
the heart
◼Pleural Cavities:
contain the lungs

212. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA DEI VERSAMENTI
Metodica:
1-Agoaspirazione nella cavità
2-Striscio su vetrino diretto o dopo
centrifugazione

213. 10/10/2018 17:49
VERSAMENTI SIEROSIVERSAMENTI SIEROSI
La patologia delle sierose diLa patologia delle sierose di
interesse citologico comprendeinteresse citologico comprende
•• 1) Alterazioni qualitative del liquido1) Alterazioni qualitative del liquido
•• 2) Infiammazioni2) Infiammazioni
•• 3) Neoplasie3) Neoplasie

214. 10/10/2018 17:49
Citologico
liquido pleurico
da mesotelioma*
*neoplasia che origina dal mesotelio (strato di cellule che riveste le cavità sierose
del corpo) - correlato all’uso industriale dell’amianto

215. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA APPARATO URINARIO

216. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA URINARIACITOLOGIA URINARIA
CAMPIONAMENTO DELLE URINECAMPIONAMENTO DELLE URINE
1) Urine emesse spontaneamente1) Urine emesse spontaneamente
2) Urine prelevate con catetere2) Urine prelevate con catetere
3) Lavaggio3) Lavaggio vescicalevescicale (10 ml sol. fisiologica(10 ml sol. fisiologica
aspirati in cistoscopia)aspirati in cistoscopia)

217. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA URINARIACITOLOGIA URINARIA
LL’’esame citologico del sedimento urinarioesame citologico del sedimento urinario
rappresenta la base per la diagnostica dellerappresenta la base per la diagnostica delle
neoplasie dellneoplasie dell’’apparato urinarioapparato urinario
•• Le cellule riscontrabili, in condizioni diLe cellule riscontrabili, in condizioni di
normalitanormalita’’, sono rappresentate da:, sono rappresentate da:
•• 1) Cellule dell1) Cellule dell’’epitelio di transizioneepitelio di transizione
•• 2) Cellule squamose uretrali2) Cellule squamose uretrali
•• 3) Cellule dell3) Cellule dell’’epitelio renale (rare)epitelio renale (rare)
•• 4) Istiociti4) Istiociti

218. 10/10/2018 17:49
CITOLOGIA APPARATO URINARIO
POSSIBILI QUADRI DIAGNOSTICI
•PROCESSI INFIAMMATORI
•PROCESSI PRE-NEOPLASTICI
(DISPLASIA)
•PROCESSI NEOPLASTICI

219. 10/10/2018 17:49
UROTHELIAL
CARCINOMA
HIGH GRADE
Adapted from: Mariuzzi GM. Anatomia Patologica, Vol. II, Piccin ©

220. 10/10/2018 17:49
Reperto citologico in un carcinoma della vescica

221. 10/10/2018 17:49
LIGHT MICROSCOPY
Outline

222. 10/10/2018 17:49
Light compound microscope
Adapted from: Tortora GJ, et al. Microbiology, 12th Ed, Pearson 2016: p. 53 ©
or substage light
Revolving piece

223. 10/10/2018 17:49
Tortora GJ, et al. Microbiology: An Introduction, 12th Edition, Pearson 2016: p. 56 ©
WORKING DISTANCE

224. 10/10/2018 17:49
Parts of the Microscope
Parts Functions
Eyepiece
To observe specimen. Contains two or more lenses. The most common magnification for the
eyepiece is 10X. There are also 2x and 5x. An eye piece is a removable, can be interchanged for
different magnification.
Objective Lenses
More than one objective lenses. These are the primary lenses of a compound microscope and can
have magnification of 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x and 100x.
Stage
The platform below the objective lens on which the object to be viewed is placed. A hole in the
stage allows light beam to pass and illuminate the specimen.
Stage Clips
There are two stage clips one on each side of the stage. Once the slide containing the specimen is
placed on the stage, the stage clips are used to hold the slide in place.
Diaphragm
It is located on the lower surface of the stage. It is used to control the amount of light that reaches
the specimen through the hole in the stage.
Illuminator
Simple compound microscopes have a mirror that can be moved to adjust the amount of light that
can be focused on the specimen. However, some advanced types of compound microscopes have
their own light source.
The Adjustments
2 adjustment knobs: fine adjustment & coarse adjustment knob; refine the focus of the lenses. The
coarse adjustment knob helps in improving the focus of the low powers whereas the fine adjustment
knob helps in adjusting the focus of the lenses with higher magnification.

225. 10/10/2018 17:49
Microscopy and units
Adapted from: Tortora GJ, et al. Microbiology, 12th Ed, Pearson 2016: p. 55 ©

226. 10/10/2018 17:49
Units of Measurement
◼ Microorganisms are measured in micrometers
(μm) and nanometers (nm)
◼ ​1 µm = 10-6 m = 10-3 mm
◼ ​​1 nm = 10-9 m = 10-6 mm
◼ ​1000 nm = 1 µm
◼ ​0.001 µm = 1 nm
Tortora GJ, Funk BR, Case CL. Microbiology: An Introduction, 12th Edition, 2016, Pearson

227. 10/10/2018 17:49
MICROSCOPIO OTTICO
Adapted from: http://www.treccani.it/enciclopedia/microscopio/

228. 10/10/2018 17:49
OCULAR LENSES
EYEPIECE
OBJECTIVE LENSES
10 x
4 x
10 x
40 x
100 x
immersion
oil
IRIS DIAPHRAGM
WORKING DISTANCE
STAGE
Stage clip/mechanical
ARM
BASE
ILLUMINATOR/
SUBSTAGE LIGHT
CONDENSER
REVOLVING
NOSEPIECE

229. 10/10/2018 17:49
Total magnification = magnification of eyepiece x magnification of objective lens
Magnification
Your microscope has 3 magnifications:
Scanning, Low and High. Each objective will have written the
magnification. In addition to this, the ocular lens (eyepiece) has a
magnification.
The total magnification is the ocular x objective.
Objective Lenses
Magnification
Ocular Lens
Magnification
Total Magnification
Objective x Ocular Lenses
Scanning 4x 10x 40x
Low Power 10x 10x 100x
High Power 40x 10x 400x
Oil immersion 100x 10x 1000x

230. 10/10/2018 17:49
Light microscope
brightfield
darkfield
phase contrast
differential interference contrast (DIC)
fluorescence
Confocal microscope
Two-photon microscope
Scanning acoustic microscope
Electron microscope
transmission
scanning
Scanned probe microscope
scanning tunneling
atomic force
MICROSCOPE TYPES

231. 10/10/2018 17:49
Special Techniques

232. 10/10/2018 17:49
PER EFFETTUARE UNA DIAGNOSI
nella maggior parte dei casi è
sufficiente al patologo l’osservazione
al microscopio di sezioni istologiche di
tessuti o di preparati citologici colorati
con colorazioni routinarie

233. 10/10/2018 17:49
PER EFFETTUARE UNA DIAGNOSI
in altri casi è necessario applicare
metodologie più sofisticate:
◼ colorazioni speciali
◼ indagini immunoistochimiche
◼ indagini di biologia molecolare
◼ tecniche di microscopia elettronica

234. 10/10/2018 17:49
Immunohistochemistry
Outline234

235. 10/10/2018 17:49
Immunohistochemistry
◼ Antigen antibody
reaction
◼ Ab Tagged with
marker
– Simple Dye
– Enzyme
(peroxidase)
– Fluorescent Dye
– Radioactive Dye
Marker
Sec. Antibody
Pri. Antibody
Tissue Antigen

236. 10/10/2018 17:49
236
Immunohistochemical stains
Stain
Vimentin
Desmin
Cytokeratin
GFAP
Glial Fibrillary Acid protein
Neurofilaments
Cell type
Connective tissue
Muscle
Epithelial cells
Neuroglia
Neurons
Adapted from: Le T. et al. First Aid USMLE Step 1, 2010 McGrawHill ©

237. 10/10/2018 17:49
Melanoma +ve for HMB-45

238. 10/10/2018 17:49
B cell Lymphoma – CD20

239. 10/10/2018 17:49
Breast Cancer
Estrogen Receptor Antigen
Tamoxifen Sensitive

240. 10/10/2018 17:49
Electron Microscopy
Outline240

241. 10/10/2018 17:49
Electron Microscopy
◆ Electron beam instead of
light.
◆ Magnified images are
typically from 1000X to
50,000X (Light
microscope is 10-1000x).
◆ Gluteraldehyde fixative.
◆ Glass knives.
◆ Specimen is mounted on
a metal grid.

242. 10/10/2018 17:49
LIGHT MICROSCOPE vs ELECTRON MICROSCOPE
© 2007 Paul Billiet ODWS
FEATURE LIGHT MICROSCOPE ELECTRON MICROSCOPE
Electromagnetic
spectrum used
Visible light
390nm (red) – 760nm
Electrons
app. 4nm
Maximum
resolving power
app. 200nm or
0.2micron
0.14nm
Fine detail
Maximum
magnification
x1000 – x1500 X 5,00,000
Radiation
source
Tungsten or quartz
halogen lamp
High voltage (50kV)
tungsten filament
Lenses Glass Magnets
Interior Air-filled Vacuum
Focus Lens is movable Rigidly fixed, adjust
lens currents

243. 10/10/2018 17:49
LIGHT MICROSCOPE vs ELECTRON MICROSCOPE
© 2007 Paul Billiet ODWS
FEATURE
LIGHT MICROSCOPE ELECTRON
MICROSCOPE
Focussing scree n Human eye (retina),
photographic film
Fluorescent screen,
photographic film
Fixation formaldehyde Glutaraldehyde,OsO4
Embedding Wax Resin
Sectioning Microtome
slices - 20 000nm
Whole cells visible
Ultramicrotome
Slices - 50nm
Parts of cells visible
Stains Water soluble dyes Heavy metals
Support Glass slide Copper grid

244. 10/10/2018 17:49
Types of Electron Microscope
1.Transmission
electron
microscopy
(TEM)
2.Scanning
electron
microscopy
(SEM)
244

245. 10/10/2018 17:49
SEM

246. 10/10/2018 17:49
- - light 8CI urce
heated filsme nt
v (source of electronss) v
- - ooj3ctive lens
specimen
IMAGE ON
VIE'W'ING
SCREEN
detec'Cir
IMAGE VI E'W'ED
DIRECTLY
IMAGE ON
FLUORESCENT
SCREEN
LIGHT MICROSCOPE
TRANSMISSION
ELECTRON MICROSCOPE
SCANNING
ELECTRON MICROSCOPE

247. 10/10/2018 17:49
Normal cell under EM

248. 10/10/2018 17:49
Electron
Microscopy
Ultrastructural
diagnosis of
non tumor
sample
Ultrastructure
diagnosis of
tumor sample

249. 10/10/2018 17:49
• Diseases of kidney
• Metabolic storage diseases
• Respiratory tract biopsies
• Skeletal muscle diseases
• Infectious agents
• Cutaneous diseases
• Peripheral nerve biopsies
• Epithelial tumors
• Mesothelioma
• Melanoma
• Hematopoietic and
lymphopoietic tumors
• Soft-tissue tumors
• Central nervous system
tumors
• Small round cell tumors
Non tumor biopsies Tumor diagnosis

250. 10/10/2018 17:49
Minimal change Glomerulonephritis
Extensive foot process effacement

251. 10/10/2018 17:49
Post streptococcal glomerulonephritis
Subepithelial humps of IgG & C 3

252. 10/10/2018 17:49
Esami di biologia molecolare
mettono in evidenza le componenti
molecolari delle cellule (acidi nucleici
e proteine) ai fini diagnostici
252
Outline

253. 10/10/2018 17:49
BIOLOGIA MOLECOLARE
Dogma centrale biologia molecolare:
l’informazione contenuta nel DNA passa
all’RNA e viene concretizzata nella
proteina
Crick, 1957

254. 10/10/2018 17:49
◼ Central dogma describes how DNA is transcribed
to messenger RNA, which, in turn, is translated into
proteins that carry vital cellular functions
GENETICS
CENTRAL DOGMA
Adapted from: Pearson Education, Inc. © 2016

255. 10/10/2018 17:49
Esami di biologia molecolare
in Anatomia Patologica
utilizzati per:
◼ valutare il profilo genetico di un tumore (molto
importante ai fini diagnostici e prognostici)
◼ diagnosticare la presenza del DNA di un batterio (es.
micobatterio tubercolare) o di un virus (es.virus del
papilloma)
◼ diagnosticare la presenza dell’RNA di un virus (es. virus
HIV dell’AIDS)
◼ studiare la costituzione genetica di un individuo (utile
per chiarire determinati quadri patologici

256. 10/10/2018 17:49
BIOTECHNOLOGY TOOLS
Restriction Enzymes
Polymerase Chain Reaction (PCR) copies copies copies
DNA probe unknown DNA
Southern blotting—DNA
Northern blotting –mRNA
Western blotting– proteins
Eastern blotting –lipids
Monoclonal antibody
ELISA testing
Metabolic Reactions-visual
DNA fingerprinting—id DNA
Shotgun sequencing—id short pieces of DNA
Proteomics—large scale study of proteins
Nanotechnology

257. 10/10/2018 17:49
RESTRICTION ENZYMES
◼ Special class of DNA-cutting enzymes that exist in many
bacteria
◼ First isolated in 1970, observed earlier in batteriophages
that were destroyed by restriction enzymes
◼ Cut specific sequences of DNA
◼ Destroy bacteriophage DNA in bacterial cells
◼ Methylated cytosines in bacteria protect their own DNA
from digestion
◼ Create blunt ends or staggered cuts known as sticky ends
◼ Purified form of these enzymes are used in labs.
BIOTECHNOLOGY TOOLS
Adapted from: Tortora GJ et al. Microbiology, 12th Ed., Pearson 2016: p. 241 ©

258. 10/10/2018 17:49
Adapted from: Tortora GJ et al. Microbiology, 12th Ed, Pearson 2016: p. 242 ©
RESTRICTION ENZYME: MAKING rDNA

259. 10/10/2018 17:49
Polymerase Chain Reaction (PCR)
◼ Process of increasing small quantities (amplifying)
of DNA for analysis
◼ Used for diagnostic tests for genetic diseases and
detecting pathogens
◼ Reverse-transcription PCR uses mRNA as template
Pearson Education, Inc. © 2016

260. 10/10/2018 17:49
Polymerase Chain Reaction amplifies a
known segment of DNA between two
primers.
DNA identification
and sequence extraction
Polymerase Chain Reaction
Cont……

261. 10/10/2018 17:49
1) Denaturation at 94°C:
During the denaturation, the
double strand melts open to single
stranded DNA, all enzymatic
reactions halt.
2) Annealing at 54°C:
The primers are freely moving due
to Brownian motion. Ionic bonds
are constantly formed and broken
between the single stranded primer
and the single stranded template.
During coding, excess premade
DNA primers anneal to a specific
sequence on each strand to be
amplified.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
3) Extension at 72°C:
Heat stable DNA polymerase
replicates the DNA sequence
following each primer.
PCR: STEPSCont…

262. 10/10/2018 17:49
DNA amplification
Polymerase Chain Reaction
Cont…

263. 10/10/2018 17:49
With PCR technique a short sequence of DNA
can be amplified by more than 106 times
within a few hours.
Polymerase Chain ReactionCont…

264. 10/10/2018 17:49
What is blotting?
Blots are techniques for transferring
DNA , RNA, PROTEINS, LIPIDS onto a
carrier so they can be separated, and
follows the use of a gel
electrophoresis.
The Southern blot is used for transferring
DNA, the Northern blot for RNA, the
Western blot for PROTEIN, Eastern blot
for LIPIDS.

265. 10/10/2018 17:49
Southern blot
(DNA)
Northern blot
(RNA)
Western blot
(Protein)
Eastern blot
(lipid)
TYPES OF BLOTTING TECHNIQUESCont…

266. 10/10/2018 17:49
Creating the Sandwich
The sandwich consists of :
filter paper
Nitrocellulose membrane,
gel matrix
another piece
of filter paper
Cont……

267. 10/10/2018 17:49
◼ Professor Edwin Southern,
Professor of Biochemistry,
UK
◼ Developed this method in
1975.
Southern Blotting

268. 10/10/2018 17:49
Cont…Southern & Northern Blot: Techniques

269. 10/10/2018 17:49
1. In the Figure below, line "c" points to the
microscope's__________________
CORRECT.
A) illuminator
B) condenser
C) ocular lens
D) objective lens
What is your diagnosis?
Outline